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绿色含羞草绿色含羞草HLA-B27的检测及应用高庆峰高庆峰特性分布特性分布临床应用临床应用检测方法检测方法一、特性及分布一、特性及分布n什么是什么是HLA?HLA?nHLAHLA，H H代表人代表人(Human)(Human)，L L代表白代表白细胞细胞(Leuc ocyte)(Leuc ocyte)，A A代表抗原代表抗原(Antigen)(Antigen)，即人类白细胞抗原。，即人类白细胞抗原。HLAHLA是组织细胞上受遗传控制的个是组织细胞上受遗传控制的个体特异性抗原，最早是在白细胞体特异性抗原，最早是在白细胞和血小板上发现的，现在发现该和血小板上发现的，现在发现该抗原广泛分布于皮肤、肾、脾、抗原广泛分布于皮肤、肾、脾、肺、肠和心等组织器官有核细胞肺、肠和心等组织器官有核细胞的细胞膜上。的细胞膜上。一、特性及分布一、特性及分布n第第8 8次国际组织相容性会议次国际组织相容性会议确定确定HLAHLA有有9292个，分属于个，分属于A A、B B、C C、D D和和DR5DR5个位点，个位点，分别称为分别称为HLA-AHLA-A，HLA-BHLA-B，HLA-CHLA-C，HLA-DHLA-D和和HLA-DRHLA-DR。一、特性及分布一、特性及分布nHLA-BHLA-B位点有位点有4242个，个，B27B27为为其中之一。其中之一。nHLA-B27HLA-B27基因属于基因属于型型MHCMHC基因，基本上表达在机体基因，基本上表达在机体中所有有核的细胞上，尤中所有有核的细胞上，尤其是淋巴细胞的表面有丰其是淋巴细胞的表面有丰富的含量。富的含量。二、检测方法二、检测方法 1 1、微量细胞毒法、微量细胞毒法（microlymphocytotoxic testmicrolymphocytotoxic test，MLCTMLCT）原理：如果受试者淋巴细胞表面表达原理：如果受试者淋巴细胞表面表达有相应的有相应的HLA-B27HLA-B27抗原，就可以与抗原，就可以与B27B27抗体结合，形成抗体结合，形成Ag-AbAg-Ab复合物激活补体，复合物激活补体，发生对细胞膜的破坏及细胞杀伤作用，发生对细胞膜的破坏及细胞杀伤作用，通过染色法观察，死细胞的细胞膜通通过染色法观察，死细胞的细胞膜通透性改变，染料能够进入使之着色，透性改变，染料能够进入使之着色，而活细胞细胞膜完整不被染色。根据而活细胞细胞膜完整不被染色。根据死细胞占全部细胞的百分比，可以判死细胞占全部细胞的百分比，可以判断受试者淋巴细胞表面是否存在断受试者淋巴细胞表面是否存在HLA-HLA-B27B27抗原及其与抗体的反应强度。抗原及其与抗体的反应强度。二、检测方法二、检测方法优点：不需特殊仪器设备，易于操作，优点：不需特殊仪器设备，易于操作，一般的实验室都可开展。一般的实验室都可开展。缺点：标本存放不能超过缺点：标本存放不能超过8 8小时；感染可小时；感染可 以使细胞膜表面的以使细胞膜表面的B27B27分子的数量分子的数量 或结构改变，影响或结构改变，影响MLCTMLCT的结果，的结果，易出现假阴性。易出现假阴性。二、检测方法二、检测方法 2 2、ELISAELISA 原理：应用双抗体夹心酶标免疫分析法原理：应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中测定标本中HLA-B27HLA-B27水平。用纯化的水平。用纯化的B27B27抗体包被微孔板，依次加入抗体包被微孔板，依次加入HLA-B27HLA-B27抗抗原（待检标本）、生物素化的抗原（待检标本）、生物素化的抗HLA-HLA-B27B27抗体、抗体、HRPHRP标记的亲和素，形成双抗标记的亲和素，形成双抗体夹心反应，经过彻底洗涤后用底物体夹心反应，经过彻底洗涤后用底物TMBTMB显色。