动物细胞工程课件ppt课件.ppt

2.2 动物细胞工程动物细胞工程2.2 2.2 动物细胞工程动物细胞工程生产单克隆抗体生产单克隆抗体常常用用技技术术手手段段动动物物细细胞胞工工程程 动物细胞培养动物细胞培养动物细胞核移植动物细胞核移植动物细胞融合动物细胞融合 动物细胞培养技术动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的是其他动物细胞工程技术的基础。基础。动物细胞工程常用的技术手段技术：动物细胞工程常用的技术手段技术：皮肤烧伤，如果创面很小（不大于硬币）只要保持清洁，甚至深度烧伤，也可能自愈。如果下层真皮受损面积较大，常常需要植皮。植皮需要的健康皮片，可以取自烧伤病人自身未烧伤的部位（自体植皮），也可取自其他活人或尸体（异体植皮）等。自体植皮是永久性的，取自其他人或动物的植皮是暂时性的，是在创面愈合过程中为保护创面而采取的措施，1014天后就要被身体排斥。如果一个大面积烧伤的病人来说，自体皮肤有限，其他渠道的皮肤来源不足。如何才能获得大量的自体健康皮肤？动动物物细细胞胞培培养养技技术术 从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。长和增殖。一、动物细胞培养一、动物细胞培养1 1、动物细胞培养的概念、动物细胞培养的概念原理：原理：细胞增殖细胞增殖人耳鼠“人耳鼠”再出风头 2001年，一只特别的活老鼠在北京引起轰动这是有着一对红眼睛的、尾巴长长的、浑身没毛的小白鼠。值得一提的是，这只小白鼠的背上，竟长着一只几乎与身子一般大小的“人耳”。这只老鼠背上的“人耳”是由上海市第九人民医院副院长、整复外科主任曹谊林教授利用组织工程技术复制出来的。在京展出的数天，尽管门票高达20元，但还是有将近20万人，心甘情愿地掏钱一睹“人耳鼠”的风采。动物细胞培养过程动物细胞培养过程1、选材：、选材：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官动物胚胎或幼龄动物的组织、器官原因：细胞增殖能力强，分裂旺盛，分原因：细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养。化程度低，容易培养。2.2.将组织细胞分散成单个细胞将组织细胞分散成单个细胞v将组织块剪碎，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处将组织块剪碎，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理一段时间，这样组织就会分散成单个细胞。理一段时间，这样组织就会分散成单个细胞。思考：为什么培养前要将组织细胞分散成单思考：为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？个细胞？单个细胞容易和周围环境进行物质交换单个细胞容易和周围环境进行物质交换获得营养物质、氧气等，排出代谢废物；获得营养物质、氧气等，排出代谢废物；分散成单个细胞培养能使细胞水平操作的分散成单个细胞培养能使细胞水平操作的其他技术得以实现其他技术得以实现 。1.1.进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？用胃蛋白酶行吗？用胰蛋白酶分散细胞用胰蛋白酶分散细胞，说明说明细胞间的物质主要是细胞间的物质主要是蛋白质。蛋白质。不能用胃蛋白代替不能用胃蛋白代替因为两者的最适因为两者的最适pHpH不同，动物细胞培养适宜的不同，动物细胞培养适宜的pHpH为为7.27.27.47.4，此环境下胃蛋白酶（，此环境下胃蛋白酶（最适最适pH 2.02.0）没有活性，而胰蛋白酶）没有活性，而胰蛋白酶(最适最适pH 7.2-8.4)7.2-8.4)的活性较高。的活性较高。胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此此必须控制好胰蛋白酶的消化时间必须控制好胰蛋白酶的消化时间。动动动动物物物物组组组组织织织织单单单单个个个个细细细细胞胞胞胞细细细细胞胞胞胞悬悬悬悬液液液液贴贴贴贴壁壁壁壁生生生生长长长长分分分分瓶瓶瓶瓶培培培培养养养养10代代细细胞胞50代代细细胞胞不不死死细细胞胞原代培养原代培养原代培养原代培养传代培养传代培养传代培养传代培养胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶剪碎剪碎剪碎剪碎加培养液加培养液加培养液加培养液接触抑制接触抑制接触抑制接触抑制少数癌变少数癌变少数癌变少数癌变少数少数少数少数3.3.配制细胞悬液，进行原代培养及传代培养配制细胞悬液，进行原代培养及传代培养1 1、细胞贴壁：、细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。