常规病理检查重点PPT课件.ppt

常规组织病理学技常规组织病理学技术术固固 定定取取 材材脱水，透明，浸蜡脱水，透明，浸蜡包包 埋埋切片切片镜下观察，诊断镜下观察，诊断常规病理学技术（病理工作流程）常规病理学技术（病理工作流程）快速冰冻快速冰冻取材取材常规组织处理常规组织处理OCTOCT包埋包埋细胞学检查细胞学检查取材取材染色染色固定固定组织固定组织固定目的：目的：l保保持持组组织织和和细细胞胞的的形形态态学学特特征征，防防止止因因为为酶酶活活性性或或微微生生物物而而使组织坏死，自溶及腐败。使组织坏死，自溶及腐败。l保持组织和细胞中可溶性成分不被溶解。保持组织和细胞中可溶性成分不被溶解。l减少蛋白质、脂肪、糖、酶等细胞成分丢失。减少蛋白质、脂肪、糖、酶等细胞成分丢失。l维持细胞膜，内质网，核膜等细胞结构的完整。维持细胞膜，内质网，核膜等细胞结构的完整。组织固定组织固定目的：目的：l使使组组织织中中的的各各种种物物质质沉沉淀淀和和凝凝固固起起来来，产产生生不不同同的的折折射射率率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。l固定剂兼有硬化作用，使组织硬化增加组织硬度，便于制片。固定剂兼有硬化作用，使组织硬化增加组织硬度，便于制片。l防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。l经经过过固固定定的的组组织织，能能对对染染料料产产生生不不同同的的亲亲和和力力而而着着色色清清晰晰，便于辩认。便于辩认。组织固定组织固定固定的机制和原理有很多种，包括固定的机制和原理有很多种，包括:l反应基团间的共价结合反应基团间的共价结合l交联的共价结合交联的共价结合l脱水与酸性物质作用脱水与酸性物质作用l盐的形成和热能盐的形成和热能l共同作用共同作用组织固定组织固定理想的固定剂：理想的固定剂：l保留蛋白，保留蛋白，mRNAmRNA以及以及DNADNA的生化特征。的生化特征。l支持组织化学染色，免疫组化，原位杂交和各种其他技术。支持组织化学染色，免疫组化，原位杂交和各种其他技术。l能快速渗透和固定组织。能快速渗透和固定组织。l适合各种不同的组织和不同大小标本的固定。适合各种不同的组织和不同大小标本的固定。l固定剂易于回收和处理，价格合理。固定剂易于回收和处理，价格合理。l无毒，无害，无可燃性。无毒，无害，无可燃性。组织固定组织固定固定剂的种类：固定剂的种类：1 1、按照化学性质分类、按照化学性质分类l类类：醛醛类类：甲甲醛醛，戊戊二二醛醛，多多聚聚甲甲醛醛，丙丙烯烯醛醛，已已二二醛醛，丙二醛等。丙二醛等。l类类：氧氧化化剂剂类类：四四氧氧化化锇锇（奥奥酸酸），高高锰锰酸酸钾钾，重重铬铬酸酸钾等。钾等。l类：蛋白变性类：甲醇，乙醇，醋酸等类：蛋白变性类：甲醇，乙醇，醋酸等l类：其他：氯化汞，苦味酸等类：其他：氯化汞，苦味酸等。2 2、按照成分分类：、按照成分分类：l单一固定液：如甲醛，酒精，醋酸，锇酸，丙酮等单一固定液：如甲醛，酒精，醋酸，锇酸，丙酮等l混合固定液：中性甲醛，混合固定液：中性甲醛，AFAF液等液等组织固定组织固定常用的固定方法常用的固定方法l蒸蒸汽汽固固定定法法：甲甲醛醛或或锇锇酸酸可可产产生生蒸蒸汽汽。