MSI诊断检测的方法和应用PPT课件.ppt

MSI诊断检测的方法和应用1.主 要 内 容 微卫星不稳定的相关背景MSI的检测意义MSI检测方法MSI检测试剂盒2.背 景 介 绍 微卫星不稳定性(microsatellite instability,(microsatellite instability,MSI)MSI)是指与正常组织相比，在肿瘤中某一微卫星由于重复单位的插入或缺失而造成的微卫星长度的任何改变，出现新的微卫星等位基因现象。主要机制：DNA DNA多聚酶的滑动导致重复序列中1 1个或多个碱基的错配 MS MS同源重组导致碱基对的丢失和插入3.19931993年，AltonenAltonen等首次发现，在HNPCCHNPCC细胞中存在高频率的MSIMSI。目前已发现MSIMSI的肿瘤主要有3 3类：一类为HNPCCHNPCC病人发生的结直肠癌、子宫内膜癌以及卵巢癌,这一类肿瘤几乎都表现为MSIMSI；另一类为散发性结直肠癌,这一类肿瘤发生MSIMSI概率约15 30；第三类为包括肺癌、乳腺癌和胰腺癌在内的其它肿瘤,这一类肿瘤MSIMSI发生频率相对较低。背 景 介 绍4.结直肠癌是是常见的消化道恶性肿瘤，我们每年有1313万-16-16万人罹患结直肠癌，其发病率占肿瘤发病率的第三位，仅次于肺癌和胃癌。HNPCCHNPCC是常见的遗传性肿瘤综合症，遗传性结直肠癌是一个常染色体遗传疾病,目前研究表明微卫星不稳定性可能是遗传性结直肠癌发生的重要机制。背 景 介 绍5.具有MSI的散发性结直肠癌,具有不同的临床病理、分子生物学特征,表现为:发病年龄较小；对某些化疗药物(如5-FU、顺铂等)有原发性耐药;生物学行为较好。MSI-H是期结肠癌预后良好的一个标志物，也是患者不能从氟尿嘧啶单药辅助化疗获益的疗效预测指标。背 景 介 绍6.微卫星不稳定检测的意义1.1.检测MSIMSI可以用于检测是否为LynchLynch综合征结直肠癌的遗传易感性包括一些研究较清楚的遗传性综合征，例如LynchLynch综合征（又称之为遗传性非息肉病性结直肠癌，HNPCCHNPCC）和家族性息肉病（FAPFAP）。在HNPCC HNPCC 和散发性直肠癌中的微卫星不稳定性是遍布整个基因组的现象，并且可能是导致癌症发生的普遍机制。7.专家组推荐，MMRMMR蛋白检测应强烈建议在所有5050岁以下的结肠癌患者中开展，原因在于该群体中患LynchLynch综合征的可能性增加。而且，在一些中心，现在对所有的结直肠肿瘤组织进行免疫组化检测（有时分析MSIMSI）以来决定哪些患者需要进行LynchLynch综合征相关的基因检测.微卫星不稳定检测的意义8.2.检测MSI可以用于判断患者预后高危期患者，定义为预后较差者，包括：T4（B、C期）、组织学分化差（3/4级，不包括MSI-H者），已经有大量证据表明MMR蛋白表达缺失或MSI-H是期结肠癌预后良好的一个标志物。具有MSI-H肿瘤的期结肠癌患者，3/4级分化（低分化）不再认为是高危因素。微卫星不稳定检测的意义9.3.3.检测MSIMSI以判断是否需要辅助化疗对于期结肠癌是否需要辅助化疗，在做临床决策时需要考量的一个重要信息就是微卫星不稳定性（MSIMSI）。研究认为MMR MMR 基因为MSI-HMSI-H（高度微卫星不稳定）会对顺铂、卡培他滨及5-FU 5-FU 产生耐药性，相反MSI-LMSI-L、MSS MSS 的患者不会产生耐药。微卫星不稳定检测的意义10.一项研究长期随访了/期结肠癌患者后发现，MSI-LMSI-L或MSSMSS者通过5-FU5-FU辅助化疗确实改善了预后；然而，MSI-HMSI-H者却不能从术后5-FU5-FU辅助化疗中显著获益，与单纯手术相比，5-5-年生存率反而更低。微卫星不稳定检测的意义MSI 检 测 方 法1.免疫组化方法(IHC)免疫组化方法仅用于与肿瘤细胞中的MLH1,MSH2,MSH6和PMS2蛋白结合。如果没有结合任何的蛋白，就证明发生了MSI。2.直接测序法 对MMR基因各区域（MLH1、MSH2、MSH6等）的扩增产物直接测序。3.多重荧光PCR 采用多重荧光PCR的方法对NCI建议的位点进行扩增，以确定MSI状态。12.检 测 MSI 方 法 比 较 方法灵敏度特异性重现性时间成本操作IHC90%低低3-5天5001000复杂直接测序法80100%高高5-7天10002000 简便多重荧光PCR100%高高2-3天5001000 简便13.Microread MSI 检 测 试 剂 盒 阅微基因根据NCCNNCCN指南，针对结直肠癌基因诊断领域研发了MSIMSI检测的试剂盒。