脂质氧化产物危害性评价模型和评价方法研究进展.pdf

未来食品科学D O I /f f s ,V o l ,N o /脂质氧化产物危害性评价模型和评价方法研究进展孟晨,张铭凯,许继取,陈亚淑,陈洪建,邓乾春,(湖北工业大学生物工程与食品学院,湖北 武汉 ;中国农业科学院油料作物研究所,湖北 武汉 ;武汉轻工大学食品科学与工程学院,湖北 武汉 )收稿日期:基金项目:国家自然科学基金项目();湖北省重点研发计划(B C A )第一作者简介:孟晨()(O R C I D ),女,硕士研究生,研究方向脂质功能与营养研究.E m a i l m c o m通信作者简介:邓乾春()(O R C I D ),男,研究员,博士,研究方向为脂质功能与营养研究.E m a i l d e n g q i a n c h u n c a a s c n摘要:脂质中的多不饱和脂肪酸容易在金属离子等促氧化因子胁迫下发生氧化反应,且生成的脂质氧化产物已被证明可引起生物膜组织紊乱和功能损伤,影响蛋白质的表达和脱氧核糖核酸(d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d,D NA)碱基的修饰,具有潜在的致病风险.构建细胞、动物模型是研究脂质氧化产物吸收代谢机理与危害的常用方法,具有实验周期短、便于分析等优点.同时,脂质氧化产物危害性评价方法逐渐从一些理化指标的检测转化为更直观准确的方法,从而更好的研究脂质氧化产物对人体造成的不良影响.本文综述了脂质氧化产物的危害、实验模型以及评价方法等,阐明了脂质氧化产物的致病性、不同模型对不同脂质氧化产物吸收代谢毒性的适用相关性及其相关评价方法,旨在阐述脂质氧化产物吸收代谢的危害性,为后续研究氧化脂质对疾病发展的影响提供理论支撑.关键词:脂质氧化;危害性;细胞模型;动物模型;评价方法H a z a r dA s s e s s m e n tM o d e l sa n dM e t h o d so fL i p i dO x i d a t i o nP r o d u c t sAr e v i e wME NGC h e n,Z HAN G M i n g k a i,X UJ i q u,CHE NY a s h u,CHE N H o n g j i a n,D E N GQ i a n c h u n,(C o l l e g eo fB i o e n g i n e e r i n ga n dF o o d,H u b e iU n i v e r s i t yo fT e c h n o l o g y,Wu h a n ,C h i n a;I n s t i t u t eo fO i lC r o p s,C h i n e s eA c a d e m yo fA g r i c u l t u r a lS c i e n c e s,Wu h a n ,C h i n a;S c h o o l o fF o o dS c i e n c ea n dE n g i n e e r i n g,Wu h a nU n i v e r s i t yo fL i g h t I n d u s t r y,Wu h a n ,C h i n a)A b s t r a c t:L i p i d s i nf o o da r es u s c e p t i b l et oo x i d a t i o n,a n dl i p i do x i d a t i o np r o d u c t sh a v eb e e ns h o w nt oc a u s et i s s u ed i s o r d e r sa n df u n c t i o n a l d a m a g ei nb i o f i l m s,a f f e c t i n gp r o t e i ne x p r e s s i o na n dd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d(D NA)b a s em o d i f i c a t i o n,w i t hp o t e n t i a lp a t h o g e n i c r i s k s T h ec o n s t r u c t i o no f c e l