植物单宁构筑的水凝胶材料及其生物医药应用.pdf

第 57 卷第 4 期2023 年 7 月生 物 质 化 学 工 程Biomass Chemical EngineeringVol.57 No.4July 2023 收稿日期:2022-12-12 基金项目:中国林业科学研究院优秀青年创新人才项目(CAFYBB2020QB007);江苏省生物质能源与材料重点实验室基本科研业务费(JSBEM-S-202209)作者简介:胡新宇(1986),男,吉林吉林人,副研究员,博士,研究领域:天然产物基高分子功能材料;E-mail:。doi:10.3969/j.issn.1673-5854.2023.04.001特邀专论 生物质材料植物单宁构筑的水凝胶材料及其生物医药应用胡新宇(中国林业科学研究院 林产化学工业研究所;江苏省生物质能源与材料重点实验室;国家林业和草原局林产化学工程重点实验室;林木生物质低碳高效利用国家工程研究中心;江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心,江苏 南京 210042)摘 要:植物单宁在自然界中的储量非常丰富,其分子结构中含有的大量酚羟基易于化学修饰;同时,单宁具有较强的抗氧化、抗病毒和抗肿瘤等生物活性,对细菌和酶具有显著的抑制作用。为研究植物单宁在生物医药材料领域的利用范围,本文综述了单宁基水凝胶的研究进展及其在组织工程、药物输送和伤口敷料领域的潜在应用,并对材料的工业化制备方法进行了总结与概括。首先详细介绍了不同类型单宁基水凝胶的设计策略和形成机理,特别对单宁的分子结构、生化特性在水凝胶构筑过程中所起的作用进行了深入分析;然后对水凝胶的具体应用以及最新的研究热点进行了阐述;最后探讨了这类材料目前的局限性并对未来规模化的工业生产前景进行了展望。关键词:植物单宁;水凝胶材料;组织工程;药物输送;伤口敷料中图分类号:TQ35文献标志码:A 文章编号:1673-5854(2023)04-0001-16引文格式:胡新宇.植物单宁构筑的水凝胶材料及其生物医药应用J.生物质化学工程,2023,57(4):1 16.P Pl la an nt t T Ta an nn ni in n-b ba as se ed d H Hy yd dr ro og ge el l M Ma at te er ri ia al ls s a an nd d T Th he ei ir r B Bi io om me ed di ic ca al l A Ap pp pl li ic ca at ti io on ns sHU Xinyu(Institute of Chemical Industry of Forest Products,CAF;Key Lab.of Biomass Energy and Material,Jiangsu Province;Key Lab.of Chemical Engineering of Forest Products,National Forestry and Grassland Administration;NationalEngineering Research Center of Low-Carbon Processing and Utilization of Forest Biomass;JiangsuCo-Innovation Center of Efficient Processing and Utilization of Forest Resources,Nanjing 210042,China)Abstract:Plant tannins were very rich in nature,and a large number of phenolic hydroxyl groups contained in their molecularstructure were easy to be chemically modified.At the same time,tannins had strong antioxidant,antiviral,antitumor and otherbiological activities,and had a significant inhibitory effect on bacteria and enzymes.In order to study the application