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质量标准研究工作

一 理化常数(标准中的性状项)
外观性状（结晶、粉末、结晶性粉末、液体……）颜色、气味、沸点、熔点、溶解度、比旋度、吸收系数、吸湿增重、结晶水、晶型、等。
溶解度：应用精制品做，每次取样量应根据其溶解性能而定（5mg-1g）。一般要做三种以上溶剂，包括易溶或溶解，微溶，不溶，不要选一类溶剂。溶剂用量要从小到大直至完全溶解或累积用量达到10000ml/g以上，仍不溶解为止。
熔点：与文献数据比较，测熔点升温速度为1-2℃/min，特殊情况（如有气泡）可小于1℃/min，但需说明理由，如果熔融时分解，则应说明，升温速度为2-3℃/min。熔点大于250℃且分解，质量标准中可不订熔点一项。
比旋度：与文献对比。要严格控制测定时的温度。

二 鉴别(2~4种方法)
原料药(与合成有关)：1、化学 2、紫外 3、红外 4、Rf
4、HPLC保质时间（HPLC测含量）
5、HPLC手性保留时间（如有手性两种HPLC鉴别法可只用一种，通常只保留手性鉴别）

制剂： 1、化学 2、紫外 3、HPLC保留时间（HPLC测含量）
4、HPLC手性保留时间（如有手性两种HPLC鉴别法可只用一种，通常只保留手性鉴别）
化学法：根据官能团、溶解性而定，现象要明显，同时要有空白对照（阴性）。
紫外法：有明显吸收的才能用此法，样品浓度以最大吸收波长的A值为0.3～0.7为准。
红外法：这是最准确的鉴别方法，仪器要按药典校正，要求样品与对照品的特征波数（-cm-1）,相差不超过5cm-1。
HPLC：主要用于制剂，样品与对照品保留时间一致。
TLC：要考察样品浓度、点样量、Rf与对照品对照。
三、纯度检查
（一）一般杂质检查
酸度（制剂为PH值）、干燥失重、残渣、重金属、氯化物、氟化物、硫酸盐、特殊物质、水份、颜色与澄清度。
（二）殊杂质检查
有关物质：即有机杂质。
主要起始原料，各步中间体、副产物，破坏产物（6个条件：光、热、酸、碱、氧化、水溶液）均应考虑，均要与主峰很好的分离。
一般要用HPLC（反、正、离子交换）法，无紫外吸收时用荧光或TLC法。
（1）色谱条件的确定：
a、色谱柱的选择 b、检测波长的确定（根据样品在流动相中的最大吸收波长确定检测波长，尽量不选220nm以前的波长，因为近紫外区，溶剂、干扰大，基线不平）。
c、流动相的比例 d、流动相的pH值 e、记录色谱图（色谱图时间为主成分峰保留时间的3.0倍）
综合以上实验结果，初步确定如下色谱条件：
系统适用性试验：
（2）方法专属性：(设计粗品、中间体、高温、强光、酸、碱及氧化破坏试验，并进行了峰纯度检查试验，以考察该系统的可靠性、灵敏性、寻找已知杂质和未知杂质的归属及在破坏试验条件下的稳定性。
A、溶剂峰的确定 b、未破坏样品试验 c、粗品实验 d、中间体的试验 e、强光试验 f、热加速分解试验 g、酸破坏试验（样品适量，加0.1mol/L盐酸溶液，室温放置一段时间，用0.1mol/L氢氧化钠中和至中性，再加流动相稀释成一定浓度的溶液，取上述溶液20?l，进样，记录色谱图至主成分峰保留时间的3.0倍）
h、碱破坏试验（样品适量，加0.1mol/L氢氧化钠溶液，室温放置一段时间，用0.1mol/L盐酸中和至中性，再加流动相稀释成一定浓度的溶液，进样） i、氧化破坏试验（样品适量，加0.1%次氯酸钠(或0.1%H2O2 )溶液，室温放置一段时间，用稀盐酸中和至中性，再加流动相稀释成一定浓度的溶液，进样）
由以上实验结果可见，建立的HPLC方法专属性好、灵敏度高，本品与原有杂质及降解产物能够有效分离。
（3）灵敏度：定量限为当信噪比（S/N）≥10时，其检测限为当信噪比（S/N）≥3时。
（4）稳定性试验
（5）准确度、重复性、重现性、线性范围及耐用性
（6）有关物质的测定（一般采用主成分自身对照法测定并控制其含量）
结论：根据上述测定结果，HPLC法可有效分离中间体杂质及副产物和分解产物，并能很好的确定有关物质的量，所以将此法订入质量标准草案中。本品的稳定性试验采用此条件检查分解产物。

