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国思路：常见的 3 3种中医药研究课题思路，您会选择哪种？编者按：九明确提出九明确提出“坚持中西医并重，传承发展中医药事业”。中医药相关的项成为近年来国然资助的重点向。中医学资助的范围主要包括四部分，中医基础理论、中医临床、针灸推拿和民族医学。近年来国然基较关注中医基础理论、励学科交叉研究，及在中医药理论指导下，运多学科理念、法、技术与段进跨学科协作研究。常见的中医药课题思路类型如下：1.尚未明确中药活性成分的初步研究思路：XXXX药（单药或剂）在 XXXX疾病的作机制（疾病模型 中药疗效 组学机理）2.中药提取物或活性成分的机制研究思路：XXXX药（单药或剂）防通过 XXXX通路（调控轴）对 XXXX疾病的作机制（动物、细胞、分平）3.中医理论的现代化论证研究思路:中医XXXX证侯的物质基础研究（症候发的基因表达调控规律及细胞分学机制、靶基因等；中药与机体的交互规律）（多平研究：机体、器官组织平、清药理、细胞、分平）献推荐今天解读的献是来州中医药学第临床学院中西医结合学科肿瘤中西医结合研究中于2021年830发表在Cell Communication and SignalingCell Communication and Signaling（IF=5.7IF=5.7）上题为“Aiduqingformula inhibits breast cancer metastasis by suppressingTAM/CXCL1-induced Tregdifferentiation and infiltration”的章，即爱毒清通过抑制TAM/CXCL1诱导的Treg分化和浸润抑制乳腺癌转移。研究概述乳腺癌转移是其引起患者死亡的主要原因。中医药因其在延长存期和调节免疫平衡的优势在亚洲国家受到重视。然，潜在的分机制在很程度上仍然未知。这项研究不仅为ADQ抑制乳腺癌转移提供了临床证据，还为TAM/CXCL1/NF-B/FOXP3信号有望作为Treg调节和乳腺癌免疫治疗的新靶点提供了思路。分机制图研究内容1 1、ADQADQ抑制乳腺癌的肺转移并重塑其免疫抑制性TMETME根据与之间的等效剂量转换，通过服强饲法以0.7g/kg/天或1.4g/kg/天的剂量施ADQ（图1a）。ADQ显著延迟了4T1-Luc异种移植物的长，对死亡率或体重明显影响。（图1b、c）。此外，ADQ显著抑制了乳腺癌的肺转移，表现为肺转移病灶积和数量的减少（图1d）。ADQ显著提了TME内TIL的浸润平（图1e）。ADQ处理显著增加了细胞毒性CD8 T细胞的浸润，同时减少了TME内免疫抑制性CD4/CD25/FOXP3 Treg的浸润（图1f）。ADQ还显著抑制了CD4/CD25-/CD45RA 初始CD4 T细胞的浸润（图1f）。图12 2、ADQADQ在体外和体内抑制 TAMTAM的M2M2表型极化和 CXCL1CXCL1分泌ADQ处理（0.7或1.4g/kg/天）显著降低了TME内TAM的浸润和M2表型极化（图2a）。免疫荧光测定表明，ADQ显著降低了乳腺肿瘤组织中CD206（M2表型标志物）和CXCL1的表达平，表明ADQ能够显著抑制TAM浸润并减弱体内CXCL1表达（图2b）。通过重组IL-4和IL-13诱导将Raw264.7巨噬细胞转化为M2样巨噬细胞（图2c）然后进ADQ处理。当20-200g/mlADQ处理48时时，TAM增殖被显著抑制，但在12或24时时不显著（图2d）。此外，ADQ处理24时以浓度依赖性式显著抑制Raw264.7衍的TAM的M2表型极化（图2e，f）。蛋质印迹、ELISA和qPCR测定进步证实ADQ抑制了TAM中CXCL1蛋的表达、分泌以及mRNA转录（图2g-i）。最后，双荧光素酶报告基因测定显ADQ抑制TAM中的CXCL1启动活性（图2j）。图23 3、TAM/CXCL1TAM/CXCL1信号促进 TregsTregs的分化和免疫抑制功能通过敲低Raw264.7衍的TAM中的CXCL1表达来成TAM/shCXCL1细胞（图3a）。同时，通过荧光激活细胞分选技术从脾脏中分选初始CD4 T细胞（图3b）。TAM/CXCL1信号对初始CD4 T细胞增殖没有影响（图3c）。