酶工程药物及中间体研发进展与应用前景.doc

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精选资料主要内容简介：本文主要从酶工程概述、酶工程制药的应用、酶工程技术制药的前景三方面讲述了酶工程技术在现代制药领域的应用。酶工程是现代生物技术的重要组成部分，作为一项高新型技术为各工业的发展起到重要的推动作用。它包括酶制剂的制备，酶的固化，酶的修饰与改造及酶反应器等方面的内容。固定化酶具有提高稳定性，可以反复使用或连续使用较长一段时间，易于与产物分离等显著特点；酶分子修饰技术已经成为酶工程中具有重要意义和广阔应用前景的研究、开发领域，通过酶分子修饰，可以提高酶活力，增加酶的稳定性，消除或降低酶的抗原性等；酶的非水相催化在手性药物的拆分，发光高分子聚合物、导电高分子聚合物的生产、生物柴油的研制等方面显示出良好的应用前景；通过酶的定向进化，可以显著提高酶活力、增加酶的稳定性、改变酶的底物特异性等。其应用主要集中于医药工业、食品工业及轻工业中，酶工程技术在现代制药领域的应用显得尤为突出，经常用于制备生物代谢产物，转化甾体，生产抗生素、有机酸、氨基酸、维生素和核酸类药物。新世纪酶工程的发展主题是：新酶的研究与开发、酶的优化生产和酶的高效应用。要采用固定化、分子修饰和非水相催化等技术实现酶的高效应用，将固化技术广泛应用于生物芯片、生物传感器、生物反应器、临床诊断、药物设计、亲和层析以及蛋白质结构和功能的研究，使酶技术在制药领域发挥更大的作用。酶工程药物及中间体研发进展与应用前景罗玉麟（甘肃联合大学化工学院09级应用化工技术3班 730000）摘要：本文介绍了药用酶通过体内酶活力变化、用酶测定体液中某些物质的物质的量的变化，从而进行疾病诊断、治疗以及酶在药物制造方面的研发进展与应用前景。及酶固定化、酶的化学修饰、酶的非水相催化、酶的定向进化和新型药用酶研究进展与应用前景。关键字：酶工程，酶固定化，酶化学修饰引言 : 酶工程是现代生物技术的重要组成部分，作为一项高新型技术为各工业的发展起到重要的推动作用。它包括酶制剂的制备，酶的固化，酶的修饰与改造及酶反应器等方面的内容。固定化酶具有提高稳定性，可以反复使用或连续使用较长一段时间，易于与产物分离等显著特点；酶分子修饰技术已经成为酶工程中具有重要意义和广阔应用前景的研究、开发领域，通过酶分子修饰，可以提高酶活力，增加酶的稳定性，消除或降低酶的抗原性等；酶的非水相催化在手性药物的拆分，发光高分子聚合物、导电高分子聚合物的生产、生物柴油的研制等方面显示出良好的应用前景；通过酶的定向进化，可以显著提高酶活力、增加酶的稳定性、改变酶的底物特异性等。酶工程是将酶、含酶细胞器或细胞（微生物、动物、植物）等在一定的反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应的原料转化成有用的物质并用于社会生活的一门科学。它包括酶制剂的制备，酶的固化，酶的修饰与改造及酶反应器等方面的内容。其应用主要集中于医药工业、食品工业及轻工业中。 1. 医药用酶的研发进展与应用前景 1.1. 酶在疾病诊断方面的研发进展与应用前景人类疾病的治疗效果好坏与否，在很大程度上决定于诊断的准确性。疾病诊断的方法很多，其中酶学诊断特别引人注目。由于酶具有专一性强、催化效率高、作用条件温和等显著的催化特点，酶学诊断已经发展成为可靠、简便又快捷的诊断方法，具有广阔的应用前景。酶学诊断方法包括两个方面，一是根据体内原有酶活力的变化来诊断某些疾病，二是利用酶来测定体内某些物质的含量，从而诊断某些疾病。根据体内酶活力的变化诊断疾病一般健康人体内所含有的某些酶的量是恒定在某一范围的。当人们患上某些疾病时，则由于组织、细胞受到损伤或者代谢异常而引起体内的某种或某些酶的活力发生相应的变化。故此，可以根据体内某些酶的活力变化情况，而诊断出某些疾病。用酶测定体液中某些物质的变化诊断疾病：见表1。