中性粒细胞胞外诱捕网在类风湿关节炎发病机制中的研究进展.pdf

基金项目:国家自然科学基金资助项目(82001740)作者单位:030001太原,山西医科大学第二医院风湿免疫科、山西医科大学第二医院风湿免疫微生态山西省重点实验室、山西医科大学生理学系细胞生理学教育部重点实验室通信作者:李小峰,电子信箱:lxf_9859 中性粒细胞胞外诱捕网在类风湿关节炎发病机制中的研究进展宋子怡张升校苏勤怡李小峰摘要类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的自身免疫性疾病,抗瓜氨酸蛋白抗体(autoantibodies to citrul-linated protein antigens,ACPAs)的产生是致病关键。中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)是中性粒细胞受刺激后产生的胞外纤维,由 DNA、组蛋白和颗粒蛋白组成,可以使细菌裂解死亡。研究发现,NETs 是 RA 中瓜氨酸化蛋白和细胞因子的重要来源,也是 ACPAs 形成的重要原因,同时 NETs 也能促进滑膜成纤维细胞增殖并产生细胞因子。NETs 的形成与消除达到平衡时对机体是有益的,然而慢性感染或自身免疫紊乱等病理过程可打破这一平衡,直接引起组织损伤和炎性反应增强。本文对 NETs 在 RA 中的致病机制及基于这些机制的靶向药物在 RA 治疗中的进展展开论述。关键词类风湿关节炎中性粒细胞胞外诱捕网抗瓜氨酸蛋白抗体滑膜成纤维细胞肽酰基精氨酸脱亚氨酶中图分类号R593.2文献标识码ADOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2023.07.004类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性的、以累及关节为主的多系统自身免疫性疾病,病变早期关节主要病理特征为滑膜炎细胞浸润、滑膜增生和血管翳形成,晚期常发生关节畸形。RA 患者外周血和滑膜液中存在特异性自身抗体,如抗瓜氨酸蛋白抗体(autoantibodies to citrullinated protein anti-gens,ACPAs)、抗氨甲酰化蛋白抗体及抗乙酰化蛋白抗体等1。其中 ACPAs 最为关键,在 RA 亚临床阶段可在血液中存在数年。中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)是 RA 中瓜氨酸蛋白的重要来源,能刺激机体产生 ACPAs。此外,NETs 还能与滑膜成纤维细胞(fibroblast-like syno-viocytes,FLSs)相互作用导致炎性反应增强。本文将重点概述 NETs 在 RA 发病机制中的关键作用及以NETs 为靶点的药物在 RA 治疗中的新进展。一、NETs 的形成NETs 是中性粒细胞受到感染或炎症等刺激后失去细胞内膜完整性后释放的一种染色质纤维网状结构,主要成分为组蛋白、DNA 和颗粒蛋白,网上分布的各种酶及抗菌肽可捕捉、固定并杀灭侵入机体的细菌。2004 年,Brinkmann 等2发现并报道了 NETs,这是一种杀菌的新机制。NETs 的形成与清除失衡与许多自身免疫性疾病的发生有关。活性 氧(reactive oxygenspecies,ROS)介 导 了NETs 的形成,其产生包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamideadenine dinucleotide phosphate,NAD-PH)氧化酶(NADH oxidase,NOX)依赖途径与 NOX非依赖途径3,4。在 NOX 依赖途径中,在微生物、血小板、免疫复合物(immune complexes,ICs)、自身抗体、细胞因子、药物、体外的蛋白激酶 C(protein kinaseC,PKC)的强效激活剂乙酸肉豆蔻佛波酯(phorbol12-myristate 13-acetate,PMA)和钙离子(Ca2+)等多种因素的刺激下,中性粒细胞被激活,其细胞膜上的 NOX2 进而产生 ROS,ROS 作用于嗜苯胺蓝颗粒(azurophilicgranules,AG),导致髓过氧化物酶(my-eloperoxidase,MPO)和中性粒细胞弹性酶(neutrophilelastase,NE)从 AG 转移到细胞核,这两种酶在细胞核中促使组蛋白分解和染色质解聚,随后中性粒细胞膜破裂,NETs 形成5,6。在 NETs 形成过程中,激活的中性粒细胞能进一步诱导大量的肽酰基精氨酸脱亚胺酶(peptidylarginine deiminase,PAD)4 产生,使组蛋白瓜氨酸化。在 NOX 不足时,线粒体可通过NOX 非依赖途径产生 ROS,促使 NETs 形成。刺激NETs 形成的信号通路目前尚未完全明确,Raf-MEK-ERK 可能起着关键性的作用。此外,有研究表明,NETs 的形成与 G 蛋白偶联受体(G protein-coupledreceptors,GPCRs)和整合素等信号分子有关7。51医学研究杂志 2023 年 7 月第 52 卷第 7 期医学前沿中性粒细胞产生 NETs 并伴随细胞裂解、死亡的过程称为 NETosis,是一种在形态学上不同于凋亡和坏死的新的细胞死亡方式8。NETosis 的发生因刺激类型的不同分为自杀性和非自杀性。前者如上所述,最为常见,可在中性粒细胞受刺激后数小时内发生。后者则可在中性粒细胞受刺激后几分钟内发生,由金黄色葡萄球菌通过 Toll 样受体(toll-like recep-tors,TLR)2 配 体 和 补 体 受 体 或 由 大 肠 杆 菌 通 过TLR4 或 TLR4 激活的血小板诱导产生9。与自杀性NETosis 一样,NE 转移到细胞核中,促进染色质进一步解聚和核膜破坏,被蛋白质修饰的染色质通过小泡排出胞外。不同的是,中性粒细胞膜不被破坏且保留了趋化、吞噬、杀菌等功能。二、NETs 介导 RA 的发病机制在生理状态下,NETs 可对外界的危险信号产生防御反应。NETs 可结合多种病原体并释放高浓度的抗菌物质以降低细菌毒力并杀死细菌,从而保护机体。然而,在慢性感染和炎性反应时,NETs 可介导自身免疫反应并直接杀死上皮细胞和内皮细胞,导致组织充血、水肿及氧化损伤,促使 RA 发生、发展10。RA 发展过程中常有 NETs 的清除异常11。脱氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease,DNase)是一种主要存在于血液和胃肠道中具有核酸内切酶活性的酸性糖蛋白,是 NETs 的重要降解因子。DNase可能通过抑制 ROS 的产生从而减少 NETs 形成及促进已形成 NETs 降解发挥作用,但具体机制尚不清楚。研究发现,RA 滑膜中的 DNase中几乎无活性,血清中的 DNase活性显著降低,且与红细胞沉降率(erythrocytesediment rate,ESR)、C 反应蛋白(C reac-tive protein,CRP)和中性粒细胞计数等炎性指标呈负相关。因此,血清 DNase活性水平也许能作为评价 RA 活动性的指标12。DNase的活性受损会导致 NETs 不能被有效清除,进而增加瓜氨酸化自身抗原的暴露,增加 ACPAs 的产生,导致关节炎症进一步恶化。RA 患者滑膜组织、类风湿结节和皮肤组织中有大量 NETs 的存在,对激活中性粒细胞的刺激因素更加敏感。外周血中 NETs 的百分比与血清 CRP、ESR、ACPAs 和 IL-17 水平也呈显著正相关13。NETs 通过产生瓜氨酸蛋白等自身抗原、与环境因素相互作用诱导 ACPAs 产生以及促进滑膜成纤维细胞增殖和产生细胞因子等机制介导 RA 的自身免疫应答。1.NETs 是瓜氨酸蛋白等 RA 自身抗原的主要来源:RA 患者在亚临床阶段体内即可出现自身抗原,其中瓜氨酸化组蛋白是 RA 中主要的抗原。在中性粒细胞形成 NETs 并杀灭病原体的过程中,组蛋白的瓜氨酸化是关键一步。瓜氨酸化是一种蛋白质翻译后的修饰过程,指蛋白质肽链中蛋白的精氨酸残基在PADs 作用下脱亚氨基转化为瓜氨酸化蛋白。PADs包含 5 种同工酶(PAD1 4 和 PAD6),中性粒细胞广泛表达 PAD2 与 PAD4。正常情况下 PAD4 无活性,但在氧化应激或自身免疫反应过程中,Ca2+进入细胞使其活化,导致组蛋白、弹性蛋白酶、天青蛋白和髓样细胞分化抗原等瓜氨酸化,增加了它们的抗原性4。此外,穿孔素和补体膜途径能使中性粒细胞形成孔隙,通过增加细胞内钙离子浓度激活 PADs,使中性粒细胞蛋白广泛瓜氨酸化14。瓜氨酸化蛋白能刺激机体产生 ACPAs,从而诱导自身免疫反应。RA 患者外周血中 NETs 与 ACPAs 水平具有相关性,当 ACPAs从血浆中清除时,抗 NETs 抗体的活性也降低15。反过来,ACPAs 也能刺激中性粒细胞释放 NETs,使炎症持续发生,形成恶性循环。此外,NETs 形成过程中产生的与 RA 发病相关的自身抗原还有膜联蛋白 A1、过氧化氢酶、基质相关蛋白酶 8 等。2.环境因素通过 NETs 诱导 ACPAs 产生促使RA 发病:RA 发病早期,一些环境因素如吸烟和牙周病感染都能以依赖 PADs 的方式形成 NETs 并产生瓜氨酸蛋白,进而诱导 ACPAs 产生16。随后,瓜氨酸化蛋白可与相应的自身抗体结合形成 ICs,在 ICs 刺激下,关节滑膜炎性反应持续进展,最终导致关节组织破坏及畸形。NETs 中的瓜氨酸蛋白产生后进一步诱导 NETs 的形成,形成正反馈。据报道,在健康吸烟者的支气管肺泡灌洗液中,PADs 酶的表达和活性升高,瓜氨酸化蛋白水平也升高,可能与烟草中的尼古丁有关。一些临床证据表明,在 RA 亚临床和临床阶段,ACPAs 阳性患者常伴有支气管扩张、间质性肺疾病和小气道阻塞等呼吸系统疾病17。