中国14家实验室基于同位素稀释质谱法检测人血清同型半胱氨酸水平的能力验证.pdf

195现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Sept.2023中国 14 家实验室基于同位素稀释质谱法检测人血清 同型半胱氨酸水平的能力验证黄冰1，迟晨1，蒋玉新1，洪沫1，曹冉1，崔丽1，曹云峰2（1.大连博源医学检验实验室有限公司质量部，辽宁大连 116000；2.上海市生物医药技术研究院国家卫生健康委员会计划生育药具重点实验室，上海 200032）摘要：目的评价检测实验室基于同位素稀释液相色谱串联质谱法（isotope dilution-liquid chromatography/tandem mass spectrometry，ID-LC/MS/MS)检测人血清中同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）的能力。方法采用单因素方差分析法和 t 检验法分别对能力验证样品进行均匀性和稳定性评价；由参加实验室公议值确定指定值，采用稳健算法 A 对参加实验室的回报结果进行分析，Z 比分数法对实验室检测能力进行评定。参加实验室为分布在 9 个省份 10 个城市的 14家质谱检测实验室。结果二种浓度的能力验证样品均满足均匀性和稳定性要求。14 家实验室二种浓度的 Z 比分数绝对值均在2以内，满意率为100%。结论14家实验室使用ID-LC/MS/MS法检测人血清中同型半胱氨酸的能力均为满意。关键词：同位素稀释质谱法；同型半胱氨酸；能力验证；比分数法中图分类号：Q503；R446.112文献标识码：A文章编号：1671-7414（2023）05-195-04doi:10.3969/j.issn.1671-7414.2023.05.037Proficiency Testing of Human Serum Homocysteine Levels by 14 Laboratories in China Based on Isotope Dilution Mass SpectrometryHUANG Bing1,CHI Chen1,JIANG Yuxin1,HONG Mo1,CAO Ran1,CUI Li1,CAO Yunfeng2（1.Department of Quality,Dalian Boyuan Medical Laboratory Co.Ltd.,Liaoning Dalian 116000,China；2.NHC Key Lab of Reproduction Regulation,Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies,Shanghai 200032,China）Abstract:ObjectiveTo evaluate the ability of laboratory to detect homocysteine（Hcy）in human serum by isotope dilution-liquid chromatography/tandem mass spectrometry（ID-LC/MS/MS).MethodsOne-way ANOVA and t-test were used to analyze the homogeneity and stability of proficiency testing samples,respectively.The specified values were determined from the participants communal values.The robust algorithm A was used to analyze the results of the participating laboratories,and the Z ratio score method was used to evaluate the detection ability of the laboratories.The participating laboratories were 14 mass spectrometry laboratories distributed in 10 regions of 9 provinces.ResultsThe proficiency testing samples of two concentration levels met the homogeneity and stability requirements all,and the absolute values of Z ratio fractions at both concentration levels were within 2 in all 14 laboratories,with a satisfaction rate of 100%.ConclusionThe ability of the 14 laboratories using ID-LC/MS/MS method to detect homocysteine in human serum was satisfactory.Keywords:isotope dilution-liquid chromatography/tandem mass spectrometry；homocysteine；proficiency testing；Z ratio score 同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是用于心脑血管等疾病检测的常规项目1-3，随着质谱方法的发展，使用同位素稀释液相色谱串联质谱法（isotope dilution-liquid chromatography/tandem mass spectrometry，ID-LC/MS/MS)检测 Hcy 的实验室数量也逐渐增加，各实验室间结果的可比性成为了质谱检测的主要挑战。