of planttannins in the field of biomedical materials,this article reviewed the research progress of tannin-based hydrogels and theirpotential applications in the fields of tissue engineering,drug delivery,and wound dressing,and the industrial preparationmethods of materials were also summarized.Firstly,the design strategies and formation mechanisms of different types of tannin-based hydrogels were introduced in detail.In particular,the role of molecular structure and biochemical properties of tannins inthe construction process of hydrogels were analyzed deeply.The specific application of hydrogels and the latest research hotspotswere then elaborated.Finally,the current limitations of these materials were discussed,and the prospects of large-scaleindustrial production in the future were highlighted.Key word:plant tannin;hydrogel material;tissue engineering;drug delivery;wound dressing植物单宁是植物体内的多酚类次生代谢产物,广泛地存在于植物的根、叶、树皮和果实等部位中。植物单宁的分子质量为 500 3 000,易溶于水、醇、酮溶剂中,不溶于醚、氯仿等大部分的有机溶剂。在化学性质方面,单宁的多酚羟基结构赋予其独特的化学性质,能与蛋白质、多糖、生物碱反应,与多种金2 生 物 质 化 学 工 程第 57 卷属离子络合形成稳定的螯合物;在生物活性方面,单宁具有较强的抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等特性,对细菌和酶具有显著的抑制作用,并对某些农作物病虫害呈现出较强的抵抗性。这些性质使单宁的应用领域非常广泛,涉及到医药、食品、化工、农业、环境等领域,可被用作抑菌剂、抗肿瘤药物、抗氧化剂、防腐剂、黏合剂以及水处理剂等1-3。然而,由于单宁为无定形物,且能溶于水,单独使用时存在分离过程复杂并难于回收再生的问题。单宁固化材料的出现,有望解决这些问题。近十多年来,国内外学者从不同角度开展了单宁固化材料的基础制备和应用研究。其中最引人瞩目的是单宁基凝胶材料的研究工作,其重要意义在于充分利用这类可再生的天然产物获得了一系列性能特殊、在生物医药、环境保护以及食品加工等领域具有广阔应用前景的功能高分子材料,极大地提高了单宁的利用价值4-5。水凝胶材料是由高分子聚合物通过非共价键的物理结合或共价的化学交联而得到的三维网络。由于具有大量的亲水性基团,水凝胶对水或生物流体具有很高的亲和力,能够溶胀吸收自身体积几十倍甚至上千倍的液体,在外界压力下仍然具有很好的保持能力;同时,水凝胶具有良好的理化性质和生物相容性,其柔软和橡胶般的稠度与胞外基质具有高度的相似性,这些性质使得水凝胶非常适合应用于生物医药领域,特别是在组织工程、药物递送以及伤口敷料方面。植物单宁的固有特性,包括与多种蛋白的结合能力、抗氧化性、抗菌性、可再生性、生物降解性以及生物相容性,使其非常适合水凝胶的制备6-8。本文综述单宁基水凝胶的制备方法(包含成胶机理)及其作为细胞模块、药物载体和伤口敷料的应用现状,以期为植物单宁在生物医药领域中的应用提供参考。1 单宁基水凝胶材料的制备方法1.1 概述根据单宁的化学结构特征(图 1),可将其分为水解单宁和缩合单宁两大类。