牙龈卟啉单胞菌会引起牙周炎,并在高度血管化的环境中产生瓜氨酸抗原。放线菌团聚杆菌是一种革兰阴性杆菌,可引起牙周炎和感染性心内膜炎,通过产生白细胞毒素 a来触发中性粒细胞整体高脂化,它也能够通过诱导 ACPAs 产生导致 RA 发生,但具体机制尚不明确18。3.NETs 通过促进滑膜成纤维细胞增殖和产生细胞因子加重 RA 关节损害:RA 滑膜微环境非常有利于形成 NETs。FLSs 是促进关节滑膜增生的主要61医学前沿J Med Res,July 2023,Vol.52 No.7细胞,可吸引炎性细胞作用于滑膜,加剧关节炎症及组织破坏。NETs 的瓜氨酸蛋白可作为自身抗原激活滑膜中的免疫细胞,刺激 FLSs 或巨噬细胞表达和释放 IL-8、IL-6 和 IL-25 等促炎性细胞因子,这些炎性细胞因子和多种抗体又可以诱导 NETs 产生,导致机体免疫耐受丧失,促进 RA 的发展。RA-FLSs 可将 NETs 内化至晚期糖基化终产物受体-TLR9 途径中。这种由 FLSs 内化的 NETs 可使 FLSs 合成更多的促炎性细胞因子和趋化因子,并通过主要组织相容性复合体使 FLSs 具有抗原递呈细胞能力19。FLSs可以将含有瓜氨酸肽的 NETs 递呈给 RA 抗原的特异性 T 细胞并激活它们,从而介导适应性免疫反应。研究表明,NETs 在体外能促进 RA-FLSs 增殖并 使RA-FLSs 内 CTGF mRNA 表达上调和 MST1 激酶表达显著下调20。Khandpur 等13研究结果表明,NETs对 FA-FLSs 的影响可能与 RA 患者滑膜中DNase活性受损有关。4.NETs 介导 RA 发展的其他可能机制:除了上述机制外,NETs 还可通过产生 PAD2、排出线粒体DNA(mtDNA)、促进血管新生和血管翳的形成、激活补体系统等加剧 RA 炎症。NETs 中的 PAD2 不仅可以直接降解滑膜中的软骨成分,还能激活 FLSs 和巨噬细胞的促炎途径,从而加剧关节损伤。目前,大多数研究者认为,NETs 有细胞核及线粒体两种来源,但仍未进一步明确。NETosis 期间,中性粒细胞排出的mtDNA 具有促炎特性,这一发现增加了 NETs 介导的自身免疫的复杂性。由于 mtDNA 含有细菌核酸的残体,且存在异常甲基化,因此,机体可能产生对 mtD-NA 的免疫反应,增强 TLR 信号和放大炎症信号而诱发 RA21。RA 滑膜中明显增多的 NETs 可以促进血管新生,但这一过程的分子机制有待于进一步研究。此外,NETs 结合相关抗体后,可通过经典途径激活补体系统进一步加重炎性反应22。三、以 NETs 为靶点在 RA 中的潜在疗法NETs 在 RA 发病早期发挥了重要的促炎作用,多种药物可通过调控 NETs 靶点治疗 RA。研究表明,托珠单抗和利妥昔单抗等能通过减少 NETs 的生成延缓 RA 进展23。雷公藤不仅可以减少健康人和RA 患者的 NETs,还能通过抑制氧化爆发和脾酪氨酸激酶的活化阻止丝裂原活化蛋白激酶、细胞外信号调节激酶、活化核转录因子 B(nuclear transcription fac-tor kappa B,NF-B)的磷酸化减少 NETs 中组蛋白的瓜氨酸化,从而延缓 RA 进展。另外一些研究表明,抗氧化剂 N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)可以 通 过 阻 断 T 淋 巴 细 胞 mTOR 受 体 阻 止NETs 的形成和 ROS 的释放降低 RA 等自身免疫性疾病的活动性。PAD4 抑制剂 CL-脒(CI-amidine)可通过减少小鼠关节和血清中的瓜氨酸蛋白和 IL-6减轻关节损害,但效果欠佳。DNase可促进 NETs的清除从而减 轻小鼠肾 脏 组 织 损 伤 并 延 长 寿 命。GSK199 作为一种低钙 PAD4 酶抑制剂也可减缓关节炎严重 程 度。由 此 可 见,靶 向 中 性 粒 细 胞 产 生 的NETs 可能成为改善 RA 患者预后的新的治疗靶点,针对其产生机制有望开发新的靶向药物。四、展望中性粒细胞及其产生的 NETs 大量存在于 RA 的炎症部位,在自身免疫反应的发生和发展过程中起着至关重要的作用。RA 的发生、发展与 NETs 生成能力的增加以及导致持续性炎症和组织损伤的 NETs清除障碍有关。NETosis 会导致细胞内翻译后修饰的蛋白质和 DNA 暴露,从而打破自身免疫耐受并激活适应性免疫反应,诱导免疫细胞产生自身抗体和细胞因子等,并直接激活邻近细胞,诱导组织损伤并导致全身炎性反应,促使 RA 发生。NETs 还可以通过激活补体途径等方式放大炎性反应。本研究概述了可用于预防 NETs 生成或增加其降解的可能靶向药物,但仍需要对这些药物进行更多的研究和临床试验以证实其疗效,从而减轻对 RA 患者的伤害。进一步探索 NETs 影响 RA 的发病机制将为 NETs 成为具有诊断意义的生物学标志物和靶向 NETs 治疗 RA 提供坚实的基础。