用用于于保保存存可可溶溶性性成成分；小而薄的组织，冷冻干燥组织分；小而薄的组织，冷冻干燥组织l灌注固定法：肺，肾脏，肝脏等灌注固定法：肺，肾脏，肝脏等l细细胞胞涂涂片片的的固固定定：浸浸入入法法和和滴滴加加法法，浸浸入入法法应应注注意意相相互互污污染的问题染的问题l微微波波固固定定法法：微微波波加加热热可可缩缩短短固固定定时时间间，但但时时间间和和温温度度掌掌握困难握困难常用固定液介绍常用固定液介绍甲醛（分子式甲醛（分子式:HCHO:HCHO）固定）固定:l纯甲醛是一种蒸汽纯甲醛是一种蒸汽l溶于水后成为溶于水后成为37%40%37%40%的甲醛溶液的甲醛溶液（又称福尔马林溶液）（又称福尔马林溶液）l固定液为固定液为10%10%的中性福尔马林（即的中性福尔马林（即约含约含4%W/V4%W/V的甲醛溶液）的甲醛溶液）l甲醛在水溶液中形成甲醛在水溶液中形成HOCH2OHHOCH2OH（亚（亚甲基氢氧化合物）复合物甲基氢氧化合物）复合物甲醛（分子式甲醛（分子式:HCHO:HCHO）固定）固定:l甲醛的亚甲基氢氧化合物能与蛋白质末端多甲醛的亚甲基氢氧化合物能与蛋白质末端多种不同的功能基团结合，使蛋白多肽分子间种不同的功能基团结合，使蛋白多肽分子间形成桥键，使蛋白质不再发生改变，保存原形成桥键，使蛋白质不再发生改变，保存原位。位。-甲醛（分子式甲醛（分子式:HCHO:HCHO）固定的优点）固定的优点:l组织形态结构保存好组织形态结构保存好l固定均匀，穿透性强固定均匀，穿透性强l组织收缩少组织收缩少l增加组织硬度，便于切片增加组织硬度，便于切片l价格便宜价格便宜甲醛（分子式甲醛（分子式:HCHO:HCHO）固定的缺点）固定的缺点:l封闭抗原决定簇：封闭抗原决定簇：醛基与抗原蛋白氨基交联形成羧醛基与抗原蛋白氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的空间构象发生改变，甲基，使抗原决定簇的空间构象发生改变，可能部分和完全遮盖抗原决定簇，使之不可能部分和完全遮盖抗原决定簇，使之不能完全暴露，导致免疫组织化学染色产生能完全暴露，导致免疫组织化学染色产生假阴性。假阴性。处理措施：处理措施：固定后能够充分水洗，可减少分子间交联。固定后能够充分水洗，可减少分子间交联。抗原修复还可使抗原再现。抗原修复还可使抗原再现。缩短固定时间缩短固定时间(8(82424小时小时)，降低固定温度，降低固定温度(4)(4)可减少交联。可减少交联。甲醛（分子式甲醛（分子式:HCHO:HCHO）固定的缺点）固定的缺点:l甲醛内杂质含量多，影响酶染色甲醛内杂质含量多，影响酶染色l含甲酸，固定液酸化，影响染色含甲酸，固定液酸化，影响染色l产生甲醛颗粒，影响观察，尤以多血的肝，产生甲醛颗粒，影响观察，尤以多血的肝，脾组织常见脾组织常见l易挥发，污染环境易挥发，污染环境10%10%中性缓冲福尔马林固定液：中性缓冲福尔马林固定液：100ml40%100ml40%福尔马林福尔马林 900ml 900ml蒸馏水蒸馏水 NaH2PO4 4g NaH2PO4 4g Na2HPO4 6.5g Na2HPO4 6.5g最常用的固定液，抗原保存好，合适免疫组化染色。最常用的固定液，抗原保存好，合适免疫组化染色。常用甲醛固定液常用甲醛固定液优点：优点：-保存组织中易溶于水的物质，如尿酸结晶和糖原保存组织中易溶于水的物质，如尿酸结晶和糖原-常与其他试剂配制成多种混合固定液：加快固定时兼有常与其他试剂配制成多种混合固定液：加快固定时兼有脱水的作用脱水的作用缺点：缺点：-可溶解脂类物质，要求保留脂类物质时不能使用酒精可溶解脂类物质，要求保留脂类物质时不能使用酒精-对组织收缩较大，单纯酒精固定组织收缩明显，变硬变对组织收缩较大，单纯酒精固定组织收缩明显，变硬变脆，制片困难脆，制片困难-渗透力差，组织表面已固定，组织中间固定不佳渗透力差，组织表面已固定，组织中间固定不佳-沉淀核蛋白，球蛋白，白蛋白，影响核染色沉淀核蛋白，球蛋白，白蛋白，影响核染色-价格贵价格贵乙醇（乙醇（alcoholalcohol）固定）固定醋酸（醋酸（cetic acidcetic acid）固定）固定-对染色质固定较好。对染色质固定较好。-对脂肪、糖元不能固定。对脂肪、糖元不能固定。