桑葚天然色素的提取方法与特性的初步研究.doc

关于桑葚天然色素的提取和特性的初步研究

摘要：由于桑树叶子和果实的实用价值，现在桑树已经被广泛的种植。在桑树果实里面，色素是一种天然的着色剂同时也有很大的潜在商业价值。本文致力于研究桑葚色素在一定的阳光、温度、氧气等条件下的提取和其稳定性。色素提取的溶剂是比率为1：10的样本溶剂。其结果如下：最佳的提取条件被发现是：提取溶剂使用含量为95%的乙醇和 0·1% HC l (1∶1, 比率)混合溶剂，温度为70摄氏度，提取时间为两小时。提取出色素的最大吸收波长是516纳米。桑葚色素溶剂在光照下三周后，放在无光和厌氧条件环境中是非常不稳定的，色素损失比例可以达到19.55%。当桑葚色素被放在80摄氏度的温度下3小时候，色素损失比例能达到20.90%。但是它在相应的低温下是非常稳定的。吸光率随着过氧化氢或亚硫酸纳的增加而减小，同时色素损失增加。吸光率也随着时间的增加而减少。
关键词：桑葚天然色素提取、稳定性
桑树在人们普遍的观念里面，被大面积的种植主要是应为它的叶子是蚕的必备食物。桑树在中国的种类在全世界中都占有绝对的优势，广泛的分布在整个中国，主要分布在珠江流域的太湖地区，其它地区也有分布例如黄河流域、四川盆地、高原地区、新疆地区等等。在中国大约有3000种桑树资源，其中有超过60种可以被作为食用的水果。桑树果实的颜色会从绿色逐渐变为紫黑色，完全成熟时候的颜色为红色。部分从中亚引入的品种果实颜色是白色；桑树在很早以前就被人们作为一种药用资源来使用，它的根、树皮、叶子均可以作为草药来使用。在中医中药领域，桑树的根和树皮一直被作为一味中药来使用，可以抗胆碱，利尿、化痰。桑树的叶子富含叶酸，可以有效的抵抗高血压，同时富含铁、铝可以起到解酒的功效。再者它还被发现含有1-脱氧野尻霉素，对降低人体血糖很有帮助，有利于糖尿病患者，这就是为什么近来桑葚被人们作为一种健康食物来食用。
桑树果实富含糖、有机酸、氨基酸、维生素、微量营养元素和其它成分。在中国桑树果实仍然作为一种中药的药用原料来使用。桑树果实被直接食用或者榨成果汁。果酱和果酒工艺也是相当发达。如今对于桑葚营养成分和栽培技术的研究正在被更广泛的实施。一些研究人员致力于桑葚组成成分的研究。近来一些研究专注于提取和净化桑葚红色素。就在前一段时间，桑葚果实被科研人员发现有一种氧化特性。
从另一方面来讲，关于人工合成色素的安全问题近来来引起了人们的争论。立法机构和食用人工合成色素的消费者都对天然色素产生极大的兴趣。桑葚色素就是一种天然色素。然而这里有一个问题就是很多的桑葚果实都被丢弃了，当桑树被用来为蚕收集桑叶作为食物的时候，同时许多其它品种的果实也没有被有效的利用。因此加强关于桑葚色素的研究提升色素产品的工业附加值变的十分必要。这个研究主要目标就是研究桑葚天然色素的提取和色素的一些典型特性。
1 原料和方法
1.1 原料
中国浙江省萧山县的成熟桑葚果实样本。抽样结束后，果实必须马上带到实验室，放入塑料袋中并储藏在温度为4摄氏度以下的冰箱中。样品尺寸为1-2.5cm长颜色为紫色。
1.2 试剂
95%的乙醇、HCL 30% ，过氧化氢，亚硫酸钠，其中亚硫酸根和氢氧化物用于分析特性（抗氧化的稳定性），药剂从上海化学试剂厂采购。蒸馏水在整个试验中都要使用。
1.3 样本准备
桑葚果实在流动水龙头下冲洗干净，称出重量，立即做进一步的处理。样本首先被混合均匀，把桑葚果实捣碎然后用一张DS-1棉质（中国上海）过滤20秒钟。然后把它们转移到一个250ml高脚杯中，之后会加入提取溶液。
1.4 天然色素的提取
