植物叶片葡萄糖活体检测双通道传感器的制备及应用.pdf

第5 1卷 第1 0期2 0 2 3年1 0月西北农林科技大学学报(自然科学版)J o u r n a l o f N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y(N a t.S c i.E d.)V o l.5 1 N o.1 0O c t.2 0 2 3网络出版时间:2 0 2 3-0 4-1 0 1 4:4 0 D O I:1 0.1 3 2 0 7/j.c n k i.j n w a f u.2 0 2 3.1 0.0 1 5网络出版地址:h t t p s:/k n s.c n k i.n e t/k c m s/d e t a i l/6 1.1 3 9 0.S.2 0 2 3 0 4 0 7.1 8 5 9.0 1 5.h t m l植物叶片葡萄糖活体检测双通道传感器的制备及应用 收稿日期 2 0 2 2-0 7-0 6 基金项目 国家自然科学基金面上项目(2 1 9 7 4 0 1 2)作者简介 艾 耕(1 9 9 7-),男,湖北监利人,在读硕士,主要从事电化学生物传感器研究。E-m a i l:a g 9 7 0 8 0 7n w a f u.e d u.c n 通信作者 解迎革(1 9 7 6-),男,山西平陆人,教授,主要从事环境生物物理学和土壤学研究。E-m a i l:x i e y i n g g e 1 9 7 6n w a f u.e d u.c n艾 耕1,2,李爱学2,解迎革1(1西北农林科技大学 理学院,陕西 杨凌 7 1 2 1 0 0;2 北京市农林科学院 智能装备技术研究中心,北京 1 0 0 0 9 7)摘 要【目的】制备植物叶片葡萄糖活体检测传感器,以实时检测植物体叶片的葡萄糖浓度,为了解霜霉病侵染黄瓜的抗病状态提供支持。【方法】采用双通道丝网印刷电极为基底电极,使用1 m g/m L氯金酸溶液在传感器表面生成金纳米颗粒用于提高其导电性及活性面积,将5 m g/m L壳聚糖和1 8 0 m g/m L葡萄糖氧化酶混合以提高酶的固载量和活性,滴加1 0%的N a f i o n水溶液以增加对阳离子的选择性并提高电极稳定性。在此基础上研制出一种适用于活体检测植物扁平叶片中葡萄糖浓度的双通道电化学传感器。采用扫描电镜、X射线能谱、红外光谱、循环伏安法及电化学阻抗谱,对所制备传感器进行形貌、结构及电化学的表征;基于优化条件,对所制备的葡萄糖传感器进行性能测试;进一步使用黄瓜果汁进行传感器的加标试验,并应用该传感器对正常与带菌斑黄瓜叶片的葡萄糖浓度进行测定和比较。【结果】所制备植物叶片葡萄糖活体检测传感器的形貌、结构及电化学表征结果显示电极制备成功,其对葡萄糖具有良好的催化效果,反应为扩散控制过程;所设计的植物活体叶片葡萄糖检测双通道传感器的线性检测范围为11 5 0 mm o l/L,检出限为0.7 8 4 mm o l/L。采用3种不同浓度黄瓜果汁进行加标回收试验,回收率为9 7.1 7%1 0 3.0 5%,相对标准误差 4.5 2%,表明该传感器准确可靠。应用所制备的传感器检测结果表明,在双通道检测条件下,正常黄瓜叶片和霜霉菌侵染黄瓜叶片在通道1的葡萄糖浓度分别为(8.0 30.9 6)和(2 8.7 12.0 3)mm o l/L,在通道2的葡萄糖浓度分别为(1 2.1 51.4 6)和(2 5.5 71.8 1)mm o l/L,霜霉菌侵染黄瓜叶片的葡萄糖浓度较相应正常叶片增长了2 5 7.5 3%(通道1之间)和1 1 0.4 5%(通道2之间),表明不同生理条件下同种植物叶片的葡萄糖浓度因为霜霉菌侵染而存在显著差异(P0.0 5);病斑区域葡萄糖浓度的检测结果还显示,通道1的葡萄糖浓度高于通道2,表明通道1检测的侵染区域抗病响应迅速,侵染区相应代谢物质会发生明显变化导致邻近区域的葡萄糖逐步出现积累。【结论】所制备的传感器能够检测植物在不同生理环境下的葡萄糖浓度,可为活体植物叶片葡萄糖的实时检测提供技术支持。关键词 植物叶片;活体检测;葡萄糖检测;电化学技术;生物传感器 中图分类号 T P 2 1 2.9;O 6 5 7.1 文献标志码 A 文章编号 1 6 7 1-9 3 8 7(2 0 2 3)1 0-0 1 4 1-1 4P r e p a r a t i o n a n d a p p l i c a t i o n o f a d u a l-c h a n n e l s e n s o r f o r i n-s i t u d e t e r m i n a t i o n o f g l u c o s e i n p l a n t l e a v e sA I G e n g1,2,L I A i x u e2,X I E Y i n g g e1(1 C o l l e g e o f S c i e n c e,N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y,Y a n g l i n g,S h a a n x i 7 1 2 1 0 0,C h i n a;2 I n t e l l i g e n t E q u i pm e n t T e c h n o l o g y R e s e a r c h C e n t e r,B e i j i n g A c a d e m y o f A g r i c u l t u r e a n d F o r e s t r y S c i e n c e s,B e i j i n g 1 0 0 0 9 7,C h i n a)A b s t r a c t:【O b j e c t i v e】A s e n s o r f o r i n-s i t u r e a l-t i m e d e t e r m i n a t i o n o f g l u c o s e i n p l a n t l e a v e s w a s p r e-p a r e d t o p r o v i d e s u p p o r t f o r u n d e r s t a n d i n g r e s i s t a n c e s t a t u s o f d o w n y m i l d e w i n f e c t i o n i n c u c u m b e r.【M e t h o d】A d u a l-c h a n n e l s c r e e n-p r i n t e d e l e c t r o d e w a s u s e d a s t h e s u b s t r a t e e l e c t r o d e,a n d 1 m g/m L c h l o-r o a u r i c a c i d s o l u t i o n w a s u s e d t o g e n e r a t e g o l d n a n o p a r t i c l e s o n s u r f a c e t o i m p r o v e i t s e l e c t r i c a l c o n d u c t i v i-t y a n d a c t i v e a r e a.C h i t o s a n a n d g l u c o s e o x i d a s e a t c o n c e n t r a t i o n s o f 5 a n d 1 8 0 m g/m L,r e s p e c t i v e l y,w e r e m i x e d t o i m p r o v e e n z y m e l o a d i n g a n d a c t i v i t y.T h e 1 0%N a f i o n a q u e o u s s o l u t i o n w a s a d d e d t o i n c r e a s e c a t-i o n s e l e c t i v i t y a n d i m p r o v e e l e c t r o d e s t a b i l i t y.O n t h i s b a s i s,a d u a l-c h a n n e l e l e c t r o c h e m i c a l s e n s o r w a s d e-v e l o p e d f o r t h e d e t e c t i o n o f g l u c o s e c o n t e n t i n p l a n t f l a t l e a v e s i n v i v o.M o r p h o l o g y,s t r u c t u r e,a n d e l e c t r o-c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e s e n s o r w e r e c h a r a c t e r i z e d b y s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y,X-r a y e n e r g y s p e c t r u m,f o u r i e r t r a n s f o r m i n f r a r e d s p e c t r o s c o p y,c y c l i c v o l t a mm e t r y,a n d e l e c t r o c h e m i c a l i m p e d a n c e s p e c-t r o s c o p y.B a s e d o n t h e o p t i m i z e d c o n d i t i o n s,t h e p e r f o r m a n c e o f t h e p r e p a r e d g l u c o s e s e n s o r w a s t e s t e d.F i-n a l l y,c u c u m b e r j u i c e w a s u s e d f o r t h e m a r k i n g r e c o v e r y t e s t o f t h e s e n s o r,a n d t h e g l u c o s e c o n t e n t s i n n o r-m a l a n d s t a i n e d c u c u m b e r l e a v e s w e r e m e a s u r e d a n d c o m p a r e d.【R e s u l t】T h e m o r p h o l o g y,s t r u c t u r e a n d e l e c t r o c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e s e n s o r f o r g l u c o s e d e t e c t i o n i n p l a n t l e a v e s s h o w e d t h a t t h e e l e c t r o d e w a s s u c c e s s f u l l y p r e p a r e d w i t h g o o d c a t a l y t i c e f f e c t s o n g l u c o s e.T h e r e a c t i o n w a s a d i f f u s i o n c o n t r o l l e d p r o c e s s.T h e l i n e a r d e t e c t i o n r a n g e o f t h e t w o-c h a n n e l s e n s o r f o r g l u c o s e d e t e c t i o n i n l i v i n g p l a n t l e a v e s w a s 1-1 5 0 mm o l/L a n d t h e d e t e c t i o n l i m i t w a s 0.7 8 4 mm o l/L.T h e r e c o v e r i e s o f c u c u m b e r j u i c e s w i t h d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s w e r e 9 7.1 7%-1 0 3.0 5%a n d t h e r e l a t i v e s t a n d a r d d e v i a t i o n w a s l e s s t h a n 4.5 2%,i n d i c a t i n g t h a t t h e e n z y m e s e n s o r w a s a c c u r a t e a n d r e l i a b l e.U s i n g t h e s e n s o r w i t h t w o-c h a n n e l c o n d i t i o n,g l u c o s e c o n t e n t s o f n o r m a l a n d s t a i n e d l e a v e s w e r e(8.0 30.9 6)a n d(1 2.1 51.4 6)mm o l/L i n c h a n n e l 1 a n d(2 8.7 12.0 3)a n d(2 5.5 71.8 1)mm o l/L i n c h a n n e l 2,r e s p e c t i v e l y.C o m p a r e d w i t h n o r-m a l l e a v e s,g l u c o s e c o n t e n t s o f s t a i n e d l e a v e s i n c r e a s e d b y 2 5 7.5 3%(b e t w e e n c h a n n e l 1)a n d 1 1 0.4 5%(b e t w e e n c h a n n e l 2),i n d i c a t i n g s i g n i f i c a n t e f f e c t s b y p a t h o g e n i n f e c t i o n(P0.0 5).T h e d e t e c t i o n o f g l u-c o s e c o n t e n t i n t h e l e s i o n a r e a a l s o s h o w e d t h a t g l u c o s e c o n t e n t i n c h a n n e l 1 w a s h i g h e r t h a n t h a t i n c h a n-n e l 2,i n d i c a t i n g t h a t t h e i n f e c t e d a r e a d e t e c t e d b y c h a n n e l 1 h a d a r a p i d r e s i s t a n c e r e s p o n s e a n d t h e c o r r e-s p o n d i n g m e t a b o l i t e s i n t h e i n f e c t e d a r e a c h a n g e d s i g n i f i c a n t l y,l e a d i n g t o g r a d u a l a c c u m u l a t i o n o f g l u c o s e i n t h e a d j a c e n t a r e a.【C o n c l u s i o n】T h e p r e p a r e d s e n s o r c a n d e t e c t t h e c h a n g e s o f g l u c o s e c o n t e n t o f p l a n t s i n d i f f e r e n t p h y s i o l o g i c a l e n v i r o n m e n t s,w h i c h c o u l d p r o v i d e s u p p o r t f o r r e a l-t i m e d e t e c t i o n o f g l u c o s e i n p l a n t l e a v e s i n v i v o.K e y w o r d s:p l a n t l e a v e s;i n v i v o d e t e c t i o n;g l u c o s e d e t e c t i o n;e l e c t r o c h e m i c a l t e c h n i q u e s;b i o s e n s o r 黄瓜霜霉 病 是 由 霜 霉 病 菌 科 古 巴 假 霜 霉 菌(P e r o n o s p o r a c e a e)引起的 黄瓜主 要 病 害 之 一1。霜霉病感染通常会导致黄瓜产量下降,随着设施蔬菜种植面积的扩大,黄瓜霜霉病的发生和传播越来越难以控制。植物在受到病虫害等逆境胁迫时,其体内的相关生理物质如氮、糖、蛋白质、叶绿素等的组成都会发生明显变化2。绝大部分黄瓜品系中叶片可溶性糖含量与其对霜霉病的抗性呈正相关3-5。因此,通过对霜霉病菌感染黄瓜叶片中可溶性糖含量的检测,可实时了解黄瓜的抗病状态,为霜霉病的防治和植物抗性生理机制研究奠定基础。葡萄糖是自然界中分布最广的一种可溶性单糖6,是细胞的能量来源,也是其他生物分子的代谢中间产物,因而对植物的生长发育起到至关重要的作用。传统的植物葡萄糖含量检测方法主要有气相色谱法7、高效液相色谱法8、近红外光谱法9、荧光法1 0等,但是上述方法需要对植物样品进行较为复杂的前处理,且对设备及操作人员的技术水平要求较高。同时这些方法都属于离体检测,采样会对植物造成不可逆转的伤害,而且其检测结果通常也只能反映特定时刻的植物信息。随着精准农业的发展,研究人员希望能够在现场获得植物体中葡萄糖含量变化的实时信息,因此急需建立能够对植物葡萄糖进行现场、活体检测的方法。在众多生物检测方法中,电化学传感器的操作简单、成本较低,对于待测物质的测定具有高灵敏度和选择性,并且易于集成和微型化,便于携带和使用。目前采用电化学传感器进行植物体小分子,如生长素、水杨酸、色氨酸等活体检测的研究已有报道1 1-1 3。电化学葡萄糖传感器在过去几十年间已被用于检测人体及不同动物体的血糖浓度,但由于人体及动物体的血糖浓度与植物体的葡萄糖浓度存在着显著差异(人及动物的血糖浓度为几摩尔每升到几十摩尔每升1 4-1 6,而植物体的葡萄糖浓度一般从241西北农林科技大学学报(自然科学版)第5 1卷0到几百甚至上千毫摩尔每升1 7-1 8),所以市面上开发的相关人体及动物体的血糖传感器并不适用于植物体葡萄糖的检测。叶片是植物进行光合作用合成葡萄糖的主要部位,大部分植物叶片为扁平结构,厚度为0.10.5 mm,普通的针式电极难以植入,因此需开发用于叶片葡萄糖原位检测的传感器。双通道丝网印刷电极(d u a l-c h a n n e l s c r e e n p r i n t e d e l e c-t r o d e,D S P E)具有小型化、柔性、低成本、制备工艺成熟等特点1 9,同时在平面结构上集成了2个微型三电极体系,较为贴合叶片的扁平结构,能够与叶片形成良好接触,具有发展原位检测植物叶片葡萄糖传感器的潜力,因此需研制一种植物叶片葡萄糖含量的活体检测双通道电化学传感器,在实现叶片葡萄糖检测的同时,通过双通道检测结果的差异了解植物的感病状态,但目前对此尚缺乏系统的研究。