-能使组织膨胀，可抵偿因乙醇、升汞、甲醛等固定液引起的能使组织膨胀，可抵偿因乙醇、升汞、甲醛等固定液引起的组织收缩和硬化，故常配成组织收缩和硬化，故常配成5%5%混合固定液。混合固定液。-穿透速度最快，固定时间短。穿透速度最快，固定时间短。-5-5醋酸的醋酸的p p值在值在2828，此时可停止细菌和酶的活动，可防，此时可停止细菌和酶的活动，可防止组织自溶变性。止组织自溶变性。-能沉淀蛋白质，它不能固定脂肪、类脂和糖类。能沉淀蛋白质，它不能固定脂肪、类脂和糖类。-穿透力较弱，单独使用可使组织收缩。多与醋酸和铬盐穿透力较弱，单独使用可使组织收缩。多与醋酸和铬盐（重铬酸钾）配成混合固定液。（重铬酸钾）配成混合固定液。-固定后细胞的结构，特别是核的细微结构显示清晰。固定后细胞的结构，特别是核的细微结构显示清晰。-易产生汞盐的沉着，损害切片刀，因此染色前必须脱汞。易产生汞盐的沉着，损害切片刀，因此染色前必须脱汞。氯化汞（氯化汞（ercury bichlorideercury bichloride）-能沉淀蛋白质，但对脂肪和类脂无固定作用。能沉淀蛋白质，但对脂肪和类脂无固定作用。-穿透力很慢，细胞收缩显著，但不会使组织硬化。穿透力很慢，细胞收缩显著，但不会使组织硬化。-有软化皮肤的作用，配制的有软化皮肤的作用，配制的BouinBouin氏液对头皮及全身皮肤制氏液对头皮及全身皮肤制片效果甚好。片效果甚好。-固定时间太久会影响固定时间太久会影响HEHE染色。染色。-糖元较好的固定剂。糖元较好的固定剂。苦味酸（苦味酸（icric acidicric acid）-可以作固定剂，又可作脱水剂，穿透速度快，可使蛋白可以作固定剂，又可作脱水剂，穿透速度快，可使蛋白质沉淀凝固，质沉淀凝固，2 2毫米以下的组织固定半小时至毫米以下的组织固定半小时至1 1小时即可。小时即可。-可引起组织较强的收缩使之变硬，对核固定不佳。可引起组织较强的收缩使之变硬，对核固定不佳。-对某些酶的固定很好，如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等。对某些酶的固定很好，如碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等。-一般多与氯化汞、甲醛混合液使用，先用低浓度丙酮再一般多与氯化汞、甲醛混合液使用，先用低浓度丙酮再经高浓度丙酮固定以减少组织收缩和过度硬化。经高浓度丙酮固定以减少组织收缩和过度硬化。丙酮丙酮-强氧化剂，不能与酒精等还原剂混合，常配成强氧化剂，不能与酒精等还原剂混合，常配成0.5%0.5%水溶水溶液固定组织。液固定组织。-单独固定组织不能沉淀蛋白质，但加入冰醋酸转变为铬单独固定组织不能沉淀蛋白质，但加入冰醋酸转变为铬酸，（即酸化重铬酸钾），可使蛋白质凝固沉淀。酸，（即酸化重铬酸钾），可使蛋白质凝固沉淀。-与甲醛混合是固定线粒体、高尔基复合体和嗜铬细胞等与甲醛混合是固定线粒体、高尔基复合体和嗜铬细胞等优良固定剂，若配成优良固定剂，若配成EenkerEenker氏液，能很好的固定细胞质、氏液，能很好的固定细胞质、胞核及染色体。胞核及染色体。-穿透速度快，组织收缩小，固定的组织必须流水充分洗穿透速度快，组织收缩小，固定的组织必须流水充分洗涤（涤（6 612h12h），否则影响染色。），否则影响染色。对酸性染料染色良好，对碱性料染较差，若加入升汞及醋对酸性染料染色良好，对碱性料染较差，若加入升汞及醋酸等，则对细胞核染色极佳。酸等，则对细胞核染色极佳。重铬酸钾重铬酸钾乙醇乙醇-甲醛液（甲醛液（AFAF液）液）配制：配制：95%95%或无水乙醇或无水乙醇90ml90ml加入加入40%40%瓶装甲醛瓶装甲醛10ml10ml，常用固定液。，常用固定液。兼有脱水作用，用于固定肥大细胞和糖元较兼有脱水作用，用于固定肥大细胞和糖元较好，米粒大小固定好，米粒大小固定4 46h6h，大块组织，大块组织121224h24h，固，固定后不经水洗，直接放入定后不经水洗，直接放入95%95%酒精开始脱水。酒精开始脱水。enkerenker氏液氏液配制配制:重铬酸钾重铬酸钾2.5g+2.5g+升汞升汞5g+5g+蒸馏水蒸馏水100ml100ml，加温溶解，加温溶解，冷却过滤，贮于棕色瓶内，成为贮存液。冷却过滤，贮于棕色瓶内，成为贮存液。用时取此液用时取此液95ml95ml再加入冰醋酸再加入冰醋酸5ml5ml即成。即成。enkerenker氏液固定后，细胞核和细胞浆染色较为氏液固定后，细胞核和细胞浆染色较为清晰，特别显示骨骼肌的横纹清晰，特别显示骨骼肌的横纹 固定时间固定时间12-24h12-24h，然后冲洗，然后冲洗24h24h，切片脱腊后，切片脱腊后需脱汞（浸入需脱汞（浸入5%5%碘酒精碘酒精1010），脱碘（），脱碘（5%5%硫代硫酸钠）硫代硫酸钠）流水洗。流水洗。BouinBouin氏液氏液配制：苦味酸饱和液配制：苦味酸饱和液75ml+75ml+甲醛甲醛25ml+25ml+冰醋酸冰醋酸5ml5ml 此液渗透快，组织收缩小，固定均匀，为常用固此液渗透快，组织收缩小，固定均匀，为常用固定液。它对肝、皮肤、胰脏特染效果好，但固定定液。它对肝、皮肤、胰脏特染效果好，但固定过久对碱性染料的着色有影响。过久对碱性染料的着色有影响。GarnayGarnay氏液氏液配制：纯酒精配制：纯酒精60ml+60ml+氯仿氯仿30ml+30ml+醋酸醋酸10ml10ml细胞极好的固定液，对淋巴组织及腺体固定很好，细胞极好的固定液，对淋巴组织及腺体固定很好，米粒大的组织固定米粒大的组织固定1 12h2h，也适宜，也适宜RNARNA、DNADNA及糖元的及糖元的固定。固定。HellyHelly氏液氏液配制：重铬酸钾配制：重铬酸钾25g+25g+升汞升汞50g+50g+蒸馏水蒸馏水1000ml+1000ml+甲醛甲醛50ml50ml白细胞颗粒良好的固定剂，可用于造血器官，如骨白细胞颗粒良好的固定剂，可用于造血器官，如骨髓，脾脏的固定。髓，脾脏的固定。B5B5固定液固定液配制：储备液：氯化汞配制：储备液：氯化汞12g+12g+醋酸钠醋酸钠2.5g+2.5g+蒸馏水蒸馏水200ml200ml。使用前加。使用前加2ml2ml甲醛到甲醛到20ml20ml储备液中储备液中常用于骨髓，淋巴结，脾和其他造血组织的固定。常用于骨髓，淋巴结，脾和其他造血组织的固定。组织固定注意事项组织固定注意事项l组织离体后尽早放入固定液中组织离体后尽早放入固定液中l固定液体的体积应大于标本的固定液体的体积应大于标本的4545倍，甚至倍，甚至2020倍倍l固定的容器口要方便组织固定后取出固定的容器口要方便组织固定后取出l组织固定时间不宜太长，一般不超过组织固定时间不宜太长，一般不超过7272小时，固定小时，固定不足和固定时间太久都可能影响染色，免疫组化等不足和固定时间太久都可能影响染色，免疫组化等组织取材组织取材l尸检组织取材尸检组织取材l外科切除标本取材外科切除标本取材l活检小组织取材活检小组织取材组织取材组织取材要求：要求：l取材组织厚度小于取材组织厚度小于3mm3mm，长度和宽度大约，长度和宽度大约2cm2cm为宜。为宜。l取材刀锋利，避免组织损伤。取材刀锋利，避免组织损伤。l剔除标本中的线头，吻合钉。剔除标本中的线头，吻合钉。l有钙化和骨化的组织要脱钙。有钙化和骨化的组织要脱钙。l保持取材台的干净，流水冲洗。保持取材台的干净，流水冲洗。l避免小标本丢失，可用伊红染料标记。避免小标本丢失，可用伊红染料标记。l肿瘤标本取材应注意相互关系。肿瘤标本取材应注意相互关系。l核对标本，以免张冠李戴核对标本，以免张冠李戴组织处理组织处理1 1、脱水：、脱水：将将组组织织内内的的水水分分用用某某些些化化学学试试剂剂置置换换出出来来的的过程称脱水。