显色。TMBTMB在过氧化物酶的催化下转在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的的黄色。颜色的深浅和样品中的HLA-HLA-B27B27含量呈正相关。含量呈正相关。二、检测方法二、检测方法ELISAELISA结果与结果与MLCTMLCT法符合率为法符合率为9999，且不受感染因素的影响，重复性好。且不受感染因素的影响，重复性好。二、检测方法二、检测方法3 3、磁珠酶联免疫分析（、磁珠酶联免疫分析（IMS-IMS-ELISAELISA）磁珠分离与磁珠分离与ELISAELISA结合结合B27B27单抗标记单抗标记磁珠磁珠HRPHRP标记标记CD45CD45单抗通过磁场分单抗通过磁场分离游离相离游离相优点：反应时间短（优点：反应时间短（1 1小时完成）小时完成）对标本新鲜度要求不高对标本新鲜度要求不高 2 288静置静置4 d4 d之内可用之内可用二、检测方法二、检测方法 4 4、PCR-SSPPCR-SSP 原理：通过设计基因序列特异的引物原理：通过设计基因序列特异的引物SSPSSP，特异性的扩增出标本中的，特异性的扩增出标本中的HLA-B27HLA-B27基因基因片段，以琼脂糖凝胶电泳分析片段，以琼脂糖凝胶电泳分析PCRPCR扩增产扩增产物，若出现目的条带则表示物，若出现目的条带则表示HLA-B27HLA-B27为阳为阳性。性。二、检测方法二、检测方法优点：基因水平的检测，直接对优点：基因水平的检测，直接对HLA-B27HLA-B27 原基因进行扩增分型，灵敏度原基因进行扩增分型，灵敏度 高，特异性强。高，特异性强。缺点：耗时长，需要跑电泳，需要特定缺点：耗时长，需要跑电泳，需要特定 的实验仪器及严格的实验条件，的实验仪器及严格的实验条件，在临床上普遍开展此项检查有一在临床上普遍开展此项检查有一 定的难处。定的难处。二、检测方法二、检测方法 5 5、流式细胞术、流式细胞术 原理：利用荧光标记的原理：利用荧光标记的HLA-B27HLA-B27单克单克隆抗体，与细胞表面的隆抗体，与细胞表面的B27B27抗原结合，抗原结合，使结合后的淋巴细胞具有一定的荧使结合后的淋巴细胞具有一定的荧光强度，这种荧光强度可由流式细光强度，这种荧光强度可由流式细胞仪测得的通道值来反映，以其值胞仪测得的通道值来反映，以其值的高低判断的高低判断HLA-B27HLA-B27抗原表达百分比，抗原表达百分比，从而判断从而判断HLA-B27HLA-B27是否阳性。是否阳性。二、检测方法二、检测方法优点：全自动仪器检测，减少了人为优点：全自动仪器检测，减少了人为 因素的影响，重复性高，结果因素的影响，重复性高，结果 判断准确，快速，为目前较为理判断准确，快速，为目前较为理 想的方法，国外已将想的方法，国外已将FCMFCM法检测法检测 HLA-B27HLA-B27作为作为AS AS 诊断的常规检测诊断的常规检测 方法。方法。缺点：仪器昂贵，目前只在较大医院缺点：仪器昂贵，目前只在较大医院 应用，且荧光易淬灭。应用，且荧光易淬灭。二、检测方法二、检测方法鞘液鞘液600ul600ul标准微球一滴标准微球一滴100ulEDTA-K2100ulEDTA-K2抗凝血抗凝血荧光标记抗体荧光标记抗体30ul30ul混匀避光混匀避光1515分钟分钟1 1：1010溶血素溶血素2ml2ml混匀避光混匀避光8-108-10分钟分钟离心，弃上清离心，弃上清加鞘液加鞘液2ml2ml离心，弃上清离心，弃上清加鞘液加鞘液600ul600ul混匀混匀混匀混匀上机检测上机检测二、检测方法二、检测方法n报告方式：定性报告方式：定性三、临床意义三、临床意义强直性脊柱炎强直性脊柱炎瑞特氏综合征瑞特氏综合征急性前葡萄急性前葡萄膜炎。其中强直性脊柱炎与膜炎。其中强直性脊柱炎与HLA-B27HLA-B27关联性最强。