准备好混合均匀的样本10克，加入到一个250ml的高脚杯中然后立即加入100ml的提取溶液。提取溶液与样本溶液的添加比例为1：10，接下来用一根玻璃棒每5分钟搅拌一次溶液，确保提取溶液与样本混合均匀。提取研究的三个因素分别是提取溶液、温度、提取时间。在提取溶液中，水、95%的乙醇，混合了95%的乙醇和0.1%的HCL被用来作为提取溶液。添加提取剂与样本质量的比例为1：10，提取1小时以后用布拉格22离心机（4000转每分钟），进行分离。之后离心机将及时分离出色素溶液，调整PH值为3，然后用WFZ UV-2102 UV-Vis分光光度计测量波普范围。
1.5 稳定性测试
以确定的提取条件为基础的研究，桑葚色素提取溶液与样本溶液比为1：10；95%的乙醇与0.1%的HCL混合（比率为1：1）在70摄氏度的温度下，用离心机（4000转每分钟）分离后将PH值调整为3.
提取后的桑葚色素溶液使用WFZ UV-2102 UV-Vis风光光度计来测试其稳定性。在稳定性测试研究中影响色素稳定的灯光、温度、过氧化氢、亚硫酸钠我们全部都给与了研究。在每种条件下，桑葚色素都被存储在一个玻璃瓶中。
一些色素样本被直接放在保持室温的太阳光下21天，以便我们来观测阳光对色素的影响。一些样本被分别储存在60摄氏度和80摄氏度的浴缸内，以便我们来观测温度对色素的影响。
对于过氧化氢测试，连续测试用的不同浓度的过氧化氢溶液需要提前准备好，不同浓度的过氧化氢溶液中加入相同天然色素溶液，比例全部为10：1，过氧化氢溶液的浓度分别配置0；0.02；0.04；0.06；0.08；0.10；将桑葚色素样本加入溶液后均放置5小时。不同的样本在1小时和5小时后可以尝试加倍处理。
对于亚硫酸钠测试，连续测试用的不同浓度的亚硫酸钠溶液需要提前准备好，不同浓度的亚硫酸钠溶液中加入相同天然色素溶液，比例全部为10：1，亚硫酸钠溶液的浓度分别配置0；0.04；0.06；0.08；0.10；0.12；将桑葚色素样本加入溶液后均放置5小时。不同的样本在1小时和5小时后可以尝试加倍处理。
用UV-Vis分光光度计在516纳米级别来测试吸光率，并且转换为色素损失百分比，或者色素损失率，在不同的处理溶液中进行精确比对。
损失率=天然色素溶液在处理后的OD值/天然色素在处理前的OD值×100%.
1.6 科学分析
所有数据均获得均要重复操作三次，这些数据可以存在标准偏差。然后用大学中的统计学原理来分析这其中的不同。多重比对方法通过SPSS软件算法来实现。其中概率值小于0.05被认为是有意思的结果。
2. 结果和讨论
2.1 桑葚色素吸收光谱在不同提取溶液中的比对。
不同的提取溶液拿来做比对是为了选出最为有效的提取溶液。在该项研究中，水、95%的乙醇、95%的乙醇和0.1%的HCL（盐酸）混合溶液被用来作为提取溶液。吸光率的测量范围是从400纳米波长到760纳米波长。桑葚色素的测试表明其最高的吸光率是在516纳米波长，通过试验中不同的提取溶液我们来对用到的这三种溶液做出考核；95%的乙醇和0.1%的HCL（盐酸）混合溶液显示出了最大的吸光率。
三种溶液的吸光率顺序如下：
95%的乙醇和0.1%的HCL（盐酸）混合溶液> H2O >95%的乙醇。可能的原因是0.1%的HCL有助于破坏色素细胞的细胞壁，让色素更容易的融入溶液当中。表格1进一步说明不同比例的不同溶剂对提取效率有着显著的影响。它表明OD值随着95%的乙醇和0.1%的HCL（盐酸）混合溶液而改变，提取效率最好的溶液比例是95%的乙醇与0.1%的HCL比例为1：1.一些先前的研究表明色素是以分子的形式存在，对于分子来说在不同的PH值下会有不同的颜色。而本次研究的所有测试均是在PH值调整为3的状态下进行的。