称为细胞贴壁。要求：要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。易于贴附。2 2、细胞的接触抑制：、细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制的接触抑制。细胞接触抑制细胞接触抑制 细胞在贴壁细胞在贴壁生长过程中，随生长过程中，随着细胞分裂，数着细胞分裂，数量不断增加，最量不断增加，最后形成一个单层，后形成一个单层，此时细胞间相互此时细胞间相互接触，细胞分裂接触，细胞分裂和生长停止，数和生长停止，数量不再增加。量不再增加。细胞细胞悬浮悬浮液液1010代代细胞细胞5050代代细胞细胞无限传无限传代代原代培养原代培养传代培养传代培养4.4.如何界定原代培养和传代培养？如何界定原代培养和传代培养？随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖原代培养原代培养原代培养原代培养:将动物组织消化后的初次培养。将动物组织消化后的初次培养。将动物组织消化后的初次培养。将动物组织消化后的初次培养。传代培养传代培养传代培养传代培养:对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后再分瓶继对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后再分瓶继对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后再分瓶继对贴满瓶壁的细胞用胰蛋白酶处理，然后再分瓶继续培养。续培养。续培养。续培养。动动物物物物组织块组织块细细胞胞胞胞悬悬液液液液原代培养原代培养原代培养原代培养传代培养传代培养传代培养传代培养胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞散成单个细胞散成单个细胞散成单个细胞幼龄动物的器官组织；动物胚胎幼龄动物的器官组织；动物胚胎幼龄动物的器官组织；动物胚胎幼龄动物的器官组织；动物胚胎动动物物细细胞胞培培养养过过程程细胞贴壁细胞贴壁细胞贴壁细胞贴壁接触抑制接触抑制接触抑制接触抑制原代培养原代培养原代培养原代培养传代培养传代培养传代培养传代培养加入培养液加入培养液加入培养液加入培养液用胰蛋白酶等用胰蛋白酶等用胰蛋白酶等用胰蛋白酶等处理贴壁细胞处理贴壁细胞处理贴壁细胞处理贴壁细胞适宜条件适宜条件适宜条件适宜条件不死性细胞不死性细胞不死性细胞不死性细胞 多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考以下问题：根据你所学的内环境的知识，思考以下问题：1.1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？体外培养细胞时需要提供哪些物质？2.2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？体外培养的细胞需要什么样的环境条件？充足营养（糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元充足营养（糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等合成成分及血清、血浆等天然成分。）素等合成成分及血清、血浆等天然成分。）适宜温度、适宜温度、PHPH和气体环境；无菌无毒环境和气体环境；无菌无毒环境 无菌无毒环境、充足营养无菌无毒环境、充足营养（血清或血浆）、（血清或血浆）、适适宜温度、宜温度、PHPH、气体环境。、气体环境。4、体外培养动物细胞需要物质和环境条件、体外培养动物细胞需要物质和环境条件无菌、无毒的环境无菌、无毒的环境 对培养液、培养用具进行无菌处理；对培养液、培养用具进行无菌处理；在培养液中加抗生素；在培养液中加抗生素；定期更换培养液。定期更换培养液。充的营足养充的营足养 葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、葡萄糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、微量元素、血浆或血清血浆或血清为什么要加血清呢？为什么要加血清呢？为什么要加血清呢？为什么要加血清呢？温度和温度和PH 36.50.5 0.5；PH=7.27.4PH=7.27.4气体环境气体环境O2和和CO2 C0C02 2的主要作用是维持培养液的的主要作用是维持培养液的PHPH。含含 95%95%空气加空气加 5%CO5%CO2 2 混合气体混合气体1 1、大规模的生产生物制品。