关联性最强。然而带有然而带有HLA-B27HLA-B27抗原并不一定意味着会发生相抗原并不一定意味着会发生相关疾病关疾病在普通人群中也能发现约在普通人群中也能发现约1010为为HLA-HLA-B27 B27 阳性阳性因此因此HLA-B27HLA-B27阳性不能作为相关疾病阳性不能作为相关疾病的筛选标准的筛选标准但进行相关的检测能有助于疾病但进行相关的检测能有助于疾病的确诊和治疗的确诊和治疗三、临床意义三、临床意义n1 1、强直性脊柱炎、强直性脊柱炎n强直性脊柱炎（强直性脊柱炎（ankylosing spondylitisankylosing spondylitis，ASAS）以中轴关节慢性炎症为主，也可累）以中轴关节慢性炎症为主，也可累及内脏及其他组织的一种慢性进展性炎性及内脏及其他组织的一种慢性进展性炎性疾病，主要侵犯骶髂关节、脊柱骨突、脊疾病，主要侵犯骶髂关节、脊柱骨突、脊柱旁软组织及外周关节，并可伴发关节外柱旁软组织及外周关节，并可伴发关节外表现。临床主要表现为腰、背、颈、臀、表现。临床主要表现为腰、背、颈、臀、髋部疼痛以及关节肿痛，严重者可发生脊髋部疼痛以及关节肿痛，严重者可发生脊柱畸形和关节强直。柱畸形和关节强直。三、临床意义三、临床意义n临床表现：起病隐袭。患者逐渐出现臀髋临床表现：起病隐袭。患者逐渐出现臀髋部或腰背部疼痛和部或腰背部疼痛和/或发僵，尤以卧久（夜或发僵，尤以卧久（夜间）或坐久时明显，翻身困难，晨起或久间）或坐久时明显，翻身困难，晨起或久坐起立时腰部发僵明显，但活动后减轻。坐起立时腰部发僵明显，但活动后减轻。有的患者感臀髋部剧痛，偶尔向周边放射。有的患者感臀髋部剧痛，偶尔向周边放射。疾病早期疼痛多在一侧呈间断性，数月后疾病早期疼痛多在一侧呈间断性，数月后疼痛多在双侧呈持续性。随病情进展病变疼痛多在双侧呈持续性。随病情进展病变由骶髂关节向腰椎、胸颈椎发展，则出现由骶髂关节向腰椎、胸颈椎发展，则出现相应部位疼痛、活动受限或脊柱畸形。相应部位疼痛、活动受限或脊柱畸形。三、临床意义三、临床意义HLA-B27HLA-B27检测可辅助检测可辅助ASAS诊断，患者诊断，患者HLA-B27HLA-B27阳性率阳性率9090，人群，人群ASAS的的HLA-B27HLA-B27阳性预示值为阳性预示值为0.950.95-9.5-9.5，阴性预示值为，阴性预示值为99.999.9。如症状。如症状和体征提示和体征提示ASAS，HLA-B27HLA-B27阳性会显著增加正确诊阳性会显著增加正确诊断的机会，断的机会，B27B27阴性则排除阴性则排除ASAS诊断的可能性增加。诊断的可能性增加。对疑为对疑为ASAS患者进行淋巴细胞表面患者进行淋巴细胞表面HLA-B27HLA-B27抗原的抗原的检测有助于提高早期诊断检测有助于提高早期诊断ASAS的可能性，为此类的可能性，为此类患者的诊断和鉴别诊断提供线索，可弥补线患者的诊断和鉴别诊断提供线索，可弥补线不能早期诊断不能早期诊断ASAS的不足的不足。三、临床意义三、临床意义nHLA-B27HLA-B27检测还可预测幼年特发性关节炎患检测还可预测幼年特发性关节炎患儿的转归，如患者儿的转归，如患者HLA-B27HLA-B27阳性，则发展为阳性，则发展为ASAS的可能性大。同时的可能性大。同时HLA-B27HLA-B27抗原检测对抗原检测对ASAS的预防亦具有一定意义，如的预防亦具有一定意义，如HLA-B27HLA-B27阳性患阳性患者的一级亲属可检测者的一级亲属可检测B27B27，对，对ASAS进行早期诊进行早期诊断，及早进行干预治疗。断，及早进行干预治疗。2 2、反应性关节炎、反应性关节炎(reactive arthritis(reactive arthritis，ReA)ReA)是一种发生于某些特定部位是一种发生于某些特定部位(如肠道和如肠道和泌尿生殖道泌尿生殖道)感染之后而出现的关节炎。