蛋白质等电点的测定教学提纲.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,蛋白质等电点的测定,蛋白质的解离性质,蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡：,蛋白质的等电点,蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。,当溶液的,pH,达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动,，此时溶液的,pH,值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。,最常用的方法是：,测其溶解度最低时的溶液,pH,值。,等电聚焦电泳测其净电荷为零时的,PH,浊度、分光光度法,基于蛋白质与离子交换的作用,一、测定溶解度最低时的溶液,PH,实验原理：,借观察在不同,pH,溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与酷酸钠,(,醋酸钠混合在酪蛋白溶液中,),配制成各种不同,pH,值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的,pH,值即为酪蛋白的等电点。,器材：,水浴锅、温度计、,200,毫升锥形瓶、,100,毫升容量瓶、吸管、试管、试管架、乳钵,试剂：,(1)0.4,酪蛋白醋酸钠溶液,(2)1.00,摩尔升醋酸溶液,(3)0.10,摩尔升醋酸溶液,(4)0.01,摩尔升醋酸溶液,实验器材与试剂：,实验步骤：,(1),取同样规格的试营,4,支，按下表颠序分别精确地加入各试剂，然后混匀。,试管号,蒸馏水（,ml,）,0.01M,醋酸（,ml,）,0.1M,醋酸（,ml,）,1M,醋酸（,ml,）,1,8.4,0.6,2,8.7,0.3,3,8.0,1.0,4,7.4,1.6,(2),向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液,1,毫升，加一管，摇句一管。此时,1,、,2,、,3,、,4,管的,pH,值依次为,5.9,、,5.3,、,4.7,、,3.5,。观察其混浊度。静置,10,分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管的,pH,即为酪蛋白的等电点。,二、等电聚焦电泳,原理：,1,）有一类两性电解质：它具有依次递变而又相差不大的等电点，在电场下形成递变而又连续的,pH,梯度，故在电泳介质中加入这种物质则能造成介质,pH,由酸到碱逐步变化。,2),各种蛋白质,pI,不同,3,）两性电解质载体在电场作用下，按各自,pI,形成从阳极到阴极逐渐增加的连续而稳定的,pH,梯度,以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持介质，并在凝胶中加入两性电解质载体，在电场作用下，蛋白质在此,pH,梯度的凝胶中泳动，当迁移至,pH,值等于,pI,处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带,。,三、实验试剂与仪器,1,）两性电解质,2,）,30,丙烯酰胺溶液,3,）,TEMED,4,）,10,过硫酸铵溶液,5,）负极缓冲液：,0.1M NaOH,正极缓冲液：,0.1M,磷酸或硫酸,固定液：,10,（,W/V,）三氯乙酸,染色液,脱色液,蛋白质等电点标准,电泳仪,圆盘电泳槽,图 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图,(A,为正面,B,为剖面,),四、操作方法,1.,凝胶柱的制备,（,1,）玻璃管的一端插在橡皮帽中,（,2,）配胶,表,10mL 7.5%,凝胶的配制,试 剂 名 称 体积,(mL),凝胶贮液,2.5,两性电解质载体,0.5,蒸馏水,6.75,10%,过硫酸铵,0.05,10%TEMED 0.1,蛋白质混合样品,0.1,混匀后置真空干燥器中抽气,10 min,（,3,）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管中，至离上端,1 cm,处，再用注射器缓缓加水,3-5 mm,高。,（,4,）待凝胶聚合,2.,电泳,将装有胶的玻管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中装入,0.1mol/L,氢氧化钠溶液，在下槽中加入,0.1mol/L,磷酸缓冲液。连接到电泳仪，接通电源，调电压至,160 V,，聚焦过夜，至电流降为,0,，则可关闭电源。,3,剥胶,电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水洗净两端电极液，在凝胶条的正极端作上标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条即可流出。,4.,固定染色,取出凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝胶条长度。放入带盖试管中加入固定液。固定,20min,2,后，倒掉固定液,后用脱色液漂洗,2,次,，再,染色,1h,，用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端的距离。,5.,蛋白质条带聚焦位置的计算,求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为：,蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离,固定染色前凝胶条长度,固定染色后凝胶条长度,三、浊度、分光光度法,溶液的,pH,值与蛋白质等电点相同时，静电荷为,0,，当溶液,pH,值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的,pH,值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的,pH,值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。,此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢,