微生物学实验PPT课件.ppt

江江苏师苏师范大学生命科学学院范大学生命科学学院卓培班卓培班微生物学微生物学实验实验吕爱军吕爱军20132013年年3 3月月1.1.培养基的制备及高压蒸汽灭菌2.器皿的清洗包装及干热灭菌3.实验室环境和人体表面微生物的检查4.无菌接种技术基基础综础综合合实验实验一一 2.培养基配方：牛肉膏蛋白胨固体培养基：加1.5-2琼脂 400ml牛肉膏蛋白胨培养基：液体培养基 200ml牛肉膏 0.3g蛋白胨 1gNaCl 0.5g琼脂 2g水 100mlPH 7.2-7.41.1.培养基制培养基制备备及高及高压压蒸汽蒸汽灭灭菌菌3.(1)培养基的配制：先将试管贴好标签。注明培养基名称，组别，日期。标签粘贴位置在离管口1/3管身处。注意：注意：标签标签用用铅铅笔笔书书写，以防高温写，以防高温灭灭菌菌时时蒸汽模糊字迹。蒸汽模糊字迹。操作图示：称量称量-溶解溶解-调节调节pHpH值值-过滤过滤-分装及包扎分装及包扎-灭灭菌菌-灭灭菌后菌后试试管管摆摆放斜面、倒平板放斜面、倒平板4.(2)高高压压蒸汽蒸汽灭灭菌菌 一般培养基用一般培养基用0.1Mpa0.1Mpa，121.5,15121.5,1530min 30min 实验实验步步骤骤：加水加水装待装待灭灭菌物品菌物品加盖加盖加加热热灭灭菌菌时间时间到后到后断断电电源源压压力降力降为为零零开箱取物开箱取物5.摆斜面6.倒平板倒平板 将菌液分离样品摇匀，用无菌移液管取1 ml的菌液移至无菌培养皿中，然后将融化，凉至50左右的培养基，在每个培养皿内各倒入约15 ml，摇匀，凝固，制成平板。7.2.2.器皿的清洗包装器皿的清洗包装及干及干热灭热灭菌菌(1)(1)培养皿、三角培养皿、三角锥锥瓶、瓶、试试管的包扎管的包扎8.(2)(2)干干热灭热灭菌法菌法所需温度所需温度(160-170)(160-170)，时间长时间长(1-2h)(1-2h)。实验实验步步骤骤:恒温恒温降温降温开箱取物开箱取物升温升温装入待装入待灭灭菌物品菌物品9.(1)写标签：在皿底上(2)接种环境或体表微生物手指（洗前后）、头发、咳嗽、抹布、空气、硬币等(3)培养：37 培养24h-48h3.实验实验室室环环境和人体境和人体 表面微生物的表面微生物的检查检查10.常用的几种方法如下：斜斜面接种面接种液体接种液体接种平板接种平板接种4.微生物接种技微生物接种技术术11.1)斜面接种示意斜面接种示意图图12.13.2)2)平板划平板划线线法：法：将菌液分离样品摇匀，以无菌操作用接种环直接取试管中待分离纯化的菌液，将接种环通过稍打开皿盖的缝隙（约30）伸入平板，将菌液点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余的菌种，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却,然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30-40，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线,接种环不要嵌入培养基内划破培养基,线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠，划线完毕，关上皿盖.灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。14.1.细菌的单染色2.革兰氏染色3.芽孢染色4.4.酵母菌形态观察、死活细胞鉴别基基础综础综合合实验实验二二15.现场现场演示演示无菌操作涂片涂片 干燥干燥 固定固定 染色染色 水洗水洗 干燥干燥 镜检镜检1.细细菌的菌的单单染色染色16.1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。显显微微镜镜保养和使用中的注意事保养和使用中的注意事项项17.显显微微镜镜操作操作1.低倍镜观察：粗调、细调。依次再进行中倍、高倍观察2.油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。3.换片：另换新片，必须从第一条开始操作。4.用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量去去污剂污剂擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。注意：油镜使用完毕后一定要用去污剂擦拭镜头18.（1）初染：于制片上滴加结晶紫染液，染1min后，用水洗去剩余染料。（2）滴加卢戈氏碘液，1min后水洗：（3）滴加95乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止(根据涂片之厚薄需时30s至1min)。（4）复染 滴加石炭酸复红液复染1min，水洗。（5）用滤纸吸干，油镜镜检。制片制片初染初染（结结晶紫晶紫1min）水洗水洗媒染媒染（碘液（碘液1min）水洗水洗脱色脱色（乙醇（乙醇20-30s）水洗水洗复染复染（番（番红红2min）水洗水洗干燥干燥观观察察2.革革兰兰氏染色氏染色19.3.芽孢染色法(1)取37培养1824h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定。(2)于载片上滴入35滴5孔雀绿水溶液。(3)用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约45min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。(4)倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。(5)用0.5沙黄水溶液(或0.05碱性复红)复染1min，水洗。(6)制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。20.制片制片染色染色（孔雀（孔雀绿绿5min）水洗水洗复染复染（蕃（蕃红红花花红红2-3min）水洗水洗干燥干燥镜检镜检芽芽孢孢染色染色切勿煮干切勿煮干21.v在在载载玻玻片片中中央央加加一一滴滴0.1吕吕氏氏碱碱性性美美蓝蓝染染色色液液，用用接接种种环环挑挑取取少少量量酵酵母母菌菌苔苔放放入入上上述液滴里，混合均匀；述液滴里，混合均匀；v用用镊镊子取一子取一块块盖玻片，先将盖玻片，先将一一边边与菌液接触，然后慢慢与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液将盖玻片放下使其盖在菌液上；上；4.4.酵母菌形酵母菌形态观态观察、察、死活死活细细胞胞鉴别鉴别（美（美蓝蓝浸片）浸片）染液不宜染液不宜过过多或多或过过少少盖玻片不宜盖玻片不宜平着放下平着放下22.v将将制制片片放放置置约约3min，先先低低倍倍镜镜后后高高倍倍镜镜观观察察酵酵母母形形态态和和出出芽芽情情况况，并并根根据据颜颜色区色区别别死活死活细细胞。胞。v染染色色30min后后再再次次观观察察，注注意意死死活活细细胞数量的胞数量的变变化；化；v用用0.05的的吕吕氏氏碱碱性性美美蓝蓝染染色色液液重重复复上述操作。上述操作。23.综综合合设计实验设计实验三三1.细菌的分离鉴定；2.细菌生理生化试验；3.药敏试验；4.16S rRNA基因的克隆测序。24.