表1　95%乙醇与0.1%HCl不同配比提取桑椹色素的吸收值比较
2.2 温度对溶液吸收效率的影响
温度对溶液吸收效率的影响显示在表格2当中。样本的吸光率在逐渐的增加当温度由40摄氏度上升为60摄氏度的时候；在这之后一个急剧的上升当样本温度为70摄氏度的时候。当温度从70摄氏度到90摄氏度的时候呈现出一个较为稳定的态势。这表明在提取桑葚色素的过程中温度起到了决定性的作用，当温度增加的时候，吸光率也随之增大。它显示出如果温度越高，则色素提取效率越好。但是溶液也不能过热，因为在高温条件下（例如温度>70摄氏度）会导致乙醇的蒸发，从而改变溶液的浓度，提取效率会受到影响。研究表明并不是越高的温度越好，最合适的温度应该选择70摄氏度。
2.3 吸收值受提取时间的影响
样本温度在70摄氏度，每0.5小时取值一次的吸光率如图标3所示。其结果显示OD值在测试中主要分了两个阶段。OD值的主要增长发生在前两个小时，从两小时候其值开始呈线性下降。因此吸光率最好的时间是前两小时，提取效率最高的时候是在第二个小时的时候。

2.4 天然色素收益研究
为了知道天然色素在工业化进程中的经济潜力，我们对天然色素的效益做了如上说述的研究，提取天然色素的步骤是使用95%乙醇与0.1%HCL（比例为1：1）的混合溶液作为提取溶液，在70摄氏度的温度下提取两个小时。使用R201旋转热交换机在减压状态下蒸发溶液中的液体。剩下的残余物为桑葚天然色素和一小部分溶液，样本的剩余部分被烘干后还能够提取出5.8%的有效益的天然色素。
2.5 光照对天然素色稳定性的影响
在之前提取条件的基础上，色素的提取溶液PH值要调整为3.然后将溶液存储在室温下的一个光照条件好的房间内。将样本暴露在光线下的时候要有规律的进行和分析。图标4的结果显示吸光率随着时间的增加而减小。3周后天然色素损失比例已经达到了19.55%，因此天然色素在光照条件下是不稳定的，并且光线可以分解天然色素如果桑葚色素被使用到食品工业当中。因此天然色素的存储和特性的保护是要首先被研究的对象。

2.6 温度对天热色素稳定性的影响
这两个天然色素样本均为PH值为3，分别放置在60摄氏度与80摄氏度的环境中。每0.5小时抽样一次并且吸光率是固定的。在图表5中反应出来随着时间的增加吸光率在降低并且色素损失比例在逐渐增大。此外在高温条件下色素损失比例是非常明显的。当色素溶液在80摄氏度的温度下放置3小时后，损失比例能达到20.90% 色素在80摄氏度的温度下的损失比例显然比60摄氏度的温度下高很多。研究表明桑葚天然色素在低温条件下是相对稳定的。

2.7 过氧化氢浓度对天然色素稳定性的影响
此外氧化物对天然色素的影响也多了相应的研究。不同浓度的过氧化氢被加入到天然色素溶液中。在1小时候和5小时候分别抽取样本。测量出的吸光率如图6所示。图表显示吸光率随着过氧化氢溶液浓度的增加而降低并且天然素色的损失率也在增加。吸光率同样也随着时间的增加而减少。在同样低浓度的时候，色素在1小时与5小时的损失率都比较小。当过氧化氢浓度逐渐增加的过程中，色素在1小时与5小时的损失比率也在增大。当过氧化氢溶液浓度为0.1%的时候，色素在1小时点的损失比率达到了19.3%在5小时点的损失比率达到了54.8% 两个抽样样本之间的差也有35.5%。桑葚天然色素在过氧化氢溶液浓度为0.1%时间点为5小时处损失率几乎超过了一半。因此天然色素在氧化条件下是不稳定的，但是在低浓度氧化条件下色素损失的改变是相对稳定的。

2.8 亚硫酸钠对天然色素稳定性的影响
不同浓度的亚硫酸钠溶液被分别加入到天然色素溶液中。吸光率在1小时和5小时后分别进行了测量。图表7显示了色素损失比率与亚硫酸钠溶液浓度之间的关系。表格显示出吸光率和色素损失率都随着亚硫酸钠溶液浓度的增加而减小。在同样低浓度的时候，色素在1小时与5小时的抽样损失率都比较小。当亚硫酸钠浓度逐渐增加的过程中，色素在1小时与5小时的损失比率也在增大。当亚硫酸钠溶液浓度为0.12%的时候，色素在1小时点的损失比率达到了19.3%在5小时点的损失比率达到了39% 两个抽样样本之间的差也有19.7%。
尽管有很多中含氧氧化剂和厌氧氧化剂，每种氧化剂都能够氧化或者减少天然色素的活性。过氧化氢和亚硫酸钠只不过是分别用来测定天然色素抗氧化性的两种对照材料而已。