水解单宁是没食子酸及其衍生物通过酯键与多个酚羟基相连而成的大分子,主要以多元醇为核心,在酸、碱、酶等作用下容易水解,生成小分子单体。缩合单宁主要为聚黄烷醇类多酚或原花色素,即羟基黄烷醇类单体的组合物,单体间以碳碳键的形式相连,不易水解,在强酸条件下缩合成不溶于水的物质。两类单宁的不同特性可以为凝胶材料的制备提供更多的选择,根据反应环境和成胶机理设定功能单体的类型9-10。总体来看,水解单宁和缩合单宁在分子结构上具有的共性对凝胶材料的设计与合成产生了重要影响,包括数目众多的酚羟基数量、高活性的邻位羟基以及分布较宽的分子质量。基于上述性质,单宁基水凝胶材料的制备方法可分为交联法和共混法。利用交联法形成的单宁基凝胶网络主要是通过小分子单体的不饱和键与交联剂之间的自由基聚合反应而产生的,并且形成永久共价键,所得凝胶具有较为紧密的网络结构。共混法形成的单宁基凝胶网络在制备过程中无需使用交联剂,形成的连接点是由动态的非共价键组成。凝胶网络由物理缠绕形成,并依靠离子、氢键、疏水缔合或静电作用等相互作用力维持凝胶网络的稳定性。由于共混连接作用比化学交联作用弱很多,破坏共混连接所需消耗的能量较低,其承受张力、压力和剪切力的能力也相对较差。单宁基水凝胶的制备方法、成胶机理和所得凝胶材料的各种性能均有显著差异,这些方面对其在生物医药领域的应用也具有重要影响11-12。利用交联法制备的单宁基水凝胶通常以单宁作为基质,其它参与反应的小分子单体通过自由基聚合等方式形成高分子聚合物,凝胶的三维网络主要以化学键的形式交联而形成。由于共价键结合能力较强,所形成的三维网络结构更为牢固,在机械性能方面具备稳定性和持久性。相比与共混连接的物理作用力,化学交联的聚合物链之间将产生强有力的共价键,外界环境的变化不容易使其网络结构发生变形和松散。除此之外,形成凝胶的过程一般也不可逆。制备单宁基水凝胶常用的方法有共聚物互穿网络法、冷冻聚合法、胶束微相-光交联法、磁性纳米粒子置入法以及单宁-大分子物质共混法。第 4 期胡新宇:植物单宁构筑的水凝胶材料及其生物医药应用3 图 1 不同种类的植物单宁Fig.1 Different kinds of plant tannins1.2 共聚物互穿网络法互穿聚合物网络(IPN)为两个或多个独立聚合物网络的混合物,通过这些聚合物各自交联后所得的网络连续地相互穿插而成。反应过程为可聚合单体通过分步或分别聚合,进而形成网络并相互缠结。当只有一种聚合物交联,而另一种聚合物以线性形式保留,这称为半互穿聚合物网络(semi-IPN)结构。semi-IPN 是通过将聚合物链扩散到预成型的聚合物网络中来合成的。在 IPN 或 semi-IPN 结构中,每种聚合物存在各自的相,相分离的微区尺寸一般在几十到一百纳米之间,其相互之间并未发生化学键结合。这两种结构均不同于相容的共混物,不同聚合物网络存在着“强迫相容”效应,可以使具有不同功能或性能差异很大的聚合物通过相互作用形成稳定的结合,以此实现不同聚合物网络之间的性能互补。同时,其双相连续和界面互穿的特征可以有效地降低不同聚合物网络之间的宏观相分离程度,最大程度保留每个聚合物各自的特点,并在功能上产生特殊的协同作用6,13。单宁作为天然大分子产物存在着性质偏软的问题,单独用来制备水凝胶将会导致体系的力学性能较差;而传统的合成类水凝胶(例如聚丙烯酰胺水凝胶、聚丙烯酸水凝胶等)具有较为理想的机械强度,但是缺点则是孔结构过于致密、生物相容性较差且不易降解,材料对于外部环境的响应缓慢且缺乏生物活性,导致体系不具备细胞识别信号,不适于活性物质和细胞的负载13。利用 semi-IPN 技术,以单宁作为线性聚合物,合成高分子聚合物作为网络基质,通过穿插或缠绕所形成的凝胶可以弥补单宁和合成类水凝胶各自的缺陷。主要包括两种方法:分步法和同步法。分步法是指利用分步合成的方法制4 生 物 质 化 学 工 程第 57 卷备单宁基 semi-IPN 水凝胶,将单宁置于由单体、引发剂、加速剂和交联剂等组成的混合溶液中,单体经过引发剂作用,在单宁溶液中发生聚合及交联反应,形成单宁基 semi-IPN 水凝胶,也称作顺序型 semi-IPN 水凝胶。由于单宁在聚合物网络形成前已经充分形成了水溶液,因此制得的 semi-IPN 水凝胶具有宏观上均一的组成。同步法是指利用同步合成的方法制备单宁基 semi-IPN 水凝胶,在合成过程中,单宁与单体、引发剂、加速剂和交联剂先配制成混合溶液,采用互不干涉的聚合机理进行反应使单体发生聚合和交联。