生物08天然产物提取实验讲义.doc

实验一 甜叶菊糖苷的提取分离

甜叶菊，又名“甜菊”、“甜草”。原产巴拉圭,属菊属菊科草本植物。其叶含有甜叶菊苷，是一种天然甜味剂，具有高甜度、低热量、无毒、无副作用等特点，同时具有一定的药理作用，对高血压、糖尿病、肥胖症、冠心病、小儿龋齿等病症有很好疗效。甜菊糖苷的甜度约为蔗糖的300倍。因此甜叶菊成为继蔗糖、甜菜糖之后的第3种天然糖源。甜菊糖苷是从干燥后的甜菊叶中抽提出的一类具甜味的萜烯类配糖体，纯品为白色结晶性粉末，分子式为C38H60O18，熔点198℃，易溶于水，可溶于甲醇、乙醇、四氢呋喃，不溶于苯、醚、氯仿等有机溶剂。有较好的耐热性和稳定性，通常称为热稳定糖料。目前为止，已从甜叶菊中分离得到8种不同甜度的糖苷。其中Stevioside是主要成分，占60%~70%,甜度为蔗糖的300倍，其次是Rebaudioside A，占15%~20%，甜度为蔗糖的450倍，且甜味最接近蔗糖，其他组分含量都较少。
一、实验目的和要求
掌握甜叶菊糖苷的提取分离、纯化、结晶方法。
二、实验原理
根据甜菊糖苷易溶于水、乙醇的性质，采用乙醇—水混合溶剂对甜叶菊糖苷进行提取。
三、仪器、试剂与材料
（略）
三、实验步骤
1、甜叶菊糖苷的提取
取甜叶菊叶片干粉30g于500ml圆底烧瓶中，加入300ml 70%乙醇，接上冷凝装置后置70℃水浴中回流提取2 h后，过滤，滤渣用70%乙醇再回流提取两次，每次加入70%乙醇100 ml，提取1小时。合并三次提取液即得甜叶菊糖苷粗提液。
2、甜叶菊糖苷的纯化
甜叶菊糖苷粗提液置旋转蒸发仪上50℃减压浓缩回收乙醇。粗提液浓缩至100 ml左右取出，冷至室温后，用Ca(OH)2调节溶液pH10，置4℃冰箱中静置4 h，使杂质沉淀完全。抽滤，得甜叶菊糖苷纯化液。
3、甜叶菊糖苷的结晶和重结晶
甜叶菊糖苷纯化液置旋转蒸发仪上50℃减压浓缩至原体积的三分之一左右，得到较粘稠的液体，即为甜菊糖浓缩液。浓缩液60℃真空干燥，得甜叶菊粗糖苷。称重，计算产率并记录产品性状。
甜叶菊粗糖苷用少量甲醇加热溶解后，通过无水Na2SO4 进行抽滤，收集滤液，滤液置通风橱中进行自然状态冷却重结晶。收集晶体，得甜叶菊糖苷纯品。称重，计算产率并记录产品性状。产品留待下一实验用。
实验二 甜叶菊糖苷的检测及其性质

甜叶菊糖苷常用的检测方法有比色法、2,4—二硝基苯肼重量法、薄层层析法、气相色谱法和高效液相色谱法。其中气相色谱法样品的前处理比较烦琐，样品经甲醇衍生化为甲酯，反应转化率低；薄层色谱法操作较难；高效液相色谱法前处理简单,分析时间短,分离度好，是目前甜叶菊糖苷准确测定的首选方法，但仪器和耗材昂贵，不适于常规测定。比色法虽然干扰较大造成定量不够准确，但对仪器条件要求宽松，方法简单，适于快速测定。
一、实验目的
掌握甜叶菊糖苷比色法测定方法的原理和基本操作，了解其他常用的测定方法；熟悉甜叶菊糖苷的基本性质。
二、实验原理
DNS比色法基本原理：在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

黄色    桔红色
三、仪器、试剂与原料
3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000ml容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325ml，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000ml。
lmg／ml葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在 80℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100ml的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。
四、实验步骤
1、标准曲线的绘制
取7支25ml刻度试管，编号，按下表加入各反应试剂：
操作项目
管号
1
2
3
4
5
6
7
葡萄糖标准液(ml)
0
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
蒸馏水(ml)
2
1.80
1.60
1.40
1.20
1.00
0.80
3,5-二硝基水杨酸(ml)
1.50
1.50
1.50
1.50
1.50
1.50
1.50
葡萄糖质量(mg)
0
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
OD540

将各管摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即冷却至室温，再以蒸馏水定容至25ml，混匀。在540nm波长下，用0号管调零，分别读取1～6号管的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。
2、甜叶菊糖苷含量的测定
称取实验一中所得甜叶菊糖苷产品100mg，置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100ml的容量瓶中，以蒸馏水定容至刻度，摇匀得待测样品。
取4支25ml刻度试管，编号，按下表所示的量操作。
操作项目
管号
1
2
3
4
甜叶菊糖苷样品液(ml)
0
1.00
1.00
1.00
蒸馏水(ml)
2
1.00
1.00
1.00
3,5-二硝基水杨酸(ml)
1.50
1.50
1.50
1.50
OD540

其余操作均与制作葡萄糖标准曲线时相同。
根据测定结果计算所提取的甜叶菊糖苷产品中甜叶菊糖苷的纯度。
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