l u l a ra n da n i m a lm o d e l s i sac o mm o nm e t h o dt os t u d yt h em e c h a n i s ma n dh a z a r d so f l i p i do x i d a t i o np r o d u c t a b s o r p t i o na n dm e t a b o l i s m,d u et ot h ea d v a n t a g e so fs h o r te x p e r i m e n t a lp e r i o da n de a s ya n a l y s i s A tt h es a m et i m e,t h em e t h o do f e v a l u a t i n gt h eh a z a r do f l i p i do x i d a t i o np r o d u c t s i sg r a d u a l l yt r a n s f o r m e df r o mt h ed e t e c t i o no fs o m ep h y s i c a la n dc h e m i c a l i n d i c a t o r s t oam o r e i n t u i t i v ea n da c c u r a t em e t h o d,s oa s t ob e t t e r s t u d yt h ea d v e r s ee f f e c t so f l i p i do x i d a t i o np r o d u c t so nh u m a nb o d y T h i sp a p e rr e v i e w st h eh a z a r d so f l i p i do x i d a t i o np r o d u c t s,e x p e r i m e n t a lm o d e l sa sw e l la se v a l u a t i o nm e t h o d s,c l a r i f i e s t h ep a t h o g e n i c i t yo f l i p i do x i d a t i o np r o d u c t s,t h er e l e v a n c eo fd i f f e r e n tm o d e l sf o rt h et o x i c i t yo fd i f f e r e n t l i p i do x i d a t i o np r o d u c t su p t a k ea n dm e t a b o l i s m,a n dt h er e l a t e de v a l u a t i o nm e t h o d s,t op r o v i d et h e o r e t i c a l s u p p o r t f o rs u b s e q u e n ts t u d i e so nt h ee f f e c t so fo x i d i z e d l i p i d so nd i s e a s ed e v e l o p m e n t K e y w o r d s:l i p i do x i d a t i o n;h a r m f u l n e s s;c e l lm o d e l;a n i m a lm o d e l;e v a l u a t i o nm e t h o d中图分类号:T S 文献标志码:A文章编号:()未 来 食 品 科 学 ,V o l ,N o 引文格式 孟晨 张铭凯 许继取 等敭脂质氧化产物危害性评价模型和评价方法研究进展 J 敭未来食品科学 敭 D O I 敭 f f s 敭 h t t p f f s 敭 g z h u 敭 e d u 敭 c n ME NGC h e n Z HANG M i n g k a i XUJ i q u e ta l 敭H a z a r da s s e s s m e n tm o d e l sa n dm e t h o d so fl i p i do x i d a t i o np r o d u c t s ar e v i e w J 敭F u t u r eF o o dS c i e n c e 敭D O I 敭 f f s 敭 h t t p f f s 敭 g z h u 敭 e d u 敭 c n 图自由基引起的脂质氧化过程F i g L i p i do x i d a t i o np r o c e s s i n d u c e db yf r e er a d i c a l s脂质是人体必需的三大营养素之一,也是食品的一种主要组成成分.