(三)异构体：手性、顺反、差向。
附：匹伐他汀钙手性异构体检测 由匹伐他汀钙合成路线可知，中间体羰基还原物为定向还原的产物，为R型，其对映体为S型，羰基还原产物中S型含量直接影响产品匹伐他汀钙中的非对映异构体的含量，为了有效控制产品的手性纯度，我们用高效液相色谱法采用手性柱控制中间体羰基还原物中S型化合物含量，以保证匹伐他汀钙中异构体的含量符合要求。
（1）色谱条件的确定 （2）方法专属性 （3）线性与范围 （4）精密度测试 （5）灵敏度：定量限和检测限 （6）样品测试：
取羰基还原物适量，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加20%乙腈水溶液溶解，并稀释至刻度，配制成每1ml约含100μg的溶液作为供试品溶液。取供试品溶液20ul，注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的1.5倍。用面积归一法计算羰基还原物中S型的含量。结果见表21。

总的来说HPLC方法的选择、验证通过以下的步骤
a：根据文献方法提出初步HPLC条件，包括柱子、检测器、流动相、检测波长、流速、柱温等。
b：用粗品进行试验：根据样品在流动相中的最大吸收波长确定检测波长，尽量不选220nm以前的波长、（近紫外区，溶剂、干扰大，基线不平）。
根据试验结果一步一步的调整流动相（从峰形，理论板数，托尾因子，分离度等判断）。
主要调整：比例、PH值、柱温、流速、改性剂（胺、有机酸、表面活性剂）。
c：用起始原料及中间体进行试验：主要是与主峰能有效分离，要单独进样和混合进样。如果分离不好，则需调整条件。
d：破坏性产物：也要能与主峰分离好，要注明主要分解产物的保留时间。
e：有关物质的归属：从粗品、中间体、破坏性试验结果进行判断（从保留时间看）。
f：样品、精制品测试。
g：灵敏度。
h：溶液稳定性（0、2、4、8、12h）
i：最终样品浓度：一般为含量测定浓度的5-10倍，要做几个浓度，保证所有杂质均能检出。

（四）有机溶剂残留量（ICH）： 一类：必检，要列入标准。
二类：一般要检，尽量列入标准。
三类：要检，但不一定列入标准。
一般用GC，尽量用顶空法。

附：匹伐他汀钙有机溶剂残留量检查
本品的合成过程中需用四氢呋喃、二氯甲烷、4-甲基-2-戊酮、乙醇作溶剂，故进行以上有机溶剂的残留量检测。检测方法为气相色谱法。参照《中国药典》2000版补充版附录ⅧP 有机溶剂残留量测定法。由于样品在水中极微溶，我们用N-甲基吡咯烷酮为溶剂制备样品，用第三法溶液直接进样法测定样品的有机溶剂残留。
色谱条件：
色谱柱：SE -54毛细管柱（30m×0.53mm×5.0?m），进样口温度200℃，检测器（FID）温度250℃，柱温：程序升温初始50℃，保持3min，以10℃/min升温至120℃，再以20℃/min升温至220℃，保持5min；分流比60：1；载气：N2，流速10 ml /min;进样1?l。
1、 对照品贮备液及母液的制备
精密称取二氯甲烷、乙醇、四氢呋喃、4-甲基-2-戊酮适量，分别加N-甲基吡咯烷酮溶解并稀释成6.085 mg/ml、10.294mg/ml、7.214mg/ml、10.016mg/ml 的对照品贮备液，精密量取上述贮备液适量，加N-甲基吡咯烷酮溶解并稀释成每1ml约含二氯甲烷0.6085 mg、乙醇1.0294mg、四氢呋喃0.7214mg、4-甲基-2-戊酮1.0016mg 的溶液作为母液。
2、 各组分出峰时间的确定
分别量取二氯甲烷、乙醇、四氢呋喃、4-甲基-2-戊酮、N-甲基吡咯烷酮各适量，在上述色谱条件下进样。
3、线性关系考察
溶液的配置：精密量取上述母液各5ml、1ml、0.5ml、0.1ml分别置10ml容量瓶中加N-甲基吡咯烷酮定容，摇匀，备用。分别取上述各溶液进样1?l，测定峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，结果见图10-66~10-70和表25。