过程称脱水。脱脱水水是是透透明明前前必必要要的的过过程程。所所用用试试剂剂为为能能与与透透明剂相混溶的试剂。明剂相混溶的试剂。常用脱水剂有常用脱水剂有乙醇乙醇，正丁醇，丙酮。，正丁醇，丙酮。脱脱水水过过程程从从低低浓浓度度到到高高浓浓度度，时时间间一一般般为为20min120min20min120min。高浓度乙醇中不能放置太久时间。高浓度乙醇中不能放置太久时间THANK YOUSUCCESS2024/3/17 周日32可编辑-尸检及活检：有条件时，将组织分别进行脱水，因为尸检及活检：有条件时，将组织分别进行脱水，因为不同组织脱水时间有差异。不同组织脱水时间有差异。-动物组织：动物组织：应区分动物大、小，如狗组织接近新生儿应区分动物大、小，如狗组织接近新生儿组织，大白鼠和小白鼠也有差异，前者需时稍长，后者组织，大白鼠和小白鼠也有差异，前者需时稍长，后者则较短。则较短。-脱水时间与脱水剂的关系：脱水剂的新旧（纯度）影脱水时间与脱水剂的关系：脱水剂的新旧（纯度）影响脱水时间，必须灵活掌握。响脱水时间，必须灵活掌握。-穿刺组织：如肾穿刺、活检小组织，常规用擦镜纸包穿刺组织：如肾穿刺、活检小组织，常规用擦镜纸包裹，涂伊红，以防丢失。裹，涂伊红，以防丢失。1 1、脱水时的注意事项：、脱水时的注意事项：-非石蜡溶剂的脱水剂：如乙醇和丙酮等，其组非石蜡溶剂的脱水剂：如乙醇和丙酮等，其组织在脱水后必须再经二甲苯透明才能浸蜡。织在脱水后必须再经二甲苯透明才能浸蜡。-脱水兼石蜡溶剂的脱水剂：如正丁醇等组织在脱脱水兼石蜡溶剂的脱水剂：如正丁醇等组织在脱水后即可直接浸蜡，不经过中间溶剂如二甲苯之类水后即可直接浸蜡，不经过中间溶剂如二甲苯之类的试剂。的试剂。脱水剂的种类和效果脱水剂的种类和效果组织处理组织处理2 2、透明：、透明：用用化化学学试试剂剂，通通常常为为二二甲甲苯苯将将组组织织内内的的脱脱水水剂剂置置换换出出来的过程称透明。来的过程称透明。透透明明发发挥挥了了一一个个桥桥梁梁作作用用，透透明明剂剂可可以以与与包包埋埋剂剂和和脱脱水剂相溶。水剂相溶。常用透明剂有二甲苯，笨，三氯甲烷等。常用透明剂有二甲苯，笨，三氯甲烷等。一般置换一般置换2323次透明剂，每次时间次透明剂，每次时间1540min1540min。透透明明剂剂易易使使组组织织变变硬硬变变脆脆，所所以以不不能能让让组组织织在在透透明明剂剂内放置时间太长。内放置时间太长。组织处理组织处理3 3、浸蜡浸蜡与包埋：与包埋：经经过过前前期期处处理理的的标标本本，再再置置入入支支持持物物中中，使使支支持物渗透入组织，并将组织埋入，包裹的过程。持物渗透入组织，并将组织埋入，包裹的过程。常常用用支支持持物物有有石石蜡蜡，树树脂脂，碳碳蜡蜡，明明胶胶，火火棉棉胶。胶。一一般般采采用用熔熔点点为为5658,5658,经经三三道道溶溶化化的的石石蜡蜡浸浸渍渍后后,透透明明剂剂被被全全部部置置换换出出来来。浸浸蜡蜡温温度度高高于于蜡蜡的的熔点熔点2 3 2 3。石蜡：石蜡：石蜡有高熔点和低熔点之分，一般普遍应用熔点为石蜡有高熔点和低熔点之分，一般普遍应用熔点为5656以上的石蜡。低熔点在以上的石蜡。低熔点在5454以下，用于酶的显示和保以下，用于酶的显示和保存抗原活性。存抗原活性。石蜡分软蜡（石蜡分软蜡（52525454），硬蜡（），硬蜡（56565858），蜂蜡），蜂蜡6060。一般气温用硬蜡，气温低时用软蜡。一般气温用硬蜡，气温低时用软蜡。火棉胶：火棉胶：碳蜡碳蜡明胶明胶浸蜡剂的种类浸蜡剂的种类组织处理组织处理3 3、浸蜡与、浸蜡与包埋：包埋：将将蜡蜡液液注注入入包包埋埋的的模模具具中中，放放好好组组织织后后，移移至至冷台，使组织和蜡液凝固在一起的过程。冷台，使组织和蜡液凝固在一起的过程。包包埋埋应应注注意意组组织织的的埋埋面面，保保持持组组织织在在一一个个平平面面上上，间间距距合合适适，避避免免气气泡泡，包包埋埋要要迅迅速速，防防止止组组织织与蜡分离。与蜡分离。组织处理组织处理l手工处理手工处理l全封闭柜式自动脱水机（室温）全封闭柜式自动脱水机（室温）l全封闭柜式自动脱水机（加温）全封闭柜式自动脱水机（加温）l全封闭柜式自动脱水机（真空负压）全封闭柜式自动脱水机（真空负压）全封闭柜式自动脱水机（樱花全封闭柜式自动脱水机（樱花tissue-tek VIP6tissue-tek VIP6）试剂试剂时间时间温度温度压力压力10%中性福尔马林2h40on80%酒精45min40On95%酒精1h40On95%酒精1h40On100%酒精1h40On100%酒精1h40On100%酒精1h40On二甲苯45min40On二甲苯45min40On石蜡45min62On石蜡45min62On石蜡45min62On石蜡45min62on常规石蜡切片常规石蜡切片l多采用轮式切片机，一次性刀片多采用轮式切片机，一次性刀片l切片厚度为切片厚度为4um6um4um6uml展片水温展片水温4248 4248 l注意清洁，避免污染注意清洁，避免污染l易脱片组织可用易脱片组织可用防脱片的涂胶载破片防脱片的涂胶载破片l防止切片裂痕，厚薄不均的现象防止切片裂痕，厚薄不均的现象常规石蜡切片常规石蜡切片防脱片的涂胶载破片防脱片的涂胶载破片l多多聚聚赖赖氨氨酸酸：0.1%0.1%水水溶溶液液，使使用用时时再再1:101:10稀稀释释，涂涂片片l3-3-氨丙基三已氧基硅烷（氨丙基三已氧基硅烷（APESAPES）l带电荷玻片或阳玻片带电荷玻片或阳玻片 冰冻切片冰冻切片l常用于术中快速病理诊断常用于术中快速病理诊断l组组织织不不经经脱脱水水，透透明明等等步步骤骤，对对蛋蛋白白，脂脂肪肪，各各种种酶酶保保存存好好，合合适适做做组组织织化化学学，免免疫疫组组化化等等染染色色，尤尤其对不合适石蜡组织的抗体其对不合适石蜡组织的抗体l组组织织会会膨膨胀胀，细细胞胞变变大大，出出现现与与常常规规切切片片的的一一些些差差异异常规常规HEHE染色染色l染色的意义和目的：染色的意义和目的：用用染染液液对对组组织织切切片片进进行行处处理理，使使组组织织中中的的不不同同成成分分被被染染上上相相应应的的颜颜色色，产产生生不不同同的的折折射射率率，以以利于光镜观察和分析。利于光镜观察和分析。常规常规HEHE染色染色lHEHE是是苏苏木木素素（haematoxylinhaematoxylin）和和伊伊红红（eosineosin）的的缩缩写写l苏苏木木素素是是从从苏苏木木素素树树的的树树心心中中提提炼炼的的天天然然碱碱性性染染料料，苏苏木木素素经经过过氧氧化化后后变变成成苏苏木木红红，在在媒媒染染剂剂作作用用下下形形成蓝色色精，对细胞核具有良好的染色能力成蓝色色精，对细胞核具有良好的染色能力l伊伊红红属属酸酸性性染染料料，化化学学名名称称四四溴溴荧荧光光素素二二钠钠，分分为为水溶性和醇溶性两种，常规水溶性和醇溶性两种，常规HEHE使用的是水溶性伊红使用的是水溶性伊红常规常规HEHE染色染色的原理染色染色的原理l细细胞胞核核染染色色的的原原理理：细细胞胞核核主主要要是是DNADNA，带带负负电电荷荷，呈呈酸酸性性，容容易易与与带带正正电电荷荷的的碱碱性性染染料料结结合合，苏苏木木素素氧氧化化呈呈苏苏木木红红，苏苏木木红红与与媒媒染染剂剂中中金金属属阳阳离离子子结结合合形形成成蓝蓝色色色色精精，以以离离子子键键或或氢键与核结合。氢键与核结合。l细细胞胞质质的的染染色色的的原原理理：细细胞胞质质主主要要是是蛋蛋白白质质，为为两两性性化化合合物物，等等电电点点为为pH4.75.0pH4.75.0。