由于脂质中的多不饱和脂肪酸存在多烯丙基结构,因此容易发生自动氧化或者在一些特定酶的作用下产生氧化产物,并被称为脂质氧化产物.脂质发生的氧化反应包括自动氧化、光敏氧化、酶促氧化三条途径,其中以自由基引发的自动氧化为主要途径,如图所示.含有双烯丙基氢的多不饱和脂肪酸生成的碳中心自由基通过重新排列可以形成稳定的顺式、反式戊二烯基自由基,进一步与氧气反应则生成脂质过氧自由基.然后从过氧自由基中释放出氧气生成氧自由基和戊二烯基自由基,这些自由基与氧气迅速反应,生成更稳定的反式结构.脂质过氧自由基从脂质中提取双烯丙基氢,生成共轭二烯脂质过氧化氢和新的脂质自由基.光敏氧化是不饱和脂肪酸中的双键与单线态氧发生氧化反应,生成的氢过氧化物分解产生的自由基被认为是引发自动氧化的关键.酶促氧化主要是通过脂肪氧化酶和和脂肪氢过氧化酶参与发生的氧化反应,脂肪氧化酶氧化不饱和脂肪酸的顺顺五碳双烯结构,脂肪氢过氧化酶可加速分解氧化生成的氢过氧化物.脂质氧化产物是膳食氧化剂的主要来源,其潜在毒性已得到相关研究的证实.在脂质氧化过程中形 成 的 羟 基 壬 烯 醛(h y d r o x y n o n e n a l,HN E)、,癸 二 烯 醛、丙 二 醛(m a l o n a l d e h y d e,MD A)和巴豆醛等次生反应产物,通过在人体细胞中形成环外D NA加合物(具有致癌性).其中 HN E是 多不饱和脂肪酸(p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d,P U F A)特异性生成的具有遗传毒性和细胞毒性的、不饱和羟基烯醛.此外,脂质氧化产物也被证明可以引起消化系统紊乱.S t a p r a n s等发现当大鼠食用含有过氧化物的饲料时会引起其乳糜微粒的代谢异常,以及机体的脂质消化代谢受到干扰.膳食中的氧化脂肪酸可以被肠道吸收并与脂蛋白结合,并加剧氧化应激和动脉粥样硬化.氧化应激是多种急性和慢性疾病以及正常衰老过程的常见特征.研究表明,摄入氧化脂肪酸后会引起氧化应激,从而增加患非酒精性脂肪性肝病的风险,造成脂质代谢和肝功能紊乱等 .此外,肉 中 的 胆 固 醇 氧 化 会 形 成 酮 胆 固 醇(k e t o c h o l e s t e r o l,K C)、羟 基 胆 固 醇(h y d r o x y c h o l e s t e r o l,HC)和 羟基胆固醇(h y d r o x y c h o l e s t e r o l,HC)等氧化甾醇,这些化合物对人体的健康有害,尤其是在诱发动脉粥样硬化病变的发病机制中起到主要作用 .因此,膳食中氧化脂质的危害不容小觑,并且明确氧化脂质对人体健康的影响具有重大意义.脂质氧化产物的与疾病的关系人类的多种疾病中均存在脂质氧化产物在组 ,V o l ,N o 未 来 食 品 科 学 织或血液中水平增加的现象,这表明其参与了多种疾病的临床表达和相关进展,如宫颈癌患者体内的MD A水平高于正常人,阿尔茨海默病(a l z h e i m e rd i s e a s e,A D)患者脑中HN E的含量增加,且与人类主要慢性疾病的发病机制具有重大联系.慢性炎症食物中的脂肪酸过氧基团与炎症相关细胞膜脂质过氧化形成的脂肪酸过氧基团类似 .过氧化脂肪酸具有亲脂性,通过细胞膜简单扩散,引发自由基连锁反应和促进细胞内氧自由基的生成,致使受影响组织处于促炎状态.B h m等 将肝细胞与过氧化亚油酸进行体外短期培养,结果发现氢过氧化物改变了参与炎症过程的基因表达,而且可能使p MA P K途径介导的肝间质中促氧化/炎症基因的表达发生改变从而导致促炎症状态.此外,氧化脂质通过增强细胞关键炎症和趋化因子的表达发挥促炎作用.M a s c i a等 发现氧化甾醇混合物通过上调白细胞介素的表达和合成引发C a c o 细胞产生强烈的促炎作用.L i u Y a n i等 利用人单核细胞和巨噬细胞研究发现,HC可导致趋化性白细胞介素的上调.