IPN 或 semi-IPN 聚合物共混物体系可以看成是由化学方法实现的机械共混物,单宁作为线性聚合物,与聚合物网络基质之间没有化学键连接。这类聚合物共混物一般为微观复相体系,其结构会随着组分含量的变化而发生相的逆转。在单宁基 semi-IPN 水凝胶体系中存在着 3 种区域结构:线性单宁相区、网络聚合物相区和两相之间的界面层。单宁与聚合物的相互缠绕及穿插、两个独立相区的交合主要在界面层中发生,这对水凝胶的力学性能有着决定性的影响。这种相互缠绕及穿插是超分子水平的相互贯穿,并非单纯的分子水平上的相互作用。单宁与聚合物的组成比、交联密度以及混溶性将极大影响两相之间的相互贯穿情况、相畴的大小以及界面层的连续性。单宁和聚合物以超分子方式形成极为紧密的高分子“合金”结构,其特有的“强迫式”相互作用使单宁和聚合物形成稳定的共混物,由此实现两种组分之间功能或性能的互补。单宁分子链穿插到合成高分子聚合物的网络中形成的 semi-IPN结构将产生牢固的界面结合,使两者在宏观性能特别是机械强度方面产生特殊的协同作用。此外,semi-IPN 水凝胶的蜂窝状孔结构使相界面互穿和双相连续等形态特征具备更强的可识别性,为这类材料后续在生物医药领域的应用提供了技术基础14。基于上述特点,互穿聚合物网络法近年来逐渐成为制备单宁基水凝胶的热点方法。作为一种天然生物质材料,植物单宁特有的邻苯三酚羟基和邻苯二酚羟基不仅可以有效绑定细胞黏附所需的核心蛋白,还能够与水溶液中的多种金属离子按照其水合半径的大小发生不同程度的络合反应。利用含时密度泛函理论可计算出络合能力最高的金属离子;此外,单宁分子结构中的酚羟基均向面外分布,有效减小了与金属离子络合反应的空间位阻,有助于提高络合物的稳定性15-16。这些结构特征使单宁非常适合作为互穿聚合物网络法的功能单体,使两种或多种具有不同功能的聚合物通过 IPN 或 semi-IPN 方式结合,从而实现这些性能差异很大的聚合物之间的互补。另外,界面互穿、双相连续等结构形态特征可以有效地降低不同聚合物之间的宏观相分离程度,在各自特点得以保留的基础上达到性能和功能方面的协同、促进效果。由于 IPN 是相互交联组分之间的混合,材料本身对环境具有更好的稳定性,并对后续在组织工程方面的应用起到重要作用。1.3 冷冻聚合法冷冻聚合是在聚合体系冰点以下温度进行的聚合反应(图 2)。通过冷冻聚合,单体在以低温凝固的溶剂作为致孔剂的情况下形成具有多孔性的高分子结构。当含有单体、溶剂和引发剂的混合物在低温下凝固后,溶质分子(引发剂和单体)从结冰的溶剂中排出,在冰晶之间没有结冰的一些小区域富集。这些区域被称作“微相区域”。聚合反应在微相区域内进行,当冰晶融化之后就可以得到具有大孔隙的材料。低温微相冷冻聚合制备出的冻凝胶在生物反应器、组织工程、酶的固定和水的纯化等方面的用途日益重要。与其它聚合方法相比,冷冻聚合技术合成的冻凝胶具备以下优势:1)制备过程高效、简洁、环保。技术实施的条件温和,反应时间短,可在1 h 内完成。技术实施工艺简单、产物无需经特殊的后处理工序,反应原料经冷冻后置于低温环境即可进行聚合,聚合热量容易散去。运用该方法制备多孔水凝胶的过程中无需添加任何助剂故不存在致孔剂残留的问题;2)凝胶的吸水溶胀速率大幅度提高。低温微相冷冻聚合技术的使用,使得凝胶内部孔结构比表面积增大,溶胀平衡可在几分钟内完成,吸水量为自身质量的数百到上千倍;3)凝胶的机械性能显著提升。冻凝胶的大孔结构有利于凝胶更大范围的形变。在聚合过程中由于非冻结区域的面积较小,使得这一区域的“表面积-体积比”较高,反应物聚集在此完成聚合反应后,冻凝胶的孔壁由密度更高的聚合物组成,因此冻凝胶在承受高压时仍然能够恢复原状6,17。第 4 期胡新宇:植物单宁构筑的水凝胶材料及其生物医药应用5 图 2 冷冻聚合过程Fig.2 Cryopolymerization process在单宁基水凝胶体系中,由于是在高温环境下进行的聚合反应,聚合初期的自由基寿命极短、浓度较稀,单宁大分子的多酚羟基对于含氧类自由基的吞噬效率极高。随着聚合中期酚羟基浓度以及黏度的进一步增大,仅存的分散自由基被包裹,自由基活动受阻,双基终止困难,链终止速率常数下降,最后导致增长速率常数大幅下降至零,聚合反应无法顺利完成。利用冷冻聚合法可以彻底解决此问题,使单宁的含氧类自由基的活性在聚合过程中不被多酚羟基所抑制。当温度降至 0 以下时,水凝结成冰晶,而单宁、小分子不饱和单体、引发剂和交联剂从冰晶中被挤压出来,聚集在冰晶之间未冻结的微相区域中继续进行反应。