微卫星不稳定（microsatellite instabilitymicrosatellite instability，MSIMSI）检测试剂盒是一款以多重荧光PCRPCR技术为基础的基因突变检测系统，一次扩增检测6 6个MSIMSI位点，操作简便、快速。14.扩 增 检 测 位 点位点GenBankNumber重复序列产物范围1标记荧光类型NR-27AF070674(A)2770-91HEXNR-21XM_033393(A)2192-113FAMBAT-26U41210(A)26160-185FAMBAT-25L04143(A)25105-125HEXNR-24X60152(A)24119-139TMRMONO-27AC007684(A)27155-177TMRPenta CAL138752(AAAAG)3-15190-250FAMPenta DAC000014(AAAAG)2-17151-224HEXAmel-107/113TMR15.MSI 检 测 送 样 要 求 若客户提供石蜡切片，则要求厚度5-20m的石蜡切片（切片中确保含有9mm2以上大小的组织块）10片或以上，注明石蜡包埋组织的保存年限，组织类型和包埋前处理方式等。若客户提供DNA样品，则从新鲜组织提取的DNA最佳，20ng/l以上的DNA 20l即可（需提供DNA浓度）；若为石蜡包埋组织提取的DNA，除了提供DNA的浓度（20ng/l以上的DNA至少20l）外，还需提供琼脂糖凝胶电泳图16.MSI 检 测 试 剂 盒 使 用 方 法DNA提取：根据样本不同，采用二甲苯或Chelex 100的方法提取DNA；PCR扩增：毛细管电泳检测：按照（0.5lROX500）样品数+（8.5l甲酰胺）样品数制备好样品，RUN 3130 xl遗传分析仪。组分20 l体系(l)Master Mix无核酸酶超纯水6.02.5PCR Mix8.05MSI引物混合物4.0模板DNA2.0反应总体积20.017.操 作 流 程 示 意 图18.数 据 分 析n 目的峰：A.单核苷酸标记的位点NR21、Bat26、NR27、Bat25、NR24、Mono27的峰型均为类似五指的手掌峰，见图2；图2 单核苷酸标记位点峰型示意图19.B.五核苷酸重复的位点Penta C、Penta D和性别位点Amelogenin的峰型均为单峰型，见图3。图3 五核苷酸标记和性别位点峰型示意图n 非目的峰：pull-up峰、stutter峰、染料峰、加A不完全峰等。数 据 分 析20.MSI 判 定 结 果微卫星不稳定MSI-H型 根据NCI建议，与正常样本比较，有2个发生改变可称定为MSI-H型，只有1个出现不稳定的为MSI-L型，没有出现突变的情况为MSS型。21.微卫星不稳定MSI-L型MSI 判 定 结 果22.微卫星稳定MSS型MSI 判 定 结 果23.MSI 检 测 试 剂 盒 优 点 基于MSIMSI的NCI panelNCI panel标准开发了适合中国人群的MSIMSI检测系统；采用多重荧光PCRPCR技术，一次扩增和检测6 6个准单态性单核苷酸微卫星基因座，其中5 5个与国外检测相吻合，另外增加了一个适合中国人群的位点；基于测序仪的基因分型研究领域拥有多年的经验和多项成果，已经做了超过10001000例病例样本，积累了丰富的经验和数据基础。24.MSI 检 测 案 例XBH-XXBH-1*接收委托方两份样本，正常组织XBH-X和肿瘤组织XBH-1，要求鉴定肿瘤组织的MSI状态，正常对照样本分型正确，肿瘤组织样品在BAT-26、NR-27、BAT-25、NR-24和MONO-27等5个位点出现双峰。该肿瘤组织为MSI-H型。25.13MS6E13MS6C*接收委托方两份检材，分别为肿瘤组织13MS6C和正常组织13MS6E，要求检测该肿瘤组织的MSI状态，6个单核苷酸位点均未出现MSI，鉴定结果为MSS稳定状态。MSI 检 测 案 例26.阅 微 基 因 诊 断 试 剂 简 介n 脆性X综合征检测试剂盒 五种特性检测脆性X综合征：准确计算CGG重复数、灵敏度高于Southern杂交、可识别女性纯合子及杂合子、检测AGG插入、结果100%可重复。n 白血病BCR-ABL1检测试剂盒 检测三种最常见BCR-ABL1变体；可进行绝对定量；灵敏度达10-5；整合ARQ技术，检测结果稳定、准确；成本较低。27.n Y微缺失检测试剂盒 操作简便；8小时内得到结果；模版需要量低；检测位点包含EAA/EMQN指导意见位点；每个样品只需一个扩增检测反应；可检测AZFb、AZFc区各常见部分缺失及复制；可同时对克氏综合症进行检测。n21三体综合征检测试剂盒 周期短、准确性高、灵敏度高、可清晰判断样本污染情况、对于部分易位和嵌合体有更好的检出率阅 微 基 因 诊 断 试 剂 简 介28.29.