、大规模的生产生物制品。2 2、作为基因工程的受体细胞。、作为基因工程的受体细胞。3 3、检测判断物质的毒性。、检测判断物质的毒性。4 4、用于生理、病理、药理等方面的研究。、用于生理、病理、药理等方面的研究。三、动物细胞培养技术的三、动物细胞培养技术的应用：应用：5 5、培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植1 1、大规模的生产生物制品。、大规模的生产生物制品。2 2、培养的动物细胞作为基因工程的受体、培养的动物细胞作为基因工程的受体细胞。细胞。3 3、检测判断物质的毒性。、检测判断物质的毒性。4 4、培养正常或各种病变的细胞，用于生、培养正常或各种病变的细胞，用于生理、病理、药理等方面的研究，如用于理、病理、药理等方面的研究，如用于 等，为等，为 及其及其他疾病提供理论依据。他疾病提供理论依据。三、动物细胞培养技术的三、动物细胞培养技术的应用：应用：筛选抗癌药物筛选抗癌药物治疗和预防癌症治疗和预防癌症（五）、动物细胞培养技术的应用（五）、动物细胞培养技术的应用（3）细胞的生理、药理、病理研究）细胞的生理、药理、病理研究（1）培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植培养健康细胞用于烧伤病人皮肤移植（2）基因工程的受体细胞基因工程的受体细胞植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理细胞的细胞的 细胞细胞培养基特有培养基特有成分成分 、植物激素、植物激素 葡萄糖、葡萄糖、培养结果培养结果植物体植物体培养目的培养目的快速繁殖、培育快速繁殖、培育无病毒植株无病毒植株获得获得全能性全能性增殖增殖蔗糖蔗糖动物动物血清血清细胞株、细胞系细胞株、细胞系细胞细胞,或细或细胞分泌蛋白胞分泌蛋白植物组织培养和动物细胞培养的比较植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目比较项目植物组织培养植物组织培养动物细胞培养动物细胞培养原理原理细胞的全能性细胞的全能性细胞增殖细胞增殖培养基性质培养基性质固体固体培养基培养基液体液体培养基培养基培养基特有成分培养基特有成分蔗糖蔗糖 植物激素植物激素葡萄糖葡萄糖 动物血清动物血清培养结果培养结果植物体植物体细胞细胞培养目的培养目的快速繁殖、快速繁殖、培育无病毒植株培育无病毒植株获得细胞获得细胞或细胞分泌蛋白或细胞分泌蛋白资料一：资料一：培养的动物细胞可以用于培养的动物细胞可以用于检测有毒物质检测有毒物质。许。许多致畸、致癌物质加入培养液后，培养细胞会发多致畸、致癌物质加入培养液后，培养细胞会发生染色体结构和数目的变异。根据变异细胞占全生染色体结构和数目的变异。根据变异细胞占全部培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。部培养细胞的百分数，可以判断某种物质的毒性。现在动物细胞培养已经成为检测有毒物质的快速现在动物细胞培养已经成为检测有毒物质的快速而灵敏的有效手段。而灵敏的有效手段。资料二：资料二：人工关节人工关节软骨再生软骨再生1.1.第一次手第一次手术术:从从病人病人关节软骨关节软骨中未中未 受力的部分，取出一片受力的部分，取出一片约为约为葡萄葡萄干干大大小的健康小的健康软软骨骨组织组织。2.2.分分离软离软骨骨细胞并经细胞并经三星期的三星期的体体外外 培培养养，使，使细胞数细胞数增加增加约约10102020倍。倍。3.3.第二次手第二次手术术:清理清理软软骨受骨受损损的部分，的部分，从从下方骨下方骨头头部位取出一片部位取出一片约与伤约与伤口口大大小相同的骨膜，小相同的骨膜，缝缝在在伤伤口上方，再口上方，再将将软软骨骨细胞细胞注射到骨膜下方。注射到骨膜下方。资料三：资料三：结果结果:经过复健经过复健一年一年后后即可即可恢复恢复正常的生活。正常的生活。二二.动物细胞动物细胞核移植技术和克隆动物核移植技术和克隆动物 将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体的胚胎最终发育为动物个体的胚胎最终发育为动物个体的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）（克隆动物）（克隆动物）（克隆动物）。分分类类胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植：体细胞核移植体细胞核移植：细胞分化程度低，细胞分化程度低，恢复全能性容易；恢复全能性容易；细胞分化程度细胞分化程度高高，恢复全能性恢复全能性不不容易容易1.1.动物细胞动物细胞核移植概念：核移植概念：（难度高难度高）克隆动物：用核移植的方法得到的动物。