该“微相区域”是整个聚合过程最重要的一部分,在此区域中,引发剂产生的硫酸根自由基的浓度可以瞬间集中到最大值,而单体的浓度也是已知的。根据聚合动力学模型的聚合速率模型建立微观动力学方程,将自由基以及单体浓度代入即可计算出初期聚合速率。另外,初期聚合速率与体系黏度遵循 Arrhenius 方程,可以计算出低温聚合和高温聚合引发剂分解自由基的活化能,根据两项数据的差异定性分析出单宁的酚羟基对于硫酸根自由基的吞噬效率。在利用冷冻聚合技术制备水凝胶的过程中,最重要的一点是单宁、小分子不饱和单体以及交联剂所构成溶液应在凝胶未形成之前被冻住形成冰晶,只有在这种情况下,聚合反应才能在微相区域中进行,形成的凝胶才能具备连续的大孔结构。如果凝胶在溶剂冻结之前就已经形成,冰晶将会在已形成的凝胶内部生成,导致内部的孔结构出现断裂、不均匀以及不连续的现象,继而导致凝胶的吸水率下降、溶胀平衡时间过长、凝胶系统的压缩模量降低、应变强度变弱。为避免这种情况发生,需要在实验中设定不同的冷冻聚合温度,并探索出最佳条件18-20。利用冷冻聚合方法的主要机制是建立低温微相聚合的环境。这是因为在高温聚合中,植物单宁的多酚羟基对含氧类自由基的吞噬效率极高,聚合无法顺利完成21。利用该方法,以板栗苞单宁、化香果单宁、五倍子单宁等水解或缩合单宁为主要原料构建冻凝胶体系,有效解决了多酚羟基对含氧类自由基吞噬率极高这一“卡脖子”问题。同时,植物单宁构筑的三维大孔结构将细胞培养与监测同步进行的理念引入到体系中,对细胞在凝胶内部黏附、增殖的响应行为进行高通量、实时监测,为细胞与单宁类凝胶材料的相互作用研究提供了新型技术手段。1.4 胶束微相-光交联法胶束微相是指表面活性剂分子的疏水部分相互吸引,缔合在一起,所形成的缔合体胶团内部的反应区域(图 3)。表面活性剂分子包括亲水头端和亲脂尾端。其中,露于外部的亲水头端能够与极性水分子发生作用,并对胶束内部的反应体系产生保护作用;聚于胶束内部的亲脂尾端则避免与极性的水分子接触。光交联法是高分子化合物光化聚合反应的一种。在光照条件下,化合物发生光解作用并生成游离基等活化分子,其相互键合导致高分子链形成网状结构。当光聚合反应在胶束微相中进行时,由于胶束微相区域的“表面积-体积比”较高,自由基的相对浓度也较高,聚合反应可高效、快速完成。胶束微相-光交联聚合所制备的凝胶具备以下优势:1)制备过程绿色、环保。技术实施的条件温和,反应时间短,可在 10 min 内完成。反应过程中无需添加任何助剂故不存在致孔剂残留的问题;2)凝胶聚合度大幅提高。胶束微相区域内部自由基相对浓度极高,远高于吞噬体的浓度,可保证聚合的完整性;3)凝胶的机械性能显著提升。在聚合过程中,反应物聚集胶束微相区域内,聚合完成后,凝胶的孔壁6 生 物 质 化 学 工 程第 57 卷由密度更高的聚合物组成,凝胶可承受更高的力22-23。图 3 胶束微相-光交联过程Fig.3 Micellar microphase-photocrosslinking process聚合反应开始前,非离子表面活性剂如月桂醇聚氧乙烯醚(BRIJ35)分子聚集形成胶束团从而产生微相反应区域。该区域是整个聚合过程最重要的一部分,在此区域中,光引发剂产生自由基的相对浓度极高,可趋于最大值。另外,初始酚羟基的浓度也是已知的。对于直接光引发的聚合反应需要建立自由基聚合微观动力学模型,并计算初期聚合速率。当没有胶束微相形成时,聚合初期引发剂产生自由基的浓度较为分散,线性拟合计算出平均浓度之后,可计算出初期聚合速率。再利用 Arrhenius 活化能公式计算出光引发剂分解自由基的活化能,通过不同数据的差异性可定性分析出单宁酚羟基对于自由基的吞噬效率。在胶束微相-光交联聚合反应中,胶束的浓度以及紫外光波长对于微相区域的形成有着至关重要的影响。通过单一变量控制实验,可确定最佳的胶束浓度以及紫外光波长。在聚合过程中,由于微相区域的面积较小,使得这一区域的“表面积-体积比”较高,反应物聚集在此完成聚合反应后,凝胶的孔壁由密度更高的聚合物组成,能够承受更高的压力。这种制备方法也彻底解决了利用光引发剂制备的传统光交联型单宁水凝胶存在的最大问题 单宁多酚羟基对于含氧类自由基的吞噬效率极高。聚合反应初期的自由基寿命极短、浓度较稀,随着聚合中期酚羟基浓度以及黏度的进一步增大,自由基分散在整个反应体系中,极易被高浓度的酚羟基所包裹。这使得自由基活动受阻,双基终止困难,链终止速率常数下降,最后导致增长速率常数大幅下降至零,聚合反应因此终止,无法达到更高的聚合度。