参考文献1 Chen W,Wang Q,Ke Y,et al.Neutrophil function in an inflamma-tory milieu of rheumatoid arthritisJ.J Immunol Res,2018,2018:85493292 Brinkmann V,Reichard U,Goosmann C,et al.Neutrophil extracellu-lar traps kill bacteriaJ.Science,2004,303(5663):1532-15353 Wright HL,Lyon M,Chapman EA,et al.Rheumatoid arthritis syno-vial fluid neutrophils drive inflammation through production of chemo-kines,reactive oxygen species,and neutrophil extracellular trapsJ.Front Immunol,2020,11:5841164 Chapman EA,Lyon M,Simpson D,et al.Caught in a trap?Proteomicanalysis of neutrophil extracellular traps in rheumatoid arthritis and sys-temic lupus erythematosusJ.Front Immunol,2019,10:4235 Metzler KD,Goosmann C,Lubojemska A,et al.A myeloperoxidase-containing complex regulates neutrophil elastase release and actin dy-namics during netosisJ.Cell Rep,2014,8(3):883-8966 常永龙,郭锦晨.中性粒细胞胞外诱捕网在类风湿关节炎免疫炎症中的研究进展J.风湿病与关节炎,2022,11(2):67 Rossaint J,Herter JM,Van Aken H,et al.Synchronized integrin en-gagement and chemokine activation is crucial in neutrophil extracellu-71医学研究杂志 2023 年 7 月第 52 卷第 7 期医学前沿lar trap-mediated sterile inflammationJ.Blood,2014,123(16):2573-25848 Trofimenko AS,Mozgovaya EE,Bedina SA,et al.Ambiguities inneutrophil extracellular traps.Ongoing concepts and potential biomar-kers for rheumatoid arthritis:a narrative reviewJ.Curr RheumatolRev,2021,17(3):283-2939 孟海妹,魏蔚,焦亚冲,等.血清淀粉样蛋白 A 通过 Toll 样受体4 途径诱导类风湿关节炎中性粒细胞胞外诱捕网形成J.中华风湿病学杂志,2017,21(6):610Saffarzadeh M,Juenemann C,Queisser MA,et al.Neutrophil extra-cellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death:apredominant role of histonesJ.PLoS One,2012,7(2):e3236611Fousert E,Toes R,Desai J.Neutrophil extracellular traps(NETs)take the central stage in driving autoimmune responses J.Cells,2020,9(4):91512陈本露,钱龙,李向培,等.类风湿关节炎患者血清中性粒细胞胞外诱捕网水平的检测及其意义J.