表25有机溶剂线性范围和回归方程
组分 浓度范围（μg/ml） 回归方程 r
乙醇 10.294～1029.4 Y=328.99X+1579.5 0.9998
二氯甲烷 6.085～608.5 Y=107.81X+24.047 0.9999
四氢呋喃 7.214～721.4 Y=428.45X－153.72 0.9999
4-甲基-2-戊酮 10.016～1001.6 Y=505.21X+2605.8 0.9998

4、 样精密度实验
对照品溶液的配制：精密量取母液1ml置10ml容量瓶中加N-甲基吡咯烷酮定容，摇匀，备用. 取对照品溶液1?l进样.连续进样5次,计算各对照品溶液中乙醇、二氯甲烷、四氢呋喃、4-甲基-2-戊酮的峰面积及RSD见表26.
表26 有机溶剂进样精密度
组分 峰 面 积 RSD﹪
乙醇 29662.89
30314.221 33374.10 30774.46 29658.65 4.47
二氯甲烷 5564.20 5502.30 5343.70 5451.4 5340.95 1.61
四氢呋喃 23301.45 23337.50 22446.90 23101.35 22323.30 1.88
4-甲基-2-戊酮 39350.90 40769.10 40125.3 40567.05 39801.25 1.28

结论：试验结果可以看出四种有机溶剂进样精密度RSD﹪均小于10%，进样精密度符合中国药典要求。
5、定量限
取各贮备液适量,分别加N-甲基吡咯烷酮溶解并逐步稀释,.直至样品的峰高约为基线噪声的10倍，结果各有机残留溶剂乙醇、二氯甲烷、四氢呋喃、4-甲基-2-戊酮的定量限分别为0.258ng、0.240 ng、0.311、0.184μg/ml。见图10-75~10-78
6、样品的测定
取上述取对照品溶液进样1?l；再分别精密称取匹伐他汀钙样品1.0g,置于10 ml容量瓶中, 加N-甲基吡咯烷酮超声溶解,定容.精密量取1 ?l,进样,计算各样品中有机溶剂残留量.
结论：匹伐他汀钙三批样品残留溶剂量中二氯甲烷、四氢呋喃、4-甲基-2-戊酮均未检出。乙醇虽有检出，但不是重结晶溶剂，且残留量较小，所以乙醇、二氯甲烷、4-甲基-2-戊酮三种溶剂残留量暂不订入质量标准中。由于四氢呋喃为重结晶溶剂，所以订入质量标准中，参照《中国药典》2000版补充版附录ⅧP 有机溶剂残留量测定法中四氢呋喃的限度，结合上述样品的测定结果，暂将匹伐他汀钙中四氢呋喃的量订为不得大于72ppm。

三 含量测定
样 品：容量法，HPLC法。
对照品：首选容量法，特殊情况HPLC归一法，参考USP附录。
（2）制剂：与处方、工艺有关。
含量测定
a、对照品：一般为非水滴定（如为甲磺酸盐，则需将甲磺酸去掉后再滴定），强酸、强碱且在水或乙醇中溶解度大的也可直接进行酸碱滴定，用非水滴定时，既要用指示剂，又要用电位计，找到突跃点后，如果变色明显，则后面的试验可用指示剂法。要做精密度试验。
b：样品：原料药可采用容量法或HPLC法。外标法、制剂可采用容量法、HPLC法、UV法。
c：HPLC法方法学：线性（含量浓度在线性范围中间）、精密度、回收率