为此,本研究采用双通道丝网印刷电作为基底,通过在电极 表 面 修 饰 金 纳 米 颗 粒(A u n a n o p a r t i c l e s,A u N P s)、葡萄糖氧化酶(g l u c o s e o x i d a s e,GO D)、壳聚糖(c h i t o s a n,C S)以及N a f i o n膜,研制了一种适用于植物叶片葡萄糖活体检测的电化学传感器,并将该传感器应用于正常与带菌斑黄瓜叶片葡萄糖含量的测定,以实时检测植物叶片葡萄糖含量,为了解霜霉病侵染黄瓜的抗病状态及黄瓜健康状态评价提供支持,并为其在精准农业中的应用提供参考。1 材料与方法1.1 主要试剂与仪器主要试剂:葡萄糖氧化酶(2 5 0 k u)、N a f i o n、氯金酸()和壳聚糖,均购于默克西格玛奥德里奇公司(美国,圣路易斯);磷酸盐缓冲溶液(P B S溶液0.0 1 m o l/L,p H=7.3),购于索莱宝科技有限公司(中国,北京);尿酸和抗坏血酸,均购于麦克林生化科技有限公司(中国,上海);蔗糖、木糖、乳糖、果糖、葡萄糖、铁氰化钾、亚铁氰化钾和氯化钾,均购于国药控股化学试剂有限公司(中国,上海)。其他试剂均为分析纯,试验用水均为双蒸水。主要仪器:电化学测试的八通道电化学工作站CH I 1 0 4 0 c,上海辰华仪器有限公司,中国;修饰电极的扫描电镜表征采用L a b R AM HR E v o l u t i o n系统,HO R I B A,日本;X射线能谱仪为G EM I N I S EM 5 0 0,Z E I S S,德国;傅里叶变换红外光谱采用B r u k e r T e n s o r 2 7,HO R I B A,德国;D S P E电极,购于宁波元感生物技术有限公司(中国),双通道均为三电极体系,工作电极采用碳作为基底,直径2.5 mm,参比电极和对电极分别采用A g/A g C l和碳作为基底。1.2 A u N P s/D S P E电极的制备将清洁后的D S P E电极放入P B S溶液中,采用计时电流法扫描进行活化。将活化后的D S P E电极插入准备好的氯金酸溶液(1 m g/m L)中,使被修饰部分完全浸入液体中,用计时电位法在-1 V 工作电压下电镀1 0 0 0 s,待工作电极表面呈现明显金色时采用超纯水缓慢冲洗电极表面,自然晾干待用。1.3 N a f i o n/GO D-C S/A u N P s/D S P E电极的制备N a f i o n/GO D-C S/A u N P s/D S P E电极制备过程如图1所示。图1 N a f i o n/G O D-C S/A u N P s/D S P E传感器的制备F i g.1 P r e p a r a t i o n o f N a f i o n/GO D-C S/A u N P s/D S P E s e n s o r 341第1 0期艾 耕,等:植物叶片葡萄糖活体检测双通道传感器的制备及应用 称取1 8 0 m g的GO D粉末溶解于p H=7.3的0.0 1 m o l/L P B S溶 液 中,配 制 质 量 浓 度1 8 0 m g/m L的GO D溶液。同时采用0.1 m o l/L醋酸溶液溶解壳聚糖固体颗粒,配制5 m g/m L的壳聚糖溶液。移取6 0 L GO D溶液和4 0 L壳聚糖溶液混合,冰浴下超声处理3 0 m i n,得到均匀分 散的GO D-C S混合物溶液,放入-2 0 冰箱中保存待用。将A u N P s/D S P E电 极 放 置 在 平 皿 内,移 取GO D-C S混合液4 L滴涂在每个通道的工作电极上,使之均匀分散。滴涂GO D-C S溶液完成后,放入4 环境晾干,之后滴涂2 L质量分数1 0%的N a f i o n水溶液,4 干燥2 h,待用。1.4 传感器表征1.4.1 电极表面扫描电镜观察 采用扫描电子显微镜(s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p e,S EM)观察不同修饰电极表面的形貌特征。使用L a b R AM HR E-v o l u t i o n系统对不同修饰电极进行上机检测:首先将样品置于系统内部,抽真空使环境气压达到51 0-3 P a;随后开始测试,设定扫描电压为2 0 k V,放大倍数分别为3 0 0 0和1 0 0 0 0,在视野中找到修饰材料进行扫描;然后依次更换不同修饰电极进行观察。1.4.2 电极修饰之后的X射线能谱分析 使用X射线能谱仪(e n e r g y d i s p e r s i v e s p e c t r o s c o p y,E D S)对不同修饰电极表面元素进行表征。E D S分析所使用的探测器作为附件安装于S EM上,测试环境与S EM相同。同时设置加速电压为1 5 k V,发射电流为1 0 A,将探测器探头的工作距离设定为1 5 mm,随后进行扫描,采集谱图。同理,依次更换不同修饰电极进行分析。