3. 总结
论文主要描述了桑葚色素的不同提取条件包括不同的提取溶液、时间、温度；天然色素特有的部分特性，包括在光照、温度有氧和厌氧条件下的稳定性。试验结果显示最佳的色素提取条件是，配置1：1比率的提取溶液使用95%的乙醇和0.1%的HCL，然后用1：10的比例加入提取原料，放置在70摄氏度的温度下两个小时。在这样的条件下可以提取出5.8%的天然色素产品。天然色素的最大吸收波长为516纳米。天然色素溶液在光照条件下和厌氧并光照3周后都是不稳定的，色素的损失率能够达到19.55%。当天然色素放置在80摄氏度的温度下3小时后，色素损失率可以达到20.90% 但是它在低温条件下是相对稳定的。吸光率随着过氧化氢或者亚硫酸钠溶液浓度的增加而减小，色素损失率也逐渐增加。吸光率也随着时间的增加而降低。

References　(参考文献)
1　中国农业科学院蚕业研究所.中国桑树品种志(M).北京:农业出版社, 1993. 7-8
2　姚锡镇,廖森泰,肖更生.蚕业资源综合开发利用产业化探讨(J).蚕业科学, 2001, 27(4): 297-302
3　Nomura T. The chemistry and biosynthesis of is oprenylated falconoid from mordacious plants(J). PureApplChem, 1999, 71(6): 1115-1118
4　MachiiH. Varietal differences of nitrogen and amino acid contents in mulberry leaves(J). Acta Seric Entomo,l 1989, 1: 51-61
5　MachiiH. On gamma-aminobutylic acid contained inmulberry leaves(J). J Seric Sci Jpn, 1990, 59(5): 381-382
6　杨晓宇,马岩松,车芙蓉.桑椹资源的开发利用( J).食品科技,1999, (4): 25-26
7　杨晓兰,周纪侃,马文丽.桑椹籽与籽油的营养成分及理化特性的研究(J).中国粮油学报, 1998, 13(4): 43-45
8　刘学铭,肖更生,陈卫东.桑椹的研究与开发进展( J).中草药,2001, 32(6): 569-571
9　操红缨.桑椹研究进展(J).时珍国医国药, 1999, 10(8): 626-628
10 AlizaiM N, JabbarA E, Khan FM. Studies on the preparation and composition of mulberry (Morus alba), fresh fruit and their beverage base (MBB) (J). Sarhad Journal of Agriculture, 1996, 12 (6):683-686
11王鸿飞,李和生,韩素珍,等.桑椹的加工利用( J).宁波大学学报, 1999, 72(4): 81-84
12 ElmaciY, AltugT. Flavour evaluation of three black mulberry (Morus nigra) cultivars using GC/MS, chemical and sensory data(J).Journal of the Science of Food & Agriculture, 2002, 82 (6): 632-635
13刘学铭,肖更生,徐玉娟,等.D101A大孔吸附树脂吸附和分离桑椹红色素的研究(J).食品与发酵工业, 2002, 28(1): 19-22
14 Maskan M, GogusF. Sorption isotherms and drying characteristics of mulberry (Morus alba) (J). Journal of Food Engineering, 1998, 37(4): 437-449
15 AsanoN, YamashitaT, YasudaK, et a.l Polyhydroxylated alkaloids isolated from mulberry trees (Morus albaL. ) and silkworms (BombyxmoriL. ) ( J).　Journal of Agricultural& Food Chemistry,2001, 49 (9): 4208-4213
16 Dugo P, MondelloL, ErranteG, eta.l Identification ofanthocyanins in berries by narrow-bore high-performance liquid chromatography with electrospray ionization detection( J). Journal of Agricultural &Food Chemistry, 2001, 49(8): 3987-3992
17 Park SW, Jung Y S, KoK C. Quantitative analysis of anthocyanins among mulberry cultivars and their pharmacological screening( J).Han′GukWonyeHakhoechi ,1997, 38 (6): 722-724