当当染染液液的的pHpH值值低低于于蛋蛋白白质质的的等等电电点点时时，蛋蛋白白质质带带正正电电荷荷，伊伊红红是是一一种种酸酸性性染染料料，水水中中离离解解成成带带负负电电荷的阴离子，与蛋白的氨基正电荷结合而使细胞质着色。荷的阴离子，与蛋白的氨基正电荷结合而使细胞质着色。常规常规HEHE染色染色步骤染色染色步骤1 1、脱蜡、脱蜡l二甲苯二甲苯脱蜡脱蜡1010分钟左右分钟左右l二甲苯二甲苯脱蜡脱蜡5 5分钟左右分钟左右l无水酒精无水酒精(乙醇乙醇)洗去二甲苯洗去二甲苯1 1分钟分钟l无水酒精无水酒精(乙醇乙醇)洗去二甲苯洗去二甲苯1 1分钟分钟l95%95%酒精酒精1 1分钟分钟l85%85%酒精酒精1 1分钟分钟l自来水洗片刻自来水洗片刻除去汞盐沉淀物除去汞盐沉淀物:对于用升汞固定或含有升汞混合固定对于用升汞固定或含有升汞混合固定液的切片，切片脱腊后需脱汞（浸入液的切片，切片脱腊后需脱汞（浸入5%5%碘酒精碘酒精1010），脱），脱碘（碘（5%5%硫代硫酸钠）硫代硫酸钠）流水洗流水洗染色。染色。除铬沉着物除铬沉着物:有些组织用含铬的有些组织用含铬的enkerenker氏液等固定，致有氏液等固定，致有铬沉淀物。可应用盐酸乙醇溶液，或用铬沉淀物。可应用盐酸乙醇溶液，或用5%5%碘酒和碘酒和5%5%硫代硫硫代硫酸钠水溶液处理。酸钠水溶液处理。常规常规HEHE染色染色步骤染色染色步骤脱甲醛色素脱甲醛色素:甲醛固定组织时间较长及温度较高情况下，甲甲醛固定组织时间较长及温度较高情况下，甲醛易氧化自行分解产生甲酸，导致组织成酸性，此时可能有醛易氧化自行分解产生甲酸，导致组织成酸性，此时可能有甲醛色素产生。此种色素无光泽，不溶于水，乙醇，二甲苯甲醛色素产生。此种色素无光泽，不溶于水，乙醇，二甲苯等。对于这种色素可用下列方法除去。等。对于这种色素可用下列方法除去。1 1 浓氨水浓氨水1 ml1 ml，75%75%乙醇乙醇200 ml200 ml。切片脱蜡后置溶液中。切片脱蜡后置溶液中30 30 或较久或较久流水洗流水洗染色。染色。2 1%2 1%氢氧化钾氢氧化钾1 ml1 ml，80%80%乙醇乙醇100 ml100 ml。切片脱蜡后置溶。切片脱蜡后置溶液中液中10 10 流水洗流水洗5 5 80%80%乙醇乙醇5 5 蒸馏水洗蒸馏水洗染染色。色。常规常规HEHE染色染色步骤染色染色步骤常规常规HEHE染色染色步骤染色染色步骤2 2、染色、染色l苏木素染色苏木素染色1 15 5分钟左右分钟左右l自来水洗片刻自来水洗片刻l1%1%或或0.5%0.5%或或0.25%0.25%盐酸水分化盐酸水分化3 35 5秒钟秒钟l自来水洗，温水蓝化片刻自来水洗，温水蓝化片刻l伊红酒精染液浸染伊红酒精染液浸染2020秒秒2 2分钟分钟l常规常规HEHE染色染色步骤染色染色步骤3、脱水、透明、封固、脱水、透明、封固l85%85%的酒精脱水的酒精脱水2020秒秒l 95%95%的酒精的酒精1 1分钟分钟l无水酒精无水酒精染染1 12 2分钟分钟l无水酒精无水酒精染染2 2分钟分钟l二甲苯二甲苯浸浸2 2分钟分钟l二甲苯二甲苯浸浸2 2分钟分钟l中性树胶或加拿大树胶封片中性树胶或加拿大树胶封片常规常规HEHE染色结果染色结果l细胞核呈蓝色细胞核呈蓝色l钙盐和各种微生物呈蓝色或紫蓝色钙盐和各种微生物呈蓝色或紫蓝色l细胞质，肌纤维，纤维结缔组织，红细胞和伊红色细胞质，肌纤维，纤维结缔组织，红细胞和伊红色颗粒呈不同程度的红色颗粒呈不同程度的红色常规常规HEHE染色质量标准染色质量标准l切片完整，厚度切片完整，厚度46um46um，厚薄均匀，无皱褶，无刀痕，厚薄均匀，无皱褶，无刀痕l细胞核，质染色分明，红蓝适度，透明洁净，封固美观细胞核，质染色分明，红蓝适度，透明洁净，封固美观细胞病理学细胞病理学 细胞病理学（细胞病理学（cytopathologycytopathology）是通过观察细胞类别，）是通过观察细胞类别，形态和性质，协助临床筛查，诊断和研究疾病的科学。