反感染之后而出现的关节炎。反应性关节炎是一种继发于身体其它部位感应性关节炎是一种继发于身体其它部位感染后出现的急性非化脓性关节炎。除关节染后出现的急性非化脓性关节炎。除关节表现外，反应性关节炎常伴一种或多种关表现外，反应性关节炎常伴一种或多种关节外表现。节外表现。三、临床意义三、临床意义三、临床意义n临床表现：（临床表现：（1 1）.全身症状发热、体重下全身症状发热、体重下降、倦怠无力和大汗（降、倦怠无力和大汗（2 2）.关节炎多为单关节炎多为单一或少关节炎，非对称性分布急性关节炎一或少关节炎，非对称性分布急性关节炎（3 3）.泌尿生殖道炎症无菌性尿道炎无症泌尿生殖道炎症无菌性尿道炎无症状或症状轻微的膀胱炎和官颈炎（状或症状轻微的膀胱炎和官颈炎（4 4）.皮皮肤黏膜表现溢脓性皮肤角化症常出现于足肤黏膜表现溢脓性皮肤角化症常出现于足底和手掌（底和手掌（5 5）.眼部症状结膜炎，通常症眼部症状结膜炎，通常症状较轻（状较轻（6 6）.心脏表现主动脉病变和传导心脏表现主动脉病变和传导异常（异常（7 7）.其他蛋白尿、镜下血尿或无菌其他蛋白尿、镜下血尿或无菌性脓尿系统性坏死性血管炎、血栓性浅表性脓尿系统性坏死性血管炎、血栓性浅表性静脉炎、紫癜、淀粉样变性、颅神经和性静脉炎、紫癜、淀粉样变性、颅神经和周围神经病。周围神经病。三、临床意义三、临床意义n反应性关节炎患者的反应性关节炎患者的HLA-B27 HLA-B27 阳性率达阳性率达65%65%96%96%，HLA-B27 HLA-B27 携带者发生反应性关节炎的机携带者发生反应性关节炎的机会增加会增加50 50 倍，倍，HLA-B27 HLA-B27 阳性患者的临床症状阳性患者的临床症状明显重于该基因阴性者。而且，明显重于该基因阴性者。而且，HLA-B27 HLA-B27 阳阳性者易发展成慢性反应性关节炎性者易发展成慢性反应性关节炎HLA-B27 HLA-B27 阳阳性者的反应性关节炎易感性与致病菌的种类性者的反应性关节炎易感性与致病菌的种类有关。如在沙门菌引起者的有关。如在沙门菌引起者的HLA-B27 HLA-B27 阳性率阳性率为为20%20%33%33%，在支原体引起者为，在支原体引起者为40%40%50%50%，耶尔森菌引起者为耶尔森菌引起者为70%70%80%80%，而在志贺菌引，而在志贺菌引起者则达起者则达80%80%97%97%。三、临床意义三、临床意义3 3、急性前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎 常有突发眼痛、眼红、畏光、流泪等症状，常有突发眼痛、眼红、畏光、流泪等症状，检查时可见睫状充血，尘状检查时可见睫状充血，尘状KPKP（角膜后沉（角膜后沉着物），前房闪辉明显，大量房水细胞，着物），前房闪辉明显，大量房水细胞，或伴有纤维蛋白渗出，甚至前房积脓，此或伴有纤维蛋白渗出，甚至前房积脓，此外还有外还有瞳孔缩小、虹膜后粘连等改变。起瞳孔缩小、虹膜后粘连等改变。起病急，有的视力明显下降，有反复发作的病急，有的视力明显下降，有反复发作的特点。特点。三、临床意义三、临床意义 第一类仅出现急性前葡萄膜炎，此类患者第一类仅出现急性前葡萄膜炎，此类患者多呈多呈HLA-B27HLA-B27抗原阳性，并且多合并有强直抗原阳性，并且多合并有强直性脊椎炎、牛皮癣性关节炎、性脊椎炎、牛皮癣性关节炎、ReiterReiter综合综合征和炎症性肠道疾病征和炎症性肠道疾病;第二类为慢性前葡萄第二类为慢性前葡萄膜炎，如膜炎，如FuchsFuchs综合征、儿童白色葡萄膜炎综合征、儿童白色葡萄膜炎;第三类是既可出现急性验证又可出现慢性第三类是既可出现急性验证又可出现慢性炎症，幼年型慢性关节炎、结核、梅毒等炎症，幼年型慢性关节炎、结核、梅毒等均可引起此类炎症。均可引起此类炎症。nthanks