能力验证(proficiency testing，PT)是能力验证基金项目：大连市重点研发计划(2022YF15SN063)：心脑血管疾病相关代谢物标准物质的研制及转化应用；西藏自治区自然科学基金（XZ2020ZR-ZY79(Z)）：质谱分析技术检测脑梗死患者血清同型半胱氨酸含量在高原地区的临床应用；上海市生物医药技术研究院省部级重点实验室创新能力专项资助(CX2023-04)：基于质谱技术的同型半胱氨酸代谢通路检测试剂盒的研制。作者简介：黄冰(1994-)，女，硕士，研究方向：室间质评与能力验证，标准物质研制，E-mail：。通讯作者：曹云峰(1980-)，男，博士，正高级工程师，研究方向：室间质评与能力验证，标准物质研制等，E-mail：。组织者(proficiency testing provider，PTP)组织的，利用实验室间比对，按照预先制定的准则评价参加者能力的活动。PT 对于发现检测中存在的共性及特殊问题4-8、实现不同实验室间结果互认具有重要意义8-10。基于上述背景，本单位开展基于 ID-LC/MS/MS 的“人血清中同型半胱氨酸测定能力验证”活动，对各参加实验室的结果进行评定，并提出改善建议。196现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Spet.20231材料与方法1.1实验室本研究对象为分布在 9 个省份 10 个城市的 14 家质谱检测实验室。1.2仪器与试剂液相色谱串联质谱仪（爱博才思）；微量移液器（艾本德）；磁力搅拌器（株式会社）；多管涡旋混合仪（美国莱博特）；恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；天平（上海天美天平仪器有限公司）；甲醇，乙腈(Merck)；甲酸(Sigma-Aldhich)；二硫苏糖醇(Macklin)；同型半胱氨酸(CATO)；同型半胱氨酸-D4(CIL)。1.3方法1.3.1样本采集与制备：收集健康志愿者的血清基质 150ml 用于制备能力验证样品。根据初测值将不同来源的血清基质分为高低二种浓度(样品 A，样品 B，mol/L)，分别充分混合、搅拌、静置后分装至无菌冻存管，规格为 0.5ml/支。粘贴标签后储存于-70冰箱。1.3.2样品均匀性：从样品总体中随机抽取每种浓度样品 10 个，采用 ID-LC/MS/MS 法将每个样品重复测量 2 次；为防止漂移，2 次测量按随机次序进行。参考 CNAS-GL003能力验证样品均匀性和稳定性评价指南11，采用单因素方差分析法对检验结果进行统计处理；P0.05 时认为能力验证样品 均匀。1.3.3样品稳定性：考察能力样品在冻融 1 次、-20&50 天、干冰运输 90h 3 个条件下稳定性，从每种浓度包装单元中随机抽取各条件下的样本 3个以上，采用 ID-LC/MS/MS 法将每个样品重复测量 2 次，以均匀性检验结果为第 1 次稳定性数据进行 t 检验。P0.05 时认为能力验证样品在该条件下稳定。1.3.4样品发放与检测：每个实验室随机发放 2 种浓度的样品各 1 支。样品用泡沫盒加装干冰运输，到达参加实验室后立即置于-20保存。样品开封后，各实验室应按照参试指导书要求尽快检测。1.3.5能力评定：参考 CNAS-GL002 能力验证结果的统计处理和能力评价指南12及 GB/T28043-2019利用实验室间比对进行能力验证的统计方法6进行能力评定。由参加实验室的公议值确定指定值，指定值的不确定度不可忽略时，采用能力评定统计量 Z 比分数进行能力评定。评定原则为：|Z|2 时“满意”；2|Z|3 时“可疑”；|Z|3 时“不满意”。1.4统计学分析采用单因素方差分析法和 t 检验法分别对能力验证样品进行均匀性和稳定性评价。采用格拉布斯检验法识别离群值，要求离群值的数量不超过总数量的 20%。采用稳健算法 A 计算指定值和能力评定标准差13。使用 EXCEL 编制模板，验证后完成计算。2结果2.1样品均匀性见表 1。采用单因素方差分析时，在=0.05 的检验水准下，样品 A 和样品 B 均满足均匀性要求。表 1 同型半胱氨酸均匀性检验类别SSdfMSF 值P 值结果样品 A组间1.65990.1841.0860.446均匀组内1.697100.170样品 B组间9.82591.0922.2440.112均匀组内4.864100.486注：SS：方差平方和；df：自由度；MS：均方。2.2样品稳定性见表 2。采用 t 检验时，在=0.05 的检验水准下，样品 A 和样品 B 在稳定性检验条件下均满足稳定性要求。表 2 同型半胱氨酸稳定性检验类别nC0C1t 值P 值结果样品 A冻融一次1413.5913.430.9780.335稳定-20&50 天613.5913.510.4260.674稳定模拟运输1213.5913.530.3380.737稳定样品 B冻融一次1436.2035.960.6960.491稳定-20&50 天636.2035.581.4760.153稳定模拟运输1236.2036.180.0420.966稳定注：n：稳定性数据个数；C0：第 1 次稳定性均值；C1：某稳定性条件均值。