肺结核诊断新技术.ppt

结核病诊断新技术及其评价 宝鸡市人民医院呼吸科 魏胜全内容二、生化检测生化检测三、细胞免疫学检测三、细胞免疫学检测一、微生物学检测一、微生物学检测四、分子生物学检测四、分子生物学检测呼吸医生的尴尬？先抗炎？再抗痨？实在不行，上化疗？你懂的！你懂的！TBTB的诊断有时有多难！的诊断有时有多难！病原学检测是诊断TB最重要的依据，但据2013年WHO统计，仅有58%的TB患者有病原学依据。前言早期准确诊断早期准确诊断是结核病(TB)患者得以及时治疗的关键。目前的目前的 TB 诊断水平仍然薄弱。诊断水平仍然薄弱。据世界卫生组织(WHO)估算，2012年的 860万新发 TB患者中，仅登记了 570万，还有 217.5万(25.3%)未被发现(漏诊)。提高诊断技术则是发现患者，减少误提高诊断技术则是发现患者，减少误诊、漏诊的核心。诊、漏诊的核心。2024/3/18 周一一、微生物学检测包括涂片染色镜检、结核分枝杆菌(MTB)分离培养、MTB药敏和菌种鉴定等。染色涂片法是临床上最便捷快速的诊断方法，但敏感度偏低，发达国家可检出 50%的活动性肺结核，我国检出率一般约为 30%，且无法区别非 MTB(Mycobacteriumtuberculosis)。MTB分离培养是确诊 TB最重要的依据，不仅能取得病原学结果，还能进一步进行药敏检测，指导治疗。目前常用的细菌培养基包括 Lowenstein-Jensen固相培养基(L-J法)和 Middlebrook7H97H11液体培养基。固相培养基价格低，但耗时长，需要 48周取得结果，加上菌种鉴定的时间耗时更长。基于 BACTECMGIT960、BacT/Alert3D系统的液体培养基检测速度有明显提高(14周)，但费用较高。一、微生物学检测1.1 MTB 快速培养法快速培养法BACTECMGIT960系统采用荧光增强原理，在培养管底部包埋对氧气浓度高度敏感的指示剂，通过检测氧气浓度变化以监测培养管内 MTB的生长状态。阳性标本检出时间相对较短，平均为 9d，后续菌种鉴定及药敏试验时间平均为 4d。BACTECMGIT960系统为目前国际通行培养标准，培养阳性率较固体培养法高出 10%左右，检测界限 10个菌落形成单位(CFU)/mL。BacT/Alert3D系统采用比色法原理，通过监测预处理标本中产生 CO2与标本瓶中初始的 CO2相比较，判断是否存在 MTB生长。同时可以进行药敏检测。理论上培养速度较 L-J法和 BACTECMGIT960系统更快(622d)。1.2 直接显微镜检技术直接显微镜检技术 (MODS)工作原理依据于 MTB在液体培养基中生长会出现特征性的索状结构，该结构可以通过倒置显微镜观察到。检测呼吸道标本中是否存在 MTB的敏感度为 97.5%，特异度为 94.4%，出现阳性结果的中位时间约为 8d该方法无需昂贵的设备，简单，相对快速。二、生化检测TB的生化检测主要包括腺苷脱氨酶(ADA)、乳酸脱氢酶(LDH)、血管紧张素转化酶(ACE)等酶学检测。此类方法简单快速，适用于 TB早期诊断及鉴别诊断，但由于缺少结核特异性的酶标而无确诊价值。2.1 ADAADA是嘌呤核苷代谢中重要的酶。胸(腹)腔积液 ADA检测对结核性胸(腹)膜炎鉴别诊断有重要意义，胸(腹)腔积液 ADA浓度以 45U/L为界，结核性大多超过此值，特异度及敏感度超过 80%。胸(腹)腔积液 ADA与血清 ADA比值 1更倾向结核性积液。而对于癌性及非特异性积液，其比值一般 8U/L，而后两者一般正常，ADA浓度 8U/L。结核性脑膜炎 表明，将 ADA浓度 8U/L作为结核性脑膜炎诊断的阈值时，其诊断的总敏感度 96%。二、生化检测2.2 LDH是一种糖酵解酶，几乎存在于机体所有组织细胞的胞质内。对 TB的诊断来说，LDH可用于区别渗出性积液与漏出性积液，胸(腹)腔积液 LDH与血清 LDH比值 0.6，LDH浓度 200U/L倾向渗出液。结核性胸(腹)腔积液的 LDH浓度一般 200U/L，与癌性胸(腹)腔积液 LDH浓度变化无特征性差异。2.3 ACE为二肽羧肽水解酶，又名激肽酶 I，存在于肺、肾、脑、小肠、胎盘等组织的血管内皮细胞或上皮细胞及血浆。对 TB的诊断来说，血清 ACE的检测主要用于 TB与结节病的鉴别，后者血清 ACE浓度升高多见。