中华风湿病学杂志,2015,19(2):313Khandpur R,Carmona-Rivera C,Vivekanandan-Giri A,et al.Nets are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflamma-tory responses in rheumatoid arthritisJ.Sci Transl Med,2013,5(178):178ra4014Liu X,Arfman T,Wichapong K,et al.Pad4 takes charge duringneutrophil activation:impact of pad4 mediated net formation on im-mune-mediated disease J.J Thromb Haemost,2021,19(7):1607-161715Pratesi F,Dioni I,Tommasi C,et al.Antibodies from patients withrheumatoid arthritis target citrullinated histone 4 contained in neutro-phils extracellular trapsJ.Ann Rheum Dis,2014,73(7):1414-142216Oliveira SR,de Arruda JAA,Schneider AH,et al.Are neutrophilextracellular traps the link for the cross-talk between periodontitisand rheumatoid arthritis physiopathology?J.Rheumatology(Ox-ford),2021,61(1):174-18417Yadav R,Yoo DG,Kahlenberg JM,et al.Systemic levels of anti-pad4 autoantibodies correlate with airway obstruction in cystic fibrosisJ.J Cyst Fibros,2019,18(5):636-64518Konig MF,Abusleme L,Reinholdt J,et al.Aggregatibacter actino-mycetemcomitans-induced hypercitrullination links periodontal infec-tion to autoimmunity in rheumatoid arthritis J.Sci Transl Med,2016,8(369):369ra17619Fresneda Alarcon M,Mclaren Z,Wright HL.Neutrophils in the path-ogenesis of rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus:same foe different M.OJ.Front Immunol,2021,12:64969320张慧,封昱辰,康国荣,等.中性粒细胞胞外诱捕网在类风湿关节炎致病机制中的初步探究J.中华风湿病学杂志,2019,23(5):521West AP,Shadel GS.Mitochondrial DNA in innate immune responsesand inflammatory pathology J.Nat Rev Immunol,2017,17(6):363-37522de Bont CM,Boelens WC,Pruijn GJM.Netosis,complement,andcoagulation:a triangular relationshipJ.Cell Mol Immunol,2019,16(1):19-2723Kraaij T,Kamerling SWA,de Rooij ENM,et al.The net-effect ofcombining rituximab with belimumab in severe systemic lupus erythe-matosusJ.J Autoimmun,2018,91:45-54(收稿日期:2022-05-30)(修回日期:2022-07-14)(上接第 14 页)22Vidavsky N,Kunitake JA,Chiou AE,et al.Studying biomineraliza-tion pathways in a 3D culture model of breast cancer microcalcifica-tionsJ.Biomaterials,2018,179:71-8223Velupillai P,Sung CK,Tian Y,et al.Polyoma virus-induced osteo-sarcomas in inbred strains of mice:host determinants of metastasisJ.PLoS Pathog,2010,6(1):e100073324周健,柳小平.多发性骨髓瘤患者血清骨桥蛋白及 TNF-检测的临床意义J.