胆固醇氧化物能持续维持慢性炎症的状态,引发血管细胞的不可逆损伤,并随后激活吞噬细胞.L i z a r d 等发现 K C和HC两种甾醇在 m o l/L范围内可持续诱导人内皮细胞和平滑肌细胞凋亡,导致从人脐带静脉分离的成纤维细胞的不可逆损伤.动脉粥样硬化巨噬细胞中泡沫细胞的形成是诱发动脉粥样硬化的关键.低密度脂蛋白(l o wd e n s i t yl i p o p r o t e i n,L D L)被巨噬细胞吸收时则经过氧化过程,其中细胞产生自由基导致细胞结构和功能改变,包括多不饱和脂肪 酸、胆 固 醇 的 过 氧 化 和 磷 脂 的 分 解,使 得L D L具有较强的细胞毒性.研究表明,饮食中的过氧化 脂 质 可 能 会 促 进 脂 蛋 白 的 动 脉 粥 样 硬 化性 .肠道细胞可能吸收大量的氧化脂肪酸并将其转化为酯化脂质,造成氧化应激进而加剧动脉粥样硬化.S t a p r a n s等 通过饲喂新西兰白兔含有氧化脂质的膳食,结果发现其主动脉脂肪条纹病变率增加一倍.动脉粥样硬化的发病机制中的氧化甾醇和核心醛两种胆固醇氧化产物发挥着关键作用.其中氧化甾醇通过L D L运输到内膜下间隙发生积聚,进而可能在动脉粥样硬化斑块坏死核心区域的演变中发挥作用.与天然胆固醇相比,氧化胆固醇产品已被证明引发动脉粥样硬化的风险更高.P e n g等 采用扫描电子显微镜研究了静脉注射 m g/k g HC的兔子主动脉腔表面形态,结果观察到管腔表面可见水泡及球囊状突起,多处坑状缺损,偶尔有局部显露出内部弹性层.在患有动脉粥样硬化的公猪体内发现动脉内皮的功能损伤,并发生血管痉挛反应.癌症促氧化物形成过程中产生的脂质过氧化物被认为会参与癌症的发病过程.膳食中的脂质氧化物引起的基因毒性和致癌风险则会导致不同器官发生癌变.植物油热处理过程中形成的致癌化合物,如MD A、HN E可能会加剧D NA加合物的形成,这些加合物引起致癌D NA病变,也是人类癌症的预测性生物标志物.反复加热的植物油产生的脂质氧化产物也可能导致染色体异常从而产生致突变特性.常见D NA加合物如表所示.在给表人体内 常见D N A加合物的种类T a b l eT y p e so f c o mm o nD N Aa d d u c t s i nt h eh u m a nb o d y乙烯 D NA加合物丙二醛 D NA加合物外环丙烷衍生D NA加合物 d A(,N乙烯基 脱氧腺苷)Md G(嘧啶,嘌呤 (H)脱氧核糖)A d G(丙烯醛,N丙酮 脱氧鸟苷)d C(,N乙烯基 脱氧胞苷)MG(氧丙戊基从碱性丙烯转移到d G残基)C d G(巴豆醛,N丙酮 脱氧鸟苷)N d G(,N乙烯基 脱氧鸟苷)HN E d G(HN E衍生的,N丙酮 脱氧鸟苷)N,d G(N,乙烯基 脱氧鸟苷)未 来 食 品 科 学 ,V o l ,N o 大鼠日粮中加入不同含量的氧化植物油,一段时间后在其多处器官中均发现外环,N丙烷氧鸟苷加合物(N d G)的生成,这种加合物被认为是脂质氧化产物H N E产生的主要D N A加合物,是诱发结肠癌等癌症的主要标志物.此外,研究表明良性乳头状瘤向恶性皮肤肿瘤发展过程中,D N A与H N E反应生成的乙烯基D N A加合物 d A和 d C的水平均会升高.神经退行性疾病自由基引发的脂质过氧化在神经退行性疾病的病理过程中发挥重要作用,尤其是A D和帕金森病.研究表明,自由基对脑脂质、D NA的损害与神经退行性疾病中的神经元死亡有关.与其他器官相比,大脑氧耗率高,脂质含量丰富,且抗氧化酶相对缺乏,容易发生氧化失衡,受到自由基损伤.神经元是线粒体后细胞,随着时间的推移氧化损伤程度逐渐增加,因此这类疾病的特点是发病期晚,进展缓慢.在A D患者的大脑中发现,硫代巴比妥酸活性物质(t h i o b a r b i t u r i ca c i d,T B A R S)和HN E的含量增加,P U F A的含量减少,其中在组织病理改变最明显的内侧颞叶结构中,脂质过氧化最为明显.研究人员通过一系列细胞、动物实验发现,海马神经元中的葡萄糖转运在暴露于 m o l/LHN Eh内被显著抑制,并破坏皮质星形胶质细胞中的 谷 氨 酸 转 运 .给 大 鼠 基 底 前 脑 注 射 m o l/LHN E后发现,大鼠的胆碱能神经元被损伤,胆碱乙酰转移酶活性降低,视觉空间记忆被破坏,这表明HN E可能造成A D患者胆碱能神经回路功能障碍和退化不良.