是病形态和性质，协助临床筛查，诊断和研究疾病的科学。是病理学得分支学科。理学得分支学科。细胞学检查的材料来源细胞学检查的材料来源v体腔抽出液体的脱落细胞体腔抽出液体的脱落细胞v粘膜表面的脱落细胞粘膜表面的脱落细胞v针吸细胞针吸细胞v内镜刷洗细胞内镜刷洗细胞v细胞印片细胞印片v培养细胞爬片培养细胞爬片细胞学检查的优缺点l优点：优点：方法简单安全，受检者痛苦小方法简单安全，受检者痛苦小 设备简单，标本来源容易，可以反复获取。设备简单，标本来源容易，可以反复获取。制片技术简单，可以快速诊断制片技术简单，可以快速诊断l缺点：缺点：存在假阳性好假阴性存在假阳性好假阴性 无法分辨细胞结构无法分辨细胞结构 无法明确细胞来源无法明确细胞来源细胞学检查基本技术细胞学检查基本技术l标本采集：刮片，抽吸，冲洗，针吸。标本采集：刮片，抽吸，冲洗，针吸。l涂片技术：动作轻巧，力度均匀，厚薄适宜涂片技术：动作轻巧，力度均匀，厚薄适宜l涂片方法：退片，涂抹，印片，喷射，膜式沉淀，涂片方法：退片，涂抹，印片，喷射，膜式沉淀，离心沉淀式薄层细胞学，爬片离心沉淀式薄层细胞学，爬片l固定：固定：95%95%酒精固定，酒精固定，1530min1530minl染色：染色：HEHE染色，巴氏染色，瑞士染色染色，巴氏染色，瑞士染色l细胞蜡块细胞蜡块标本采集注意事项标本采集注意事项l痰液应收集晨起深部咳出的痰痰液应收集晨起深部咳出的痰l尿液取中段尿尿液取中段尿l尿液，胸腹水应当尽快制片，防止细胞自溶尿液，胸腹水应当尽快制片，防止细胞自溶哈瑞氏（哈瑞氏（harrisharris）苏木素染液）苏木素染液最常应用染色时间为最常应用染色时间为5 51010配制配制 蒸馏水蒸馏水 1000ml 1000ml 苏木素苏木素 3 35g5g 碘酸钠碘酸钠 1g 1g 钾明矾钾明矾 50 5080g80g 水醋酸水醋酸 20ml 20ml其优点是：其优点是：配后即可应用染色力较强。配后即可应用染色力较强。其缺点是：其缺点是：极易产生金属膜沉淀。极易产生金属膜沉淀。HEHE染液的配制染液的配制埃利希（埃利希（EhrlichEhrlich），苏木素染液），苏木素染液 配制配制 无水乙醇无水乙醇 100ml 100ml 甘油甘油 100ml 100ml 苏木精苏木精 2g 2g 钾明矾钾明矾 2 23g3g 醋酸醋酸 5 510ml10ml置于阳光下自然氧化置于阳光下自然氧化3 3个月左右成熟。个月左右成熟。其优点是：其优点是：染色结果甚佳，贮存愈久染色愈强，而且不染色结果甚佳，贮存愈久染色愈强，而且不需分色。需分色。HEHE染液的配制染液的配制HEHE染液的配制染液的配制0.50.5%-1-1%水溶性伊红水溶性伊红乙醇乙醇液：伊红液：伊红y 0.5-1g+95%y 0.5-1g+95%乙醇乙醇25ml+25ml+蒸馏水蒸馏水75ml+75ml+醋酸醋酸 1 12 2滴。滴。伊红伊红 B B：0.5g+80%0.5g+80%乙醇乙醇100ml100ml溶解后用溶解后用组织病理学诊断的局限性组织病理学诊断的局限性l病理学诊断是疾病诊断的病理学诊断是疾病诊断的“金标准金标准”？l病理学诊断具有局限性：病理学诊断具有局限性：-活检不到位，组织不能代表病变活检不到位，组织不能代表病变 -组织挤压或电灼伤严重，影响诊断组织挤压或电灼伤严重，影响诊断 -组织固定不良，自溶不能诊断组织固定不良，自溶不能诊断 -非肿瘤性疾病，组织学无特征性改变非肿瘤性疾病，组织学无特征性改变 -疾病的复杂性，如疑难和少见病例的诊断疾病的复杂性，如疑难和少见病例的诊断l免疫组化，组织化学，分子病理可以辅助诊断免疫组化，组织化学，分子病理可以辅助诊断 THANK YOUSUCCESS2024/3/17 周日63可编辑