胶束微相体系的利用,可以最大程度的降低多酚羟基对含氧类自由基活性的抑制、吞噬程度,确保光交联聚合反应的顺利完成。胶束微相-光交联聚合方法近年来逐渐成为制备生物质高分子材料的热点方法,植物单宁在该方法所建立的体系中,特别是在胶束微相环境中,其本身的酚羟基对光自由基活性有重要影响,进而影响到材料后续作为生物材料的应用24。在机理研究方面,体外细胞与植物单宁光交联体系的相互作用是一个核心问题。从细胞角度看,细胞表面的电荷、亲疏水性、运动方向和活力会影响细胞与材料的相互作用。从单宁基水凝胶角度看,材料本身为细胞生长提供一个三维空间,细胞在此环境中获得营养物质后进行黏附并排出代谢废物,其后按照预先设计的支架形状生长与增殖。面对这样一个复杂过程,建立以植物单宁这种天然生物质材料作为支架模型,抽丝剥茧逐步揭示胶束微相-光交联聚合反应的机理。1.5 磁性纳米粒子置入法磁性水凝胶是一类具有“磁场响应”功能的高分子材料。在外加磁场作用下,磁性水凝胶的体积可发生明显的膨胀或收缩。其作用机制主要为“开-关”模式和热敏原理。“开-关”模式:当水凝胶置于磁场中时,磁性粒子彼此间的吸引力导致其聚集,进而使水凝胶孔径减少、体积发生变化,反之,当磁场关闭时,水凝胶又会恢复到原来的状态。热敏原理:当水凝胶置于磁场中时,由于磁性粒子的磁热作用使第 4 期胡新宇:植物单宁构筑的水凝胶材料及其生物医药应用7 材料局部温度上升,导致材料膨胀或收缩,反之,当磁场关闭时,材料体积还原。磁性单宁水凝胶的作用机制对细胞命运的调控是通过凝胶本身的微孔结构来实现的。通常,毫米到微米级尺寸的孔结构可诱导细胞排列,几十纳米到几百纳米尺度的孔结构对细胞的粘附具有明显影响,而纳米到亚纳米尺度的结构材料则可作用于细胞的表面受体。这些调控作用来自于材料的“物理特性”而非“化学特性”,这使得人们对细胞与材料相互作用有了一个全新的认识,对于其机理的揭示以及实现工程化细胞的应用具有非常重要的意义25-26。目前研究较多的磁性单宁水凝胶是由磁性粒子和小分子单体聚合而成。这种方法制备的磁性水凝胶存在着以下的问题:1)凝胶制备过程中采用毒性的热聚合加速剂,未反应的溶液对环境有较大污染;2)磁性粒子沉降在凝胶底部或脱离凝胶体系,材料的磁性分布不均匀;3)凝胶的力学性能差,压缩模量、储能模量以及应变能力较低。第一个问题主要由合成方法所限制。而导致后两个问题出现的原因则是磁性粒子在聚合过程中随机分布在反应液中,与高分子聚合物之间仅存在微弱的分子间作用力,并没有化学键产生。另外,凝胶的微孔结构使得纳米尺寸的磁性粒子极易出现沉降,而当凝胶浸泡在液体环境中时,这些粒子将会从网状结构中分散到液体中。由此可见,如何建立一个绿色无污染的反应体系,从中构建磁性粒子与高分子聚合物之间的作用力,是一个具有探索性和挑战性的问题。自组装是指原子、离子、分子或更大尺度的物质通过非共价键相互作用自发组织或聚集为一个稳定、具有一定规则几何外观的结构。这一过程并不是基本结构单元之间相互作用力的简单叠加,而是通过协同效应组装形成一个紧密而又有序的整体。与传统热聚合相比,自组装技术简便易行,无须特殊装置,通常以水为溶剂,具有环境友好,无溶剂挥发,生产效率高,适应性广,成本低,能耗低等优点27。植物单宁的多个邻位酚羟基络合能力强、所形成的络合物稳定,因此可作为一种多基配体与磁性粒子包括 Fe2+、Fe3+等发生络合反应,形成稳定的五元环螯合物。这种络合作用可以维持磁性粒子在整个反应体系中的稳定性,确保反应完成后没有磁性粒子游离于反应体系之外28。相比于其它生物质原料,植物单宁对磁性粒子的超强络合能力在磁性复合水凝胶的构筑机制中起决定性作用。当磁性粒子引入到水凝胶聚合物网络以后,对单宁聚合物的热稳定性有非常明显的提升。以四氧化三铁为例,首先,单宁对铁离子具有极强的络合能力;其次,纳米粒子本身的高“表面积-体积比”对单宁聚合物均相体系产生异质性影响,导致分子链片段重排,并降低在热分解中的松弛程度。最后,壳核结构的磁性粒子使单宁聚合物获得“磁场响应”特性29-30。在外加磁场中,磁性粒子的空间震动作用产生排直效应,进一步导致体系分子链出现松弛。这种热稳定性的提升,对于生物材料至关重要。众所周知,严重的刀伤、术后伤口会引起发烧,伤患部分的组织细胞严重受损。磁性单宁基水凝胶材料可以有效的缓解这一问题,组织细胞可展现出极高的绿色荧光密度,使新生细胞存活率大幅提高。