脂质氧化产物危害性评价模型脂质的吸收代谢涉及一系列复杂的生化反应,其代谢机制可分为胆固醇代谢平衡、甘油三酯与脂肪酸代谢平衡两个方面.脂质氧化产物吸收代谢的过程与脂质基本一致.由于胆固醇酰基转移酶存在于高密度脂蛋白中,伴随着少量的胆固醇酯氢过氧化物和氢氧化物的生成,人血浆中的氢过氧化物磷脂酰胆碱的吸收代谢则会发生还原反应.此外,还包括磷脂酶水解、谷胱甘肽转移酶结合和氧化.目前,细胞模型与动物模型已被广泛应用于脂质氧化产物的吸收代谢研究.细胞模型如表所示,国内外目前使用细胞模型进行脂质氧化产物体外模拟吸收代谢研究较多.与动物模型相比,细胞模型具有结构简单、繁殖速度快、易于培养等优点.表细胞模型对脂质氧化产物吸收代谢过程产生危害性的研究实例T a b l eS t u d yo nt h eh a r m f u l n e s so f c e l lm o d e l t o t h ea b s o r p t i o na n dm e t a b o l i s mo f l i p i do x i d a t i o np r o d u c t s细胞种类研究目的特点研究结果参考文献C a c o 使用C a c o 细胞模型测定氧化和未氧化亚油酸对一种高亲脂性生物活性柑橘类黄酮(DMT)转运的影响相对简单,可重复性高,应用范围广泛细胞活力随亚油酸浓度的增加而下降;细胞的完整性明显降低;亚油酸氧化后C a c o 单层膜基底外侧脂蛋白较多;在高氧化亚油酸培养 小时后,C a c o 细胞产生的R O S水平高于未氧化亚油酸 H e p G 以极性物质中的氧化甘油三酯寡聚物、氧化甘油三酯二聚物以及氧化甘油三酯单体为研究对象,研究对H e p G 细胞活性及毒性的影响生长周期更短,成本较低氧化甘油三酯的细胞毒性最强 巨噬细胞氧化磷脂对巨噬细胞的毒性容易获得,便于培养,难以长期生存氧化磷脂诱导巨噬细胞凋亡 v 细胞共轭亚油酸氧化代谢产物呋喃脂肪酸的体外毒理学活性好、存活率高呋喃脂肪酸没有遗传毒性,但对细胞活力有抑制作用 人脐静脉内皮细胞亚油酸氢过氧化物及其相关脂肪醛对人脐静脉内皮细胞的毒性取材方便,具有干细胞的潜能饱和醛、戊醛、己醛和 氧壬酸是无毒的,带有一个羟基或一个额外的双键烯醛具有高毒性 肾小管上皮细胞羟基酪醇及其代谢产物对过氧化氢诱导肾小管上皮细胞脂质过氧化的保护作用易于取材,便于观察MD A含量显著增加,细胞膜结构被破坏 ,V o l ,N o 未 来 食 品 科 学 C a c o 细胞与肠上皮细胞目前最常见的细胞代谢模型是C a c o .C a c o 细胞模型是人的一种克隆结肠腺癌细胞,其结构和功能与分化的肠上皮细胞相似,具有相对操作简便、可重复性高和应用范围广泛的特点,因此可作为一种成熟人肠细胞的脂质氧化吸收和代谢的体外评价模型.C a c o 细胞连接紧密,具有不可穿透的单分子层,从而提供了一个人体肠道细胞的分离模型.Y a oM i n g f e i 等使用该模型测定氧化和未氧化亚油酸对一种高亲脂性生物活性柑橘类黄酮(h y d r o x y ,t e t r a m e t h o x y l f l a v o n e,DMT)转运的影响,结果观察到细胞活力随亚油酸含量的增加而下降,细胞的完整性明显降低.亚油酸氧化后C a c o 单层膜基底外侧脂蛋白较多,而且在高氧化亚油酸培养 h后,C a c o 细胞产生的活性氧(r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s,R O S)水平高于未氧化亚油酸,破坏了细胞间的紧密连接并降低了高亲脂性生物活性柑橘类黄酮 DMT的跨肠细胞吸收能力,这说明氧化亚油酸可对小肠上皮细胞单层形态造成损害且影响 DMT的淋巴转运.C a c o 细胞常常也作为分析脂类物质引发炎症产生机理与反应的模型,如富含脂质的墨西哥鳄梨提取物通过被动扩散并经由细胞旁或跨细胞途径穿过肠上皮细胞诱导凋亡并调节炎症反应.肠上皮细胞相对容易培养,常常可为体外研究提供一个稳定、重复性好的细胞模型,用于研究包括癌症在内的各种疾病的发病机制.生物膜对不同脂质过氧化的敏感性不同,因为它们含有蛋白质、抗氧化剂、胆固醇和脂质的种类不同.U d i l o v a等 使用肠上皮细胞和C a c o 细胞研究了加热食用油中产生的亚油酸过氧化氢对细胞活力和增殖的影响,结果发现细胞在吸收过程中亚油酸氢过氧化物会结合到脂质双分子层中,降低膜流动性并引发脂质过氧化,通过凋亡和坏死两种方式导致细胞死亡.H e p G 细胞H e p G 肝癌细胞也常常被用作细胞代谢模型.H e p G 肝癌细胞模型生长周期较短,成本较低,可以大规模培养,这保留了原代肝细胞的许多特性(包括代谢激活),因此常作为一种肝脏体外模拟系统用于外源性物质的代谢和毒性研究.J uJ i n g j i e等 研 究 煎 炸 油 中 总 极 性 化 合 物(t o t a lp o l a rc o m p o u n d,T P C)对H e p G 细胞脂质代谢的影响,结果发现用T P C处理的H e p G 细胞的存活率随着时间 和 剂 量 的 增 加 而 降 低.T P C显 著 提 高 了H e p G 细胞内的R O S,并抑制了P P A R、C P T和A C O X等基因的表达水平,最终引起脂质代谢紊乱.脂质代谢紊乱通过核受体触发氧化应激,而氧化应激触发细胞周期阻滞和细胞凋亡,这也是诱发肝脏疾病的重要原因.因此,H e p G 细胞模型常被用于研究氧化应激和细胞凋亡之间的关系.巨噬细胞巨噬细胞来源于单核细胞,与单核细胞皆为吞噬细胞,是一种易获取、易培养、具有可塑性和多功能性质的细胞群体,但是难以长期生存.巨噬细胞与氧化低密度脂蛋白对慢性疾病动脉粥样化的形成密切相关,因此常作为研究氧化应激引发炎症和加剧动脉粥样化的研究模型.研究表明,氧化低密度脂蛋白处理后的巨噬细胞存活率显著降低,自噬蛋白L C I I的表达水平升高,因此氧化低密度脂蛋白促进了巨噬细胞自噬.一定的巨噬细胞自噬可以降低炎症反应,稳定易损的斑块区域,进而在动脉粥样硬化过程中发挥作用.极化巨噬细胞不仅能介导快速炎症反应也可以引起炎症诱导突变.K a iS h a n等 利用癌细胞巨噬细胞共培养系统发现,二十二碳六烯酸衍生物溶血素D、D 通过抑制L P S干扰素诱导的M 极化以及促白细胞介素 介导的M a极化而表现出抗炎作用,抑制肿瘤相关巨噬细胞极化.v 细胞v 细胞是一种中国仓鼠肺成纤维细胞,作为细胞模型具有活性好、存活率高等特点,常用于基因突变实验.L e n g l e r等 使用v 细胞进行微核实验研究共轭亚油酸氧化代谢产物呋喃脂肪酸的毒性,结果发现细胞分裂不均衡,产生突变化合物引起微核的形成且有丝分裂活性的降低.该物质在细胞中并没有遗传毒性,而当含量超过 m o l/L时才对v 细胞具有细胞毒性.此外,蛋白质组学数据显示:呋喃脂肪酸主要贮存在脂滴中,以降低细胞代谢活动而使细胞进入休眠状态.未 来 食 品 科 学 ,V o l ,N o 人脐静脉内皮细胞人脐静脉内皮细胞作为细胞模型,获取方便、可传代多次、具有干细胞的潜能.在动物体内注射脂质氧化物可以引发血管内皮细胞和主动脉内膜受损,且病变处黏附聚集了血小板,这表明多不饱和脂肪酸的过氧化物和相关化合物对内皮细胞造成了一定损伤.K a n e k o等 在亚油酸氢过氧化物及其相关脂肪醛对人脐静脉内皮细胞的毒性研究中发现,带有一个羟基或一个额外的双键烯醛的氧化产物毒性较高,其中,十二烯醛的危害最大,且人脐静脉内皮细胞 的致死浓度为m o l/L.研究脂质氧化产物及其相关化合物对人脐静脉内皮细胞的毒性影响对于理解脂质氧化产物对血管的损伤具有重要意义.肾小管上皮细胞由肾小管上皮细胞组成的肾小管是构成肾脏的重要功能单位.肾小管上皮细胞体外构建模型可用于细胞和分子水平上研究肾脏相关疾病的病理机制,且易于观察到形态学变化.D e i a n a等 使用肾小管上皮细胞模型研究了羟基酪醇及其代谢产物对过氧化氢诱导的肾小管上皮细胞脂质过氧化的保护作用,结果发现过氧化氢可导致肾小管上皮细胞内MD A水平显著增加以及破坏细胞膜结构,从而更加直观的显示出脂质氧化产物对肾脏的危害性.细胞模型取材便利,易于培养,存活率高,成本低,但与动物模型相比,仍存在难以长期生存、操作困难等劣势.动物模型常见的动物代谢模型包括小鼠、大鼠、兔子等,研究人员常使用这些动物模型来研究脂质消化代谢及氧化过程和机理,如表所示.小鼠动物模型一般具有繁殖快、可操作性强等特点.小鼠作为经济型实验动物,具有繁殖能力强、生长周期短、饲养方便等优势,且小鼠基因与人体基因高度同源,常用作癌症及各种疾病病理机制的研究模型,基因组在其体内可良好表达.B r e t i l l o n等 用小鼠模型研究了氧化油脂对脂肪酸氧化基因的影响,结果发现在野生型小鼠肝脏中A C O X基因表达水平高出对照组两倍,同时发现环氧脂肪酸通过调节P P A R 基因实现对动物体内参与脂质代谢基因的影响,得出亚麻酸加热过程中形成的环状脂肪酸单体是通过P P A R 基因的介导来干扰肝脏代谢.