1.4.3 GO D、C S和GO D-C S的红外光谱分析 采用傅里叶变换红外光谱(f o u r i e r t r a n s f o r m i n f r a r e d s p e c t r o s c o p y,F T I R)对GO D、C S和GO D-C S混合物进行红外光谱分析。取少量干燥的GO D、C S和GO D-C S粉末装入模具内,压成片状结构进行测试。将制备好的样品插入仪器样品室的固定位置上,设置扫描次数为3 2次,波段为4 5 0 06 0 0 c m-1,分辨率为4 c m-1,数据间隔为0.5 s,随后进行样品的扫描。1.4.4 不同修饰电极的电化学表征 采用循环伏安法(c y c l i c v o l t a mm e t r y,C V)和 电 化 学 阻 抗 谱(e l e c t r o c h e m i c a l i m p e d a n c e s p e c t r o s c o p y,E I S)对不同修饰电极进行表征试验。C V和E I S试验均在5 mm o l/L的F e(C N)63-/4-溶液中进行(含0.1 m o l/L K C l)。设定C V的电位为-0.20.6 V,扫描速度为1 0 0 mV/s。设定E I S的频率范围为1 0 mH z 1 0 0 k H z,信号振幅为1 0 mV。将不同修饰步骤的电极依次进行电化学表征。1.5 传感器催化效果的电化学检测采用C V对修饰后的电极进行可行性检测,将所制备的传感器分别置于P B S溶液和5 0 mm o l/L葡萄糖溶液进行扫描,设定电位为-0.70.2 V,扫描速度为1 0 0 mV/s,测试所制备传感器的直接电化学行为,探究电极对葡萄糖溶液的催化反应能否顺利进行,揭示其对葡萄糖氧化过程的催化机理。设定电位为-0.70.2 V,扫描速度为5 0 mV/s。同时设置不同扫描速度(5 0,7 0,9 0,1 1 0,1 3 0,1 5 0和1 7 0 mV/s),探究葡萄糖的电化学扩散控制行为。1.6 传感器制备条件的优化优化传感器的制备过程,分别探究氯金酸质量浓度、GO D质量浓度、C S质量浓度、不同体积分数N a f i o n水溶液对传感器反应性能的影响。将氯金酸质量浓度分别设置为0.6,0.8,1.0,1.2和1.4 m g/m L,GO D质量浓 度 分 别 设 置 为6 0,9 0,1 2 0,1 5 0,1 8 0和2 1 0 m g/m L,C S质量浓度分别设置为0.5,1.0,2.5,5.0和7.5 m g/m L,N a f i o n水溶液的体积分数分别设置为0,1 0%,2 0%,4 0%,8 0%和1 0 0%,利用2 0 mm o l/L的葡萄糖溶液检测电极的响应电流,用响应电流I比较传感器的反应性能。1.7 传感器性能测试1.7.1 检测性能 采用计时电流法(c h r o n o a m p e r-o m e t r y,I T)记录电极与不同浓度葡萄糖溶液(1,1 0,2 0,5 0,7 5,1 0 0和1 5 0 mm o l/L)的反应,其中葡萄糖溶液使用p H=4.5的0.0 1 m o l/L P B S缓冲液配制。将葡萄糖溶液均匀滴在电极表面,设置I T的起始电位为-0.4 4 V,采样间隔为0.1 s,扫描时间为1 0 0 0 s,待电极在P B S溶液中反应且电流相对稳定后,依次更换不同浓度葡萄糖溶液进行检测。1.7.2 选择性能 使用p H=4.5的0.0 1 m o l/L P B S缓冲液配制5 0和1 0 0 mm o l/L葡萄糖溶液及5 0 mm o l/L的蔗糖、木糖、乳糖、果糖、抗坏血酸和尿酸溶液,采用I T分析该传感器对检测对象的选择性能。设置I T的起始电位为-0.4 4 V,采样间隔为0.1 s,扫描时间为1 0 0 0 s,待电极在P B S溶液中反应且电流相对稳定后,依次更换不同种类的溶液进行检测,每种溶液检测时长为5 0 s。1.7.3 稳定性能 采用I T检测所制备传感器的稳定性能。设定起始电位为-0.4 4 V,采样间隔为441西北农林科技大学学报(自然科学版)第5 1卷0.1 s,扫描时间为6 0 0 s,将同一根电极连续在5 0 mm o l/L葡萄糖溶液测定1 0次,同时用同一根电极1 4 d内测定1 4次,通过考察响应电流的相对标准误差(r e l a t i v e s t a n d a r d d e v i a t i o n,R S D),测试N a f i o n/GO D-C S/A u N P s/D S P E电极的稳定性。1.8 植物样本的准备相关植物样品均来自于北京市昌平区小汤山镇的国家精准农业研究示范基地温室,包括黄瓜幼苗和成熟黄瓜果实,品种为中农2 0号(本试验所用黄瓜幼苗均处于三叶一心期)。采用液氮将黄瓜果实研磨,之后再用滤纸过滤样品,收集果汁备用。随后,喷洒霜霉菌菌株悬液至三叶一心期正常黄瓜幼苗表面,放入光照培养箱进行培养,以获取带有菌斑的黄 瓜 叶 片。