克隆动物：用核移植的方法得到的动物。(二二)、体细胞核移植的过程：、体细胞核移植的过程：请看教材请看教材P48P48图图2-212-21思考：思考：1.1.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？用此细核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？用此细胞作为受体细胞有什么好处？胞作为受体细胞有什么好处？2.2.通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？M M中期卵母细胞中期卵母细胞诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。细胞分裂和发育进程。卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物质丰富，卵母细胞体积大，便于操作；含有营养物质丰富，提供早期胚胎发育所需的营养；含有激活细胞核体提供早期胚胎发育所需的营养；含有激活细胞核体现全能性的物质。现全能性的物质。电电激激激激处处理使供理使供理使供理使供体核体核体核体核进进入受体入受体入受体入受体卵母卵母卵母卵母细细胞构建胞构建胞构建胞构建重重重重组组胚胎胚胎胚胎胚胎卵母卵母卵母卵母细细胞采集、培养胞采集、培养胞采集、培养胞采集、培养MM期期期期卵母卵母卵母卵母细细胞胞胞胞供体牛供体牛供体牛供体牛供体供体供体供体细细胞注入胞注入胞注入胞注入去核卵母去核卵母去核卵母去核卵母细细胞胞胞胞代孕母牛代孕母牛代孕母牛代孕母牛克隆牛克隆牛克隆牛克隆牛体体体体细细胞培养胞培养胞培养胞培养去核卵母去核卵母去核卵母去核卵母细细胞胞胞胞去核去核去核去核胚胎胚胎胚胎胚胎移植移植移植移植体细胞核移植过程体细胞核移植过程（体细胞克隆动物）（体细胞克隆动物）、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为使核移植使核移植动物的物的遗传物物质全部来自有利用全部来自有利用价价值的的动物提供的物提供的细胞。胞。、用于核移植的供体细胞一般都选用传代、用于核移植的供体细胞一般都选用传代1010代以内的细胞，为什么？代以内的细胞，为什么？10代以内的代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，胞一般保持正常二倍体的核型，未未发生突生突变思考题思考题3 3、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？的复制吗？为什么？不是，克隆不是，克隆动物物绝大部分大部分DNA来自供体来自供体细胞胞核，但核外核，但核外还有少部分有少部分DNA（如（如线粒体粒体DNA）来自受体卵母）来自受体卵母细胞胞思考题思考题 1996 1996年，英国人年，英国人Ian Ian WilmutWilmut成功获得成功获得体细胞克隆体细胞克隆羊羊“多利多利”，这是世界上这是世界上第第一例利用成年体细胞核获得一例利用成年体细胞核获得的克隆动物的克隆动物.277277次次乳乳腺腺细细胞胞核核移植实验；移植实验；获获得得2929个个发发育育为为8 8细胞的细胞的“胚胚”；1313头代孕母亲；头代孕母亲；19961996年年7 7月月5 5日日，羊羊羔羔6LL36LL3，被被命命名为名为“多莉多莉”。多多莉莉羊羊的的培培育育过过程程“多多莉莉羊羊”是是雄雄还还是是雌雌？是是否否符符合合孟孟德德尔尔遗遗传传？问题卵细卵细胞胞C母绵羊子宫母绵羊子宫母绵羊母绵羊母绵羊母绵羊乳腺细胞乳腺细胞卵细胞质卵细胞质细胞核细胞核细胞核移植胚胎移植胚胎移植早期胚胎早期胚胎多莉羊多莉羊分娩分娩卵裂卵裂融合后的卵细胞融合后的卵细胞妊娠妊娠3.3.体细胞核移植技术的应用前景：体细胞核移植技术的应用前景：1.1.加速家畜遗传改良的加速家畜遗传改良的进程进程2.2.保护濒危物种保护濒危物种3.3.生产医用蛋白质及生产医用蛋白质及组织器官的移植组织器官的移植4.4.了解胚胎发育和衰老了解胚胎发育和衰老过程；过程；5 5、追踪研究疾病的发、追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病展过程和治疗疾病4 4、体细胞核移植技术存在的问题、体细胞核移植技术存在的问题 P50（1 1）成功率非常低）成功率非常低（2 2）克隆动物存在健康问题，表现出遗传和）克隆动物存在健康问题，表现出遗传和生生理缺陷理缺陷 （3 3）食品的安全性问题存在争议）食品的安全性问题存在争议思考与探究思考与探究1.1.幼龄与老龄动物的组织细胞比较，分化程度低的幼龄与老龄动物的组织细胞比较，分化程度低的与分化程度高的组织细胞比较，哪一种更易于培养与分化程度高的组织细胞比较，哪一种更易于培养？