但是小鼠本身对脂肪的处理方式和人体不同,所以将其用作脂肪类动物实验存在一定的局限性.大鼠采用大鼠作为动物模型,其体型适宜、温顺且易于实验操控,可提供实验分析足够的血液和体液,但与小鼠相比,大鼠的生长周期较长.大鼠被认为是研究高血脂症、动脉粥样化等脂质氧化疾病的最佳模型.F u k u d a等 通过分析大鼠肝脏细胞研究 了 脂 质 氧 化 产 物 对 谷 胱 甘 肽 硫 转 移 酶(g l u t a t h i o n eS t r a n s f e r a s e,G S T s)表达的影响,结果发现HN E对G S T P的激活程度(倍)高于 羟基 壬烯 醛(h y d r o x y h e x e n a l,HH E)(倍),这表明HN E诱导G S T P可能代表了一种重要的氧化损伤细胞防御机制.给予大鼠连续口服脂质氧化产物,可观察到大鼠肝脏、血浆和极低密度脂蛋白中甘油三酯含量明显低于饮食中未含有脂质氧化产物的大鼠,实验数据分析结果显示P P A R 基因被激活,S R E B P 的基因表达被抑制,导致大鼠肝脏胆固醇的 合成和摄取 蛋白 质 的 转 录 受 到抑制 .兔子家兔是一种常见的实验动物模型,饲养方式简单,生长周期短,繁殖速率块,而且耳静脉较粗,易于注射和采血,生理机制与人相似,作为实验模型来说成本较低.W a n gZ h a o m i n g等 研究了脂质氧化产物MD A对家兔肌肉中肌红蛋白和肌原纤维蛋白氧化的影响,结果发现MD A通过促进高价肌红蛋白的形成和非血红素铁的释放来影响R O S生成系统,通过加合反应和影响R O S生成系统来促进兔肌肉中的过氧化进程.T r e s等 研究了在饲料中添加中度氧化葵花籽油,结果发现当油脂中初级氧化产物含量升高时,兔血浆、肝脏和肉中的生育酚含量降低,肉的氧化稳定性下降.加入次级氧化产物含量高的油脂则导致肉的氧化敏感性增加,同时向饲料中添加生育酚可提高动物肝脏和肉类组 ,V o l ,N o 未 来 食 品 科 学 织中的生育酚含量,改善肝脏和肉类的氧化稳定性.猪小猪体内的脂肪消化代谢过程与人类有很多相似之处,因此适合用作脂肪相关的研究实验载体.但是小猪的体积较大,生长周期较长,成本较高.A r o w o l o等 以猪为研究对象,对饲喂含有较高脂质氧化产物(l i p i do x i d a t i o np r o d u c t s,L O P s)的饲料与标准饲料的不同组猪进行探究,将腌制和贮藏(冷藏和冷冻)后猪肉的产品质量和稳定性进行对比,发现饲喂L O P s对肉的颜色没有影响,但它降低了肉在贮藏过程的定性,且肉中L O P s的含量增加了 ,也加快了贮藏肉制品中与不良气味和风味相关的化合物的生成速率.脂质氧化产物危害性评价指标富含多不饱和脂肪酸的脂质在发生氧化反应后,生成的氧化产物一般可以利用气相色谱法(g a sc h r o m a t o g r a p h y,G C)、气相色 谱串联质谱 法(g a sc h r o m a t o g r a p hm a s ss p e c t r o m e t e,G C M S/M S)、氢核 磁 共 振 波 谱 法(n u c l e a r M a g n e t i c R e s o n a n c es p e c t r o s c o p y,H NMR)等方法进行检测.脂质氧化产物在细胞和动物模型中被吸收和代谢后,还可以通过观察细胞形态、存活率、蛋白质和脂质含量、氧化应激产物动物的血脂、血糖、发育情况等方面,更加直观地评价脂质氧化产物的吸收代谢危害性.