1.6 单宁-大分子物质共混法图 4 单宁-大分子物质(蛋白)共混法Fig.4 Tannin-macromolecular substance(protein)compounding method利用单宁与大分子物质(包括蛋白、天然多糖等物质)所制备的水凝胶主要为物理凝胶,依靠单宁多酚羟基与多糖分子链、蛋白大分子功能基团之间的非共价作用力维持水凝胶三维网络结构的稳定性。单宁与蛋白质共混水凝胶可以定义为一种分子的聚集现象。在聚集过程中,单宁小分子与蛋白质大分子相互间的吸引力和排斥力处于平衡,所形成的三维网络结构或基体能够保持大量的水分和高度有序的结构(图 4)。一般认为,维持凝胶网络稳定性的作用力主要是氢键、疏水相互作用、静电吸引力以及蛋白质分子间巯基-二硫键(SH-SS)的交换反应等物理作用力31:1)疏水相互作用。在受热过程中,非极性多肽从蛋白质结构中暴露出来,与单宁分子的多酚羟基进行接触,从而增强了单宁功能基与临近多肽非极性片段之间的疏水相互作用。单宁基团与蛋白质中疏水氨基酸的比率将直接影响凝胶的形成过程;2)氢键和疏水相互作用。这两种作用力是维持凝胶网络结构稳定性的主要作用8 生 物 质 化 学 工 程第 57 卷力。但是在制备凝胶的前驱体溶液中,高浓度的单宁使溶液呈酸性环境,可能导致蛋白质严重变性从而破坏其二级结构;3)静电相互作用。在蛋白质聚集过程中,静电相互作用通常表现为相互排斥力,但当带有负电荷的单宁引入到体系中,特别是在体系仅含有一种蛋白质的情况下,静电吸引力占主导,导致两种前驱体聚集后形成凝胶;当含有相似等电点的不同种蛋白质接触的情况下,由于存在较高的净负电荷,静电排斥力占主导,两种前驱体的聚集不会发生;4)二硫键作用。溶胶-凝胶实验表明,单宁和蛋白分子间的二硫键可以提高凝胶网络的物理稳定性。二硫键是否仅有助于增加多肽的有效链长或它们在凝胶网络形成区域目前还不清楚。但实验表明,长的多肽链很容易缠绕在一起,由此导致凝胶网络内非共价键的形成。单宁与多糖共混制备的水凝胶材料主要利用两者之间形成的静电吸引力、氢键作用力作为凝胶形成的物理交联点。这类水凝胶材料主要分为两类:1)阳离子单宁与阴离子多糖形成的聚电解质凝胶网络。首先利用含有氨基的小分子单体对单宁进行化学改性,制备阳离子基单宁,再与索拉胶、海藻酸钠、果胶等阴离子多糖形成聚电解质水凝胶;2)阴离子单宁与阳离子多糖形成的聚电解质凝胶网络。单宁含有酚羟基、羧基等活性基团,水溶液有半胶体溶液的性质,脱粒带负电,能与壳聚糖及其衍生物包括羧甲基壳聚糖、乳化壳聚糖、壳聚糖季铵盐等阳离子多糖形成聚电解质水凝胶。需要注意的是,聚电解质的形成主要是互相接近的聚合物链段上的相反电荷中和的过程32-34。而在以单宁和多糖为反应物的聚电解质体系中,带相反电荷的两种反应物,其分子链通常会瞬间结合形成团簇或絮状物,因此,无法获得机械性能优越的水凝胶材料。利用“半溶解酸化溶胶-凝胶”法可有效克服这一弊端。该方法使半溶解状态下的壳聚糖及其衍生物在酸性环境中缓慢质子化,与单宁阴离子通过自组装逐渐形成高强度的块状水凝胶,依靠功能基团之间的静电吸引力维持结构的稳定性。另一种方法是使自组装反应在含有葡萄糖内酯(GDL)的磷酸盐缓冲溶液中进行。GDL 可以缓慢电离出氢离子,使壳聚糖及其衍生物的氨基逐步质子化,再与单宁阴离子进行接触,获得形状规则的块状水凝胶。对于单宁在这种大分子共混体系中所起的作用,现有研究仍存在比较明显的局限性。这主要因为单宁的邻苯三酚结构中,3 个酚羟基与不同大分子的结合能力也不尽相同,当与多种反应物进行络合反应时,常规的紫外光谱、X 射线光电子能谱等分析方法无法对酚羟基与多重目标离子的结合情况进行有效“监控”,这就造成了共混体系在自组装过程中,无法通过固定的编程记忆效应形成清晰定义的识别位点,阻碍了结构完备的三维立体空穴的构建,极大降低了印迹空穴对不同反应物的特异性识别能力。由此可见,对特定印迹空穴的形成过程具有可观测性的分析技术,已俨然成为构筑大分子共混水凝胶材料的亟需。对这类生物质材料制备的大分子水凝胶而言,未来的研究热点主要集中在利用计算化学、计算生物学以及计算材料学等技术手段解释共混物质之间的反应现象,从中建立理论并探讨机理,从而为实验奠定理论基础35-36。通过建立分子模型,并由此构筑起一套精密算法,包括平均场理论(MFT),密度泛函理论(DFT)以及分子动力学(MD)等,采用程序化模式对单宁与蛋白、多糖等大分子物质间的相互作用过程进行模拟计算,从而给出在这种相互作用下胞腔(孔腔)或空穴系统达到平衡状态时的有关性质,从分子尺度的层次上来揭示这类生物质材料的构建过程与核心机制。