思考一下，这是什么道理？思考一下，这是什么道理？细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关细胞的衰老与动物机体的衰老有着密切的关系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动系，细胞的增殖能力与供体的年龄有关，幼龄动物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则物细胞增殖能力强，有丝分裂旺盛，老龄动物则相反。相反。所以，所以，一般来说幼年动物的组织细胞比老年一般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。动物的组织细胞易于培养。同样，同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养力越强，所以更容易培养。思考与探究思考与探究2.2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？为什么？动物细胞培养动物细胞培养不需不需经过脱分化过程。经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力去了发育成完整个体的能力 要想使培养的动物细胞定向分化，通要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用常采用定向诱导动物干细胞定向诱导动物干细胞，使其分化成，使其分化成所需要的组织或器官。所需要的组织或器官。3.19973.1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（名叫卢辛达（LucindaLucinda）的奶牛，年产奶量为）的奶牛，年产奶量为30.8 t30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为3 34 4 t t。（1 1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。达吗？请说明理由。可以。卢辛达的产奶量很高，有高产奶的遗传基础，可以。卢辛达的产奶量很高，有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。的后代，从而加快奶牛改良进程。（2 2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？给你，你将如何对它进行克隆？从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成细胞分裂和发育过程。核的卵母细胞，使其完成细胞分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。4.4.体细胞核移植技术在研究和应用上还存体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。的前沿动态。研究方面研究方面：克隆动物基因组重新编程的机制克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些率高、死亡率高、易出现早衰等问题。这些问题尚在研究中。问题尚在研究中。应用上应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。应用还有一定距离。4 4、一般说来，动物细胞体外培养需要满足以下条件（、一般说来，动物细胞体外培养需要满足以下条件（）无毒的环境无毒的环境 无菌的环境无菌的环境 培养基需要加入血培养基需要加入血清清 温度与动物体温相似温度与动物体温相似 需要需要O O2 2，不需要，不需要COCO2 2 COCO2 2能调节培养液能调节培养液PHPHA A、B B、C C、D D、D D5 5、动物细胞培养的特点、动物细胞培养的特点 （）细胞贴壁细胞贴壁 有丝分裂有丝分裂 细胞分化细胞分化 接触抑制接触抑制 减数分裂减数分裂 原代培养一般传原代培养一般传1 11010代代A A、B B、C C、D D、A A6 6、下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据、下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此回答：此回答：（1 1）容器）容器A A中放置的是动物器官或组织。它一中放置的是动物器官或组织。它一般取自般取自_。