结核性胸腔积液 ACE浓度一般不升高，胸腔积液 ACE与血清 ACE比值 1更倾向结核性积液，而恶性积液的比值多 95%，对痰细菌培养阳性肺结核敏感度为 92%100%，对于痰细菌培养阴性肺结核敏感度为 40%93%，对于肺外结核敏感度约为 93%。4.2.2罗氏 AmplicorMTB检测 扩增引物 16SrRNA基因片段，然后于各种分枝杆菌菌种特异性的寡核苷酸探针进行反向斑点杂交或微孔板反向杂交鉴定菌群，部分研究表明，该方法总的特异度 95%，对于痰细菌培养阳性肺结核检出 97%，对痰细菌培养阴性肺结核敏感度为 40%73%，对肺外结核敏感度为 77%98%。分子生物学检测分子生物学检测4.2.3 BD-ProbeTec SDA test 半定量的链置换扩增技术，半定量的链置换扩增技术，以 IS6110和 16SrRNA为靶序列，经加热变性后与特异性引物杂交，在 DNA聚合酶的作用下产生带限制性核酸内切酶识别位点的靶 DNA序列，然后核酸内切酶在其识别位点将 DNA双链打开缺口，DNA聚合酶继之延伸缺口 3端并替换下一条 DNA链。被替换下来的 DNA单链可以与引物结合并被 DNA聚合酶延伸成双链。该过程不断反复，使靶序列高效扩增。该方法总的特异性 90%，对于痰细菌培养阳性肺结核检出达 90%100%，对于痰细菌培养阴性肺结核敏感度 33%100%，对于肺外结核敏感度为76%。4.2.4 实时荧光核酸恒温扩增检测技术实时荧光核酸恒温扩增检测技术 在同一温度下，在同一温度下，首先通过 M-MLV反转录酶产生靶标核酸的 1个双链 DNA拷贝，然后利用 T7RNA多聚酶从该 DNA拷贝上产生多个(1001000)RNA拷贝；每个 RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标记的探针和这些 RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况。实时荧光核酸恒温扩增检测技术实时荧光核酸恒温扩增检测技术 试剂盒通过检测 RNA来证实 MTB的存在，扩增效率极高，1530min即可将模板扩增 109倍，理论上检测灵敏度和准确性远高于其他核酸检测技术；该技术采用实时荧光闭管检测，使污染得到有效控制；即使污染产生，由于扩增产物为 RNA，环境中极易降解，从而大幅度提高检测结果的可靠性。目前该试剂盒已获批准于我国应用。PCR原理原理分子生物学检测分子生物学检测4.2.5 GeneXpert MTB/RIF 系统系统 GeneXpertMTB/RIF检测试剂盒为美国 Cepheid公司开发的，适用于 GeneXpert仪器，可在 2h内直接从患者新鲜痰液或冻存痰液中检测是否还有 MTB及对利福平的耐药情况，整个过程都在一密闭环境中进行，该方法采用全自动实时荧光定量 PCR原理，将样品处理、核酸扩增、目标序列的实时检测整合于一体，通过对 MTB特有的序列 rpoB基因上于利福平耐药相关 81bp的核心区域(RRDR)进行检查。Boehme等在 新英格兰医学杂志发表报道，对 4个 TB高负担国家的 1730例疑似 TB患者进行诊断评估，对于细菌培养阳性、涂片阳性的标本检测时，MTB/RIF的检出率为 98.2%(551/561)；对于培养阳性、涂片阴性的标本检测时，MTB/RIF的一次检出率为 72.5%(124/172)，该检测方法特异度达 99.2%(604/694)。与药敏实验相比，MTB/RIF检测方法对利福平耐药患者的检出率高达 97.6%(200/205)，对利福平敏感患者的检出率达 98.1%(504/514)。Boehme等对南非、秘鲁、印度、阿塞拜疆、菲律宾和乌干达的 6648例可能携带 MTB、耐多药 MTB的疑似患者进行检测，MTB/RIF也取得类似结果。GeneXpertMTB/RIF系统分子生物学检测分子生物学检测GeneXpertMTB/RIF系统评价 极大的改进了我们对 TB分子生物学诊断的看法，该系统高度全自动化，生物安全性好，速度快，对于 TB的诊断是一大贡献。但是该系统仍有未克服的缺陷：对于肺外结核、痰细菌培养阴性结核的检出率不高，尤其是对于菌量极少的标本；对于中国人群来说，利福平耐药是否真能预测大部分异烟肼耐药尚不能确定；此外，检测费用高也是限制其推广的重要原因。结语结语TB 诊断技术近年来取得了很大进展，将为提高 TB 的诊断水平发挥重要作用。对于我国来说，一方面需要探索合理使用上述方法的策略，一方面更应该创新性研究适合我国的新方法和新工具，为早期准确诊断 TB 做贡献。