1.7 工业化制备方法在单宁基水凝胶的工业化生产中,传统的热聚合溶剂法往往需要高温、高压的反应环境以及毒性溶剂,受限于越来越严格的环保要求,这类方法近年来已经销声匿迹。取而代之的是具备绿色无污染特性和原子经济性的物理交联法,包括超分子点击组装和非共价力桥联等反应条件温和的制备手段。比如将近几年来的热点方法“可塑交联体”概念引入到水凝胶的工业生产中,得到的水凝胶具备的剪切变稀、自修复等很多新颖特性37-38。这些新功能主要源于水凝胶分子结构的设计并充分利用了三维网络的堆积效应。尽管有很多高水平的研究成果作为铺垫,并且在合成机制、机理方面也证明了这种方法的可行性,但是已建立的研究体系往往十分复杂,并且成本极高,无法在工业上规模化生产。因此,相关研究人员更多的从制备原料方面入手,通过一些成本低廉、绿色环保原料的引入解决工业生产第 4 期胡新宇:植物单宁构筑的水凝胶材料及其生物医药应用9 成本极高、不易实施等问题。例如目前市售的一些单宁基水凝胶类伤口敷料产品,在其规模化的工业制备中,往往采用生物友好、绿色环保、成本低、可在自然环境下降解并且能大规模生产的精细化学品,包括天然多糖、硅胶颗粒、低分子质量聚合物以及配位型金属离子等。纤维素、索拉胶、透明质酸等天然多糖、硅胶颗粒以及水解单宁在水溶液中混合会在非共价力桥联作用下形成水凝胶三维网络。这种桥联作用并不依赖于化学交联,因此有着“剪切变稀”与“自修复”的效应39-40。在外界给予伤患处较大的撞击或者挤压的应力下,吸附在硅胶颗粒表面的多糖分子链与其脱离以耗散应力,使三维网络基质在瞬间处于松散状态,宏观上表现为水凝胶的溶胀状态并因此获得了流动效应,导致“剪切变稀”效应的出现。而在正常状态下,即敷料在伤患处不被外力所干扰,3 种原料间的桥联作用使得其又形成三维网络,体现出“自修复”作用,当材料在扩大规模生产后,力学性能指标并没有发生显著改变。这些特点在工业化生产过程中具备重要意义。这些特点主要体现在3 个方面:1)制备水凝胶的外部条件极为温和,无需高温、高压以及毒性溶剂;2)反应原料绿色环保、成本低、可在自然环境下降解;3)生产线所需设备主要为大容量搅拌釜,相比较热聚合溶剂法所使用的高热型反应釜,反应设备大大简化,也使生产过程的安全性得到极大保障。综合看来,单宁基水凝胶类伤口敷料的工业化应用前景巨大,除了上述所提及的可规模化的生产方法外,还得益于单宁本身具备的抗菌作用,对细菌、真菌和酵母菌的抗菌活性机制包括抑制胞外微生物酶,剥夺微生物生长所需的基质,通过氧化磷酸化抑制微生物代谢,剥夺金属离子或与引起细胞壁形态变化和膜透性增加的细菌形成细胞膜复合物41。在伤口敷料的实际应用中,植物单宁及复配的其它反应物通过抑制微生物细胞膜发挥作用,使细胞聚合和细胞膜的破坏达到协同促进的效果。另外,这类敷料产品也具有不同的抗炎活性,与单宁本身的抗氧化活性呈正相关。通过调节细胞因子的表达可以降低低级别炎症性疾病,并抑制复配的多糖诱导 RAW264.7 等细胞产生一氧化氮(诱导炎症的促炎介质),充分体现其抗炎活性。相关的动物模型实验已经证实该类型敷料对巴豆油致小鼠耳部水肿和胶原诱导的小鼠关节炎均有明显的抗炎作用,其作用机制可能与体系的自由基清除能力有关42。这些应用研究实验以及可工业化的生产方法,使单宁基水凝胶类伤口敷料产品形成了较为成熟的生产工艺并进行大规模的工业化制备,为其在生物医药领域的进一步推广应用奠定了基础。2 单宁基水凝胶在生物医药领域的应用2.1 组织工程应用单宁基水凝胶在组织工程应用的策略是将不同种类的细胞在精确控制的培养条件下,种植于凝胶的三维多孔模块内,使细胞在模块内部黏附、增殖形成结构物并引导新组织的形成,而凝胶本身随着组织的形成逐渐降解消失,损伤的器官或组织得以重建。在这一过程中,细胞作为生命的功能单位,其生长行为受到胞外基质以及胞内环境的影响。对于具有细胞响应功能的水凝胶而言,细胞与材料本身的相互作用是一个永恒的话题,包括细胞在材料表面的吸附、迁移、增殖、分化、凋亡等多种行为以及细胞对材料自身的影响。水凝胶作为与人体器官最相似的材料,发挥着细胞活性因子控制释放载体的功能并给予细胞生长和干细胞分化成特异细胞所需的力学支撑,在组织工程研究中起到核心作用。大量的研究结果表明,细胞的行为受到凝胶材料本身的物理性质(如表面电荷、力学强度和介孔密度)、化学组成(如活性官能团和刺激响应分