根 据 霜 霉 病 室 内 抗 性 调 查 分 级 标准2 0,待黄瓜病斑叶片达到2级标准(5%0.0 5)表明,通道间不存在显著性差异。然后采用同样的传感器检测霜霉菌侵染黄瓜叶片,根据校准曲线得到通道1(工作电极置于菌斑处)和通道2(工作电极置于菌斑之外)的葡萄糖浓度分别为(2 8.7 12.0 3)和(2 5.5 71.8 1)mm o l/L,对霜霉菌侵染样本测定结果 的t检验结果(t=1.5 4,P0.0 5)也表明,2个通道间不存在显著性差异(表3)。通道1之间进行比较,霜霉菌侵染黄瓜叶片的葡萄糖浓度较正常叶片增长了2 5 7.5 3%;通道2之间进行比较,霜霉菌侵染黄瓜叶片的葡萄糖浓度较正常叶片增长了1 1 0.4 5%。图1 3 正常与感染霜霉病黄瓜叶片葡萄糖含量的原位检测F i g.1 3 I n s i t u d e t e r m i n a t i o n o f g l u c o s e c o n t e n t i n n o r m a l a n d d o w n y m i l d e w i n f e c t e d c u c u m b e r l e a v e s表3 正常与感染霜酶病黄瓜叶片不同通道间的葡萄糖浓度T a b l e 3 C o n t e n t s o f g l u c o s e i n d i f f e r e n t c h a n n e l s o f n o r m a l a n d d o w n y m i l d e w i n f e c t e d c u c u m b e r l e a v e s叶片类型T y p e o f l e a v e s葡萄糖浓度/(mm o lL-1)C o n t e n t o f g l u c o s e通道1 C h a n n e l 1通道2 C h a n n e l 2显著性水平S i g n i f i c a n c e l e v e l正常黄瓜叶片N o r m a l c u c u m b e r l e a v e s8.0 30.9 61 2.1 51.4 6N S菌斑黄瓜叶片I n f e c t e d c u c u m b e r l e a v e s2 8.7 12.0 32 5.5 71.8 1N S 注:N S表示无显著差异(P0.0 1)。N o t e:N S i n d i c a t e s n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P0.0 1).151第1 0期艾 耕,等:植物叶片葡萄糖活体检测双通道传感器的制备及应用 3 讨 论葡萄糖作为一种重要的单糖广泛分布于自然界。它不仅是活细胞的能量来源,还是多种复杂生物大分子的重要组成部分。同时最新研究表明,葡萄糖还与植物抗性具有相关性,叶片中的葡萄糖含量与植物对病害的抗性响应呈正相关6,因而葡萄糖含量的实时无损检测非常重要。电化学生物传感器具有许多优点,如易于小型化、成本低以及检测限低等,已成为生物分子检测中的一个重要技术手段。本研究制备传感器的检测范围为11 5 0 mm o l/L,检测上限远远超过其他传感器,能覆盖大部分植物中葡萄糖浓度范围。大多数葡萄糖传感器采用玻碳电极(g l a s s y c a r b o n e l e c t r o d e,G C E)作为工作电极,在植物活体葡萄糖检测中,G C E电极既难以植入到植物中,又难以与植物贴合,故难以实现植物的活体检测;同时其成本较高,在实际生产过程中难以大规模运用。本研究所使用的D S P E本身为集成化的三电极体系,呈扁平片状样式,能够较好地贴合植物叶片,并且制作成本较低,易于在农业生产中推广。基于以上特点,本试验所制备的葡萄糖传感器在植物叶片葡萄糖的活体检测方面具有较大应用潜力。基于试验检测结果可知,霜霉菌侵染黄瓜叶片的葡萄糖浓度明显高于正常叶片,采用t检验验证正常黄瓜叶片与霜霉菌侵染黄瓜叶片葡萄糖浓度间差异显著(P0.0 5)。通道1之间进行比较,霜霉菌侵染黄瓜叶片的葡萄糖浓度较正常叶片增长了2 5 7.5 3%;通道2之间进行比较,霜霉菌侵染黄瓜叶片的葡萄糖浓度较正常叶片增长了1 1 0.4 5%,显示该传感器能够准确检测霜霉病侵染黄瓜抗病状态下的葡萄糖浓度6。丁九敏等5研究表明,黄瓜叶片内可溶性糖与霜霉病抗性呈正相关;刘庆元等3 7研究发现,黄瓜感染霜霉病后,受害黄瓜叶片可溶性糖质量分数上升。这些结果与本研究所制备传感器检测的黄瓜叶片葡萄糖浓度结果一致,提示可溶性糖参与了黄瓜抗病菌侵染过程。在进行病菌区域黄瓜叶片葡萄糖检测时,通道1检测后的葡萄糖浓度高于通道2,说明植物在受到病原菌侵染时,侵染区域会立刻表现出一定的抗病性响应,侵染区相应代谢物质会发生明显变化,合成一些抗菌物质如植保素、糖苷类化合物,并诱导合成酚类化合物及其衍生物,同时这一影响也会导致附近区域防御相关产物,如可溶性蛋白质、可溶性糖、单宁、黄酮、叶绿素等的积累2,3 8。由此可见,所制备的双通道植物葡萄糖检