（2 2）容器）容器A A中的动物器官或组织首先要进行的中的动物器官或组织首先要进行的处理是处理是 ，然后用，然后用 酶处理，酶处理，这是为了使细胞分散开来，这样做的目的是这是为了使细胞分散开来，这样做的目的是 。动物胚胎或幼龄动物动物胚胎或幼龄动物剪碎剪碎胰蛋白胰蛋白使细胞与培养液充分接触，便于培养使细胞与培养液充分接触，便于培养（3 3）培养首先在）培养首先在B B瓶中进行，瓶中的培养基成瓶中进行，瓶中的培养基成分有分有 _等。在此瓶中培养等。在此瓶中培养一段时间后，有许多细胞衰老死亡，这是培养一段时间后，有许多细胞衰老死亡，这是培养到第到第 代，到这时的培养称为代，到这时的培养称为_ _ 。（4 4）为了把）为了把B B瓶中的细胞分装到瓶中的细胞分装到C C瓶中，用瓶中，用 处理，然后配置成处理，然后配置成 ，再，再分装。分装。动物血清动物血清10原代培养原代培养胰蛋白酶胰蛋白酶细胞悬浮液细胞悬浮液知识拓展知识拓展2 2.为什么动物细胞要分散成单个细胞培养？用酶消化的为什么动物细胞要分散成单个细胞培养？用酶消化的是什么物质？是什么物质？细胞原代培养时可以分散成单个细胞培养，也可以用细胞细胞原代培养时可以分散成单个细胞培养，也可以用细胞群（团）、组织块培养，经传代培养后，最终都为细胞培群（团）、组织块培养，经传代培养后，最终都为细胞培养。养。分散成单个细胞、细胞群（团）后容易培养，细胞所需的分散成单个细胞、细胞群（团）后容易培养，细胞所需的营养容易供应，其代谢废物容易排出；而用大块组织培养营养容易供应，其代谢废物容易排出；而用大块组织培养时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难，因时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难，因此，这些细胞在体外长时间的生存和生长就较困难。同时，此，这些细胞在体外长时间的生存和生长就较困难。同时，分散成单个细胞培养，可使得在细胞水平操作的其他技术分散成单个细胞培养，可使得在细胞水平操作的其他技术得以实现。得以实现。用酶消化的是细胞间基质，细胞间基质主要成分有胶原蛋用酶消化的是细胞间基质，细胞间基质主要成分有胶原蛋白、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、弹性蛋白等成分。用蛋白白、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、弹性蛋白等成分。用蛋白酶可使其消化，从而使细胞相互分离。酶可使其消化，从而使细胞相互分离。知识拓展知识拓展3 3.体细胞核移植技术为什么要选择体细胞核移植技术为什么要选择MM期的卵母细期的卵母细胞做受体细胞？胞做受体细胞？细胞核移植技术中能用作受体细胞的通常有细胞核移植技术中能用作受体细胞的通常有MM期卵母细胞期卵母细胞和受精卵（合子）。早期核移植技术中常用受精卵，后来和受精卵（合子）。早期核移植技术中常用受精卵，后来基本上用基本上用MM期卵母细胞取代了受精卵，主要因为两者的细期卵母细胞取代了受精卵，主要因为两者的细胞质环境不同。有人认为重组需要的因子存在于胞质环境不同。有人认为重组需要的因子存在于MM期卵母期卵母细胞的胞质中，而在原核形成时这些因子已被降解或用光，细胞的胞质中，而在原核形成时这些因子已被降解或用光，因此，原核扩张后受精卵去核可引起胞质中重组因子缺乏。因此，原核扩张后受精卵去核可引起胞质中重组因子缺乏。成熟促进因子（成熟促进因子（MPFMPF）是卵母细胞细胞质中重要的胞质影响）是卵母细胞细胞质中重要的胞质影响因子，因子，MPFMPF的活性在卵母细胞减数分裂的的活性在卵母细胞减数分裂的MIMI期和期和MM期达到期达到最高，受精或激活后，最高，受精或激活后，MPFMPF迅速灭活，因此，迅速灭活，因此，MM期卵母细期卵母细胞中胞中MPFMPF活性高，而受精卵中活性高，而受精卵中MPFMPF活性低。活性低。MPFMPF水平的高低可水平的高低可影响供体核染色质的状态和复制。影响供体核染色质的状态和复制。MM期卵母细胞细胞核、期卵母细胞细胞核、细胞质已成熟，而细胞质已成熟，而MIMI卵母细胞细胞核、细胞质尚未成熟，卵母细胞细胞核、细胞质尚未成熟，其细胞质不能支持胚胎的全程发育，因此，尽管其细胞质不能支持胚胎的全程发育，因此，尽管MIMI期卵母期卵母细胞细胞MPFMPF活性也高，但不能用作受体卵母细胞。活性也高，但不能用作受体卵母细胞。也有人认为用去核合子做受体时，可能由于合子去核时一也有人认为用去核合子做受体时，可能由于合子去核时一些早期发育必需的因子随原核的去除而被去掉了，而使去些早期发育必需的因子随原核的去除而被去掉了，而使去核受精卵缺乏发育能力。因此，目前广泛采用核受精卵缺乏发育能力。因此，目前广泛采用M M期卵母细期卵母细胞做受体。胞做受体。