然，TAMs的条件培养基(CM)能够显著诱导初始CD4 T细胞分化为Tregs，TAMs中的CXCL1敲低(TAM/shCXCL1-CM)部分消除了这种作（图3d）。趋化性分析表明TAM-CM促进了初始CD4 T细胞的趋化性，TAM中的CXCL1敲低部分消除了这种作（图3e）。从脾脏中分选Tregs和效应CD8 T细胞（图3f），TAM/CXCL1信号预处理Tregs不影响共培养CD8 T细胞的增殖活性，但显著诱导其凋亡和溶细胞功能失活，导致CD8 T细胞对癌细胞的杀伤作降低（图3g，h）。图34 4、CXCL1CXCL1招募外周初始 CD4 TCD4 T细胞并通过激活 NF-NF-B/FOXP3B/FOXP3通路诱导其分化为 TregsTregsCD62L 初始T细胞主要位于乳腺肿瘤组织内的管周围，Tregs分布在距离管较远的地（图4a）。同时，从乳腺肿瘤中筛选出的90%以上的初始CD4 T细胞表达CXCR2，于初始CD4 T细胞（图4b）。CXCL1的梯度浓度（10-30ng/ml）显著增加了初始CD4 T细胞的趋化效应，使2MSB225002（CXCR2抑制剂）阻断CXCL1/CXCR2则可部分消除这种效应（图4c）。这些结果表明CXCL1可能会将外周CXCR2 初始CD4 T细胞募集到乳腺肿瘤中。胚胎肾293T细胞蛋质印迹分析发现CXCL1处理通过激活FOXP3基因的启动活性（图4g）显著诱导FOXP3的蛋质（图4d，e）和mRNA表达（图4f）。CXCL1能够诱导p65（NF-b亚基）表达和核易位（图4h，i），阻断CXCL1/CXCR2可以部分消除这种影响。CHIP-PCR测定证实CXCL1促进NF-b亚基p65与FOXP3启动区域的结合，10M Bay11-7082（NF-b抑制剂）处理部分消除了这种作（图4j）。这些结果表明CXCL1可以诱导p65表达和核易位，从在转录上提FOXP3表达并促进Treg分化。图45 5、ADQADQ在体外抑制 TAM/CXCL1TAM/CXCL1诱导的 TregsTregs分化和免疫抑制功能浓度范围为20200ug/ml的ADQ仅对初始CD4 T细胞增殖表现出中等抑制作（图5a）。然，ADQ显著抑制TAM/CXCL1诱导的初始CD4 T细胞分化为Tregs（图5b）。机理研究表明，ADQ显著抑制了293T细胞（图5c）和初始CD4 T细胞（图5d）中TAM/CXCL1诱导的FOXP3表达。此外，ADQ预处理TAM部分逆转了TAM/CXCL1诱导的Tregs对CD8 T细胞的免疫抑制功能，导致CD8 T细胞的凋亡减少和细胞毒功能增加（图5e-f）。图56 6、ADQADQ通过抑制 TAM/CXCL1/TregTAM/CXCL1/Treg通路抑制乳腺癌免疫逃逸和肺转移ADQ治疗还显著延迟了TAM与4T1-Luc细胞共同注射诱导的乳腺肿瘤长，将CXCL1过表达的TAM与4T1-Luc细胞共同注射则消除了这种影响（图6a-c）。体内成像测定和HE染测定均表明ADQ显著抑制了乳腺癌肺转移，这现象被与4T1-Luc细胞共同注射的TAM中的CXCL1过表达消除（图6d）。就免疫抑制性TME，ADQ通过抑制TAM/CXCL1活性显著提了TME内TILs的浸润（图6e）并诱导癌细胞凋亡（图6f）。此外，ADQ给药显著降低了Tregs和初始CD4 T细胞的浸润平，这与TAM/CXCL1活性密切相关（图6g）。图620212021年度国然医学部国 3232科研热点的中标数统计如下：20222022热点免疫调控管成、重构线粒体外泌体miRNA细胞lncRNA细胞噬肠道菌群circRNAm6A、m5C、m7G铁死亡转录调控20212021年医学20222022热点部总中标数852852531531485485430430413413371371371371358358312312287287270270257257232232细胞焦亡20212021年医学部总中标数118118代谢重编程 118118单细胞测序 105105DNA甲基化 9797组蛋修饰 8080内质7676炎性体7676中性粒细胞6767诱捕糖酵解5555氧化应激4646类器官超级增强精氨酸甲基化相分离乳酸化修饰迁移体464625252525212121214 4缺氧、低氧 211211泛素化186186酰化135135