表动物模型对脂质氧化产物吸收代谢过程产生危害性的研究实例T a b l eS t u d i e so nt h eh a r m f u l n e s so fa n i m a lm o d e l s t o t h ea b s o r p t i o na n dm e t a b o l i s mo f l i p i do x i d a t i o np r o d u c t s动物模型研究目的部位特点研究结果参考文献小鼠氧化油脂对参与脂肪酸氧化的基因的影响肝脏探讨膳食高氧化煎炸油对胰岛的损害胰岛细胞繁殖能力强,生长周期短,饲养方便,但小鼠对脂肪处理机制与人存在较大差异环氧脂肪酸对动物体内参与脂质代谢的基因的表达改变是通过调节P P A R 基因实现的 小鼠胰岛细胞氧化损伤及胰岛素分泌异常 大鼠脂质氧化产物对谷胱甘肽硫转移酶(G S T s)表达的影响肝脏血红素诱导脂质过氧化对结肠细胞的影响结肠细胞体型适宜,易于操控,可提供实验分析足够的血液和体液,但与小鼠相比,生长期较长HN E对G S T P的激活(倍)略高于HH E(倍)血红素铁诱导脂质氧化使结肠细胞凋亡 兔子脂质氧化副产物丙二醛(MD A)对含兔肌肉中肌红蛋白和肌原纤维蛋白氧化的影响胸腰长肌中等氧化油和饲料中含有的锌和生育酚对兔血浆、肝脏和肉类氧化稳定性的影响肝脏易于饲养,生长周期短,繁殖速度块,耳静脉较粗,易于注射和采血,生理机制与人相似,成本较低MD A促进兔肌肉中肌红蛋白和肌原纤维蛋白氧化的能力可能既依赖于加合反应,也依赖于R O S的产生 饲料中添加生育酚可提高肝脏和肉类组织生育酚含量,改善肝脏和肉类的氧化稳定性.猪饲喂猪脂质氧化产物(L O P s)对猪肉品质和贮藏稳定性影响的研究脂肪消化代谢过程与人类相似,体积较大,生长周期较长,成本较高饲喂黄色油脂对肉饼的颜色没有影响,但降低了肉饼在贮藏过程中的脂质氧化稳定性 细胞模型的评价指标 细胞形态脂质氧化产物可引起细胞结构紊乱,导致其完整性、流 动 性 和 通 透 性 改 变 以 及 生 物 膜 功 能 丧失.如图所示,未被氧化的C a c o 细胞单层膜处于健康状态:微绒毛厚而均匀,细丝清晰可见,连接紧密.然而C a c o 细胞的单层膜与氧化亚油酸孵育 h后的图像显示,处于一种不健康的状态:微绒毛少量且呈现不规则形状,连接松散,细胞膜受损.通过检测跨上皮电阻来评估肠细胞单层的完整性,结果观察到细胞的完整性显著降低,这可能是由于R O S的产生引起的.G r e e v e n b r o e k等 发现高浓度饱和脂肪酸对C a c o 细胞形态也存在 未 来 食 品 科 学 ,V o l ,N o 不良影响,如导致细胞内膜的积累和微绒毛的数量明显减少等.棕榈酸含量的增加导致细胞形态的改变,这可能是由于棕榈酸中磷脂的合成增加所致,囊泡转运和甘油三酯分泌减少,因此可在电子显微镜内观察到细胞内膜的积累现象.注:(A)健康状态的c a c o 细胞;(B)与脂质氧化产物共孵育后发生损伤的c a c o 细胞.图脂质氧化产物对C a c o 细胞形态的影响F i g E f f e c t o fL i p i dO x i d a t i o nP r o d u c t so nM o r p h o l o g yo fC a c o C e l l s 细胞存活率脂质氧化产物对细胞的潜在毒性最直观的影响则是导致细胞存活率的降低.脂质氧化产物通过调控细胞凋亡相关基因的表达来影响细胞的存活率.研究表明,脂质氧化产物导致细胞周期阻滞,显著抑制细胞的增殖,同时对细胞的存活率起到抑制作用.L i uY i n g等 研究了油酸热氧化产生的顺式,环氧硬脂酸对H e p G 细胞的细胞毒性,结果发现诱导H e p G 细胞可以阻断细胞周期内G/G 期向S期的转变.氧化脂质处理过的细胞可被氧化 成脂膜,进而 产生有 害 物 醛 类(如HN E、MD A),可与多种大分子反应引起组织损伤.醛类物质通过引起氧化应激反应而在细胞死亡中发挥重要作用.A l g h a z e e r等 用不同氧化程度的鲭鱼油和亚油酸甲酯对C a c o 细胞处理后发现,m o l/L的两种氧化脂质处理的细胞存活率仅分别为 和.然而,一些脂质氧化产物对细胞的毒性较弱,可能与其自身结构存在紧密联系.G r e e n e等 研究了环氧化物水解酶存在的情况下环氧脂肪酸的细胞毒性,发现随着酯长度的增加,化合物的毒性逐渐降低,细胞存活率逐渐增加.氧化应激反应当自由基超出机体抗氧化防御机制的防御能力时,则会发生氧化应激反应.细胞解毒自由基能力下降时就会生成氧化产物(如超氧阴离子、过氧化氢),致使组织损伤.氧化应激反应与多种人类慢性疾病有关,如心血管疾病、衰老、神经退行性疾病、糖尿病和癌症等.当采用脂质氧化产物处理细胞模型后,细胞内的R O S水平显著升高,诱导细胞发生氧化应激反应.I n c a n i等 在C a c o 细胞中发现,氧化甾醇的存在导致细胞内谷胱甘肽的含量减少,MD A、脂