2.3能力验证结果回报结果的 14 家参加实验室反馈结果良好，没有粗大误差和异常值，参加实验室结果统计量结果见表 3；能力评定统计量见表 4。根据能力评定原则，参加实验室二种浓度检测结果均为满意，满意率为 100%。3讨论由于时效、经济、方法学要求、指标适用范围、信息不畅等原因，部分实验室参加 PT 活动的可及197现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Sept.2023性较差14。培养有能力在 ISO/IEC 17043 体系运行下，组织部分常规项目 PT 活动的 PTP，可有效缓解临床检验中心压力、增加检测实验室参加频次、保障患者权益15-17。表 3 参加实验室结果统计量汇总统计量样品 A 样品 B 结果数(个)1414指定值(mol/L)12.4034.63能力评定标准差(mol/L)1.283.99指定值的不确定度(mol/L)0.431.34变异系数(%)10.3211.52最小值(mol/L)10.2828.48最大值(mol/L)13.8240.97极差(mol/L)3.5212.49满意率100%100%表 4 能力评定统计量实验室代码样品 A样品 B结果(mol/L)比分数结果(mol/L)比分数L00110.27-1.5731.43-0.76L00213.801.0340.971.50L00312.690.2133.86-0.18L00413.821.0537.250.62L00611.87-0.3932.55-0.49L00813.490.8037.310.64L00911.05-1.0030.72-0.93L01011.98-0.3134.890.06L01112.740.2535.850.29L01213.350.7038.660.96L01312.37-0.0232.88-0.42L01413.570.8638.540.93L01511.52-0.6528.48-1.46L01610.89-1.1231.66-0.71明确要求同位素稀释液相色谱串联质谱法（ID-LC/MS/MS)是本轮 PT 的一大创新，也是对现有需求缺口的补充18-19。本轮 PT 参加实验室数量和实际回报结果数量均较少，数量不足容易产生极端能力评定结果，使能力验证效力下降14,20，为PTP 组织 PT 带来了极大的挑战。经综合分析，参加实验室数量较少的原因有以下 4 条：质谱法在医学检验界的应用有待普及；参加实验室对 PT活动的重要性认识不够；PTP 组织 PT 活动的经验不足；参加实验室对非政府性质 PTP 的信任度不够。针对上述问题，PTP 需要优化专业人才布局，在PT活动运行中不断积累经验，提升自己的技能，如改进质量管理体系、保证计划运作质量、提供更专业的指导意见等。此外可借力权威平台如中国合格评定国家认可委员会（China National Accredita-tion Service for Conformity Assessment，CNAS）机构、研究院等，加大对外宣传力度，提高 PTP 知名度，使各实验室认识到 PT 的重要性。参加实验室使用 ID-LC/MS/MS 法检测人血清中同型半胱氨酸的满意率为 100%。在排除偶然因素后对各实验室的原始记录进行分析，发现部分实验室存在色谱峰未保留的情况；虽然未对评定结果造成影响，但变异度较高，因此仍建议实验室选择合适的色谱柱和洗脱条件，以保证 Hcy 具有适宜的保留时间，实现杂质分离。参考文献：1 苏艳红,郑红梅,郭旭,等.高同型半胱氨酸血症对慢性稳定性冠状动脉粥样硬化性心脏病患者肾功能的影响 J.中国医科大学学报,2017,46(7):600-603,608.SU Yanhong,ZHENG Hongmei,GUO Xu,et al.Hyperhomocysteinemia promotes renal function impairment in patients with chronic stable coronary artery disease J.Journal of China Medical University,2017,46(7):600-603,608.2 赵佳,左林,姚创利,等.锰超氧化物歧化酶基因变异与血脂和同型半胱氨酸水平的关系研究 J.现代检验医学杂志,2016,31(3):12-15.ZHAO Jia,ZUO Lin,YAO Chuangli,et al.Study on the relationship between manganese superoxide dismutase gene variants and the levels of blood lipid and homocysteineJ.Journal of Modern Laboratory Medicine,2016,31(3):12-15.3 李东晓,张尧,张宏武,等.高同型半胱氨酸血症的诊断、治疗与预防专家共识 J.罕少疾病杂志,2022,29(6):1-4.LI Dongxiao,ZHANG Yao,ZHANG Hongwu,et al.The expert consensus on the diagnosis,treatment,and prevention of hyperhomocysteinemia J.Journal of Rare and Uncommon Diseases,2022,29(6):1-4.4 中华人民共和国国家卫生健康委员会.医疗机构检查检验结果互认管理办法 J.中国实用乡村医生杂志,2022,29(4):3-5.National Health Commission of the Peoples Republic of China.Administrative measures for mutual recognition of examination and inspection results of medical institutionsJ.Chinese Practical Journal of Rural Doctor,2022,29(4):3-5.5 国家市场监督管理总局,国家标准化管理委员会.GB/T 28043-2019/ISO 13528:利用实验室间比对进行能力验证的统计方法 S.北京：中国标准出版社,2019.State Administration for Market Regulation,Standardization Administration.GB/T 28043-2019/ISO 198现代检验医学杂志第 38 卷第 5 期2023 年 9 月J Mod Lab Med,Vol.38,No.5,Spet.202313528:Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparison S.Beijing:China Standard Publishing House,20196 李育敏,阚丽娟,张水兰,等.荧光定量 PCR 测定HBV DNA 室间质评结果的回顾分析 J.现代检验医学杂志,2019,34(2):153-155,159.LI Yumin,KAN Lijuan,ZHANG Shuilan,et al.Retrospective analysis on results in external quality assessment of HBV DNA determination by fluorescence quantitation PCRJ.Journal of Modern Laboratory Medicine,2019,34(2):153-155,159.7 郭华,孙晶晶,王晋平.现场技术审核对 PCR 实验室质量管理的影响分析 J.现代检验医学杂志,2020,35(5):164-167.GUO Hua,SUN Jingjing,WANG Jinping.Analysis of the influence of field technical audit on PCR laboratory quality managementJ.Journal of Modern Laboratory Medicine,2020,35(5):164-167.8 李全双,许靖,吴燕,等.朗道血清质控品作为ELISA 法检测血清可溶性 ST2 室内质控物的可行性探讨 J.现代检验医学杂志,2022,37(5):190-193.LI Quanshuang,XU Jing,WU Yan,et al.Feasibility study on RANDOX serum quality control products as ELISA method to detect serum soluble ST2 internal quality control materialsJ.Journal of Modern Laboratory Medicine,2022,37(5):190-193.9 中国合格评定国家认可委员会.CNAS-CL03:2010:能力验证提供者认可准则 S.北京:中国计量出版社,2010.China National Accreditation Service for Conformity Assessment.CNAS-CL03:2010:Accreditation criteria for proficiency testing providersS.Beijing:China Metrology Press,2010.10 苗玉发,张河战.43 家食品药品检测机构实验室检测 6 项生化指标能力验证评价 J.现代检验医学杂志,2018,33(3):158-161.MIAO Yufa,ZHANG Hezhan.Proficiency testing evaluation on determination of 6 biochemical indices in 43 Chinese laboratories of food and drug control institutionsJ.Journal of Modern Laboratory Medicine,2018,33(3):158-161.11 中国合格评定国家认可委员会.CNAS-GL003:2018:能力验证样品均匀性和稳定性评价指南 S.北京:中国计量出版社,2018.China National Accreditation Service for Conformity Assessment.CNAS-GL003:2018:Guidaneeon evaluating the homogeneity and stability of samples used for proficiency testing S.Beijing:China Metrology Press,2018.12 中国合格评定国家认可委员会.CNAS-GL002:2018:能力验证结果的统计处理和能力评价指南S.