山东医药,2011,51(33):38-3925Zhao H,Chen Q,Alam A,et al.The role of osteopontin in the pro-gression of solid organ tumourJ.Cell Death Dis,2018,9(3):35626Melanitou E.Investigation of type 1 diabetes in NOD mice knockoutfor the osteopontin geneJ.Gene,2020,753:14478527Frenzel DF,Borkner L,Scheurmann J,et al.Osteopontin deficiencyaffects imiquimod-induced psoriasis-like murine skin inflammationand lymphocyte distribution in skin,draining lymph nodes and spleenJ.Exp Dermatol,2015,24(4):305-30728Kim J,Ahn M,Choi Y,et al.Osteopontin is a biomarker for earlyautoimmune uveoretinitis J.Neural Regen Res,2022,17(7):1604-160829Pilmane M,Skagers A.Growth factors,genes,bone proteins and ap-optosis in the temporomandibular joint(TMJ)of children with ankylo-sis and during disease recurrenceJ.Stomatologija,2011,13(3):96-10130刘桂香,赵云,曲迅,等.OPN 在口腔扁平苔藓中的表达及作用初步研究J.中国免疫学杂志,2010,26(10):923-92631Marastoni D,Magliozzi R,Bolzan A,et al.CSF levels of CXCL12and osteopontin as early markers of primary progressive multiple scle-rosisJ.Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm,2021,8(6):e108332Kitagori K,Yoshifuji H.Osteopontin in systemic lupus erythematosusJ.Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi,2017,40(2):118-12333Gordin D,Forsblom C,Panduru NM,et al.Osteopontin is a strongpredictor of incipient diabetic nephropathy,cardiovascular disease,and all-cause mortality in patients with type 1 diabetesJ.DiabetesCare,2014,37(9):2593-260034Chang IC,Chiang TI,Yeh KT,et al.Increased serum osteopontin isa risk factor for osteoporosis in menopausal women J.OsteoporosInt,2010,21(8):1401-140935Kawashiri SY,Endo Y,Nishino A,et al.Association between serumbone biomarker levels and therapeutic response to abatacept in patientswith rheumatoid arthritis(RA):a multicenter,prospective,and ob-servational RA ultrasound cohort study in JapanJ.BMC Musculo-skelet Disord,2021,22(1):50636Mehta BB,Sharma S,Vasishta RK,et al.Blocking osteopontin-fi-bronectin interactions reduce extracellular fibronectin deployment andarthritic immunopathology J.Int Immunopharmacol,2018,55:297-30537张冬梅.痹祺提取物对 CIA 大鼠滑膜增殖及软骨破坏的影响D.天津:天津医科大学,201738任继刚,王大雪,雷枭.艾灸对实验性类风湿性关节炎家兔炎症因子、骨桥蛋白及血管内皮细胞生长因子的影响J.湖南中医杂志,2021,37(7):154-156(收稿日期:2022-07-20)(修回日期:2022-08-06)81医学前沿J Med Res,July 2023,Vol.52 No.7