北京:中国计量出版社,2018.China National Accreditation Service for Conformity Assessment.CNAS-GL002:2018:Guidance on statistic treatment of proficiency testing results and performance evaluation S.Beijing:China Metrology Press,2018.13 王继荣,王子亮.稳健统计方法在实验室能力验证中的应用 J.质量与认证,2022(2):75-77.WANG Jirong,WANG Ziliang.Application of robust statistical methods in laboratory proficiency testing J.China Quality Certification,2022(2):75-77.14 刘运峰,赵华,刘原栋,等.提高能力验证计划参与实验室数量的思考 J.中国检验检测,2020,28(1):58-60.LIU Yunfeng,ZHAO Hua,LIU Yuandong,et al.Thinking about increasing the number of laboratories involved in the proficiency testing scheme J.China Inspection Body&Laboratory,2020,28(1):58-60.15 张梅芳.第三方检测机构的现状与发展探讨 J.现代工业经济和信息化,2011,1(10):11-12,81.ZHANG Meifang.A discussion of the status and development of third-party testing agency J.Modern Industrial Economy and Informationization,2011,1(10):11-12,81.16 席静,张思群,刘静宇,等.论能力验证活动对实验室能力建设的作用和意义 J.中国卫生检验杂志,2011,21(6):1576,1578.XI Jing,ZHANG Siqun,LIU Jingyu,et al.On the role and significance of proficiency testing activities for laboratory capacity buildingJ.Chinese Journal of Health Laboratory Technology,2011,21(6):1576,1578.17 苏志明,孙晓辰,闫爽,等.CNAS 认可的检测实验室的分类监管核查指标体系研究 J.理化检验:化学分册(乙部:化学分析),2023,59(3):342-349.SU Zhiming,SUN Xiaochen,YAN Shuang,et al.Research on verification index system of classification supervision of testing laboratories accredited by CNAS J.Physical Testing and Chemical Analysis(Part B:Chemical Analysis),2023,59(3):342-349.18 黎明阳,黎志轩.等离子体发射光谱串联质谱相对拟合法检测水中金属元素 J.中国卫生检验杂志,2021,31(3):270-275.LI Mingyang,LI Zhixuan.Detection of metal elements in water by inductively coupled plasma mass spectrometry-relative fitting method J.Chinese Journal of Health Laboratory Technology,2021,31(3):270-275.19 曹正,李水军,沈敏,等.液相色谱串联质谱临床检测方法的开发与验证 J.检验医学,2019,34(3):189-196.CAO Zheng,LI Shuijun,SHEN Min,et al.Development and validation of clinical detection method by liquid chromatography tandem mass spectrometryJ.Laboratory Medicine,2019,34(3):189-196.20 任春香,王新,郑蓓.低数量参加者的能力验证结果评价-以水中铅和亚硝酸盐(以氮计)检测为例 J.卫生研究,2021,50(4):653-659.REN Chunxiang,WANG Xin,ZHENG Bei.Evaluation of proficiency test with low number of participants:a case study on the testing of Lead and nitrite in waterJ.Journal of Hygiene Research,2021,50(4):653-659.收稿日期：2023-03-28修回日期：2023-08-01