人体在出现某些疾病时，由于代谢异常或者某些组织器官受到损伤，就会引起体内某些物质的量或者存在部位发生变化。通过测定体液中某些物质的变化，可以快速、准确地对疾病进行诊断。酶具有专一性强、催化效率高等特点，可以利用酶来测定体液中某些物质的含量变化，从而诊断某些疾病。见表2。 1.2. 酶在疾病治疗方面的研究与应用前景酶可以作为药物治疗多种疾病，用于治疗疾病的酶称为药用酶。药用酶具有疗效显著，副作用小的特点，在疾病的治疗方面的应用越来越广泛。见表3。 1.3. 酶在药物制造方面的研发进展与应用前景酶在药物制造方面的应用是利用酶的催化作用将前体物质转变为药物。这方面的应用日益增多。现已有不少药物包括一些贵重药物都是由酶法生产的。见表4。 2. 药用酶改性技术研究进展与应用前景酶的改性是指通过各种方法对酶的催化特性进行改进的技术过程。酶的改性技术主要包括：酶固定化、酶分子修饰、酶的非水相催化、酶的定向进化 2.1 酶固定化将酶固定在载体上，制备固定化酶的技术过程，称为酶固定化。固定在载体上，在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。固定化酶具有提高稳定性，可以反复使用或连续使用较长的一段时间，易于与产物分离等显著特点。已经有多种固定化酶用于大规模工业化生产。如：氨基酰化酶[1]：这是世界上第一种工业化生产的固定化酶，可以用于生产各种L-氨基酸药物。1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成DL-乙酰氨基酸，再进行拆分。生产成本仅为用游离酶生产成本的60%左右。青霉素酰化酶：这是在药物生产中广泛应用的一种固定化酶。可用多种方法固定化。1973年已用于工业化生产，用于制造各种半合成青霉素和头孢菌素。用同一种固定化青霉素酰化酶，只要改变pH等条件，就既可以催化青霉素或头孢菌素水解生成6-氨基青霉烷酸（6-APA）或7-氨基头孢霉烷酸（7-ACA），也可以催化6-APA或7-ACA与其他的羧酸衍生物进行反应，以合成新的具有不同侧链基团的青霉素或头孢霉素。天门冬氨酸酶：1973年日本用聚丙烯酰胺凝胶为载体，将具有高活力天门冬氨酸酶的大肠杆菌菌体包埋制成固定化天门冬氨酸酶，用于工业化生产，将延胡索酸转化生产L-天门冬氨酸。1978年以后，改用角叉菜胶为载体制备固定化酶，也可将天门冬氨酸酶从大肠杆菌细胞中提取分离出来，再用离子键结合法制成固定化酶，用于工业化生产。天门冬氨酸-β-脱羧酶：将含天门冬氨酸-β-脱羧酶的假单胞菌菌体，用凝胶包埋法制成固定化天门冬氨酸-β-脱羧酶，于1982年用于工业化生产，催化L-天门冬氨酸脱去β-羧基，生产L-丙氨酸。 2.2. 酶分子修饰酶分子修饰是通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程。酶分子修饰技术已经成为酶工程中具有重要意义和广阔应用前景的研究、开发领域。通过酶分子修饰，可以提高酶活力，增加酶的稳定性，消除或降低酶的抗原性等。举例如下： α-淀粉酶分子中大多数含有钙离子，有些则含有镁离子或锌离子等其它离子，所以一般的α-淀粉酶是杂离子型的。如果将其它杂离子都换成钙离子，则可以提高酶活力并显著增强酶的稳定性。结晶的钙型α-淀粉酶的活力比一般结晶的杂离子型α-淀粉酶的活力提高3倍以上，而且稳定性大大增加。每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍等。具有抗氧化、抗辐射、抗衰老的功效，但是其在血浆中的半衰期仅为6～30min, 经过大分子结合修饰，其稳定性显著提高，半衰期延长70～350倍。具有抗癌作用的精氨酸酶经聚乙二醇结合修饰，生成聚乙二醇-精氨酸酶后其抗原性被消除；对白血病有显著疗效的L-天门冬酰胺酶经右旋糖酐或者聚乙二醇结合修饰后，都可以使抗原性显著降低甚至完全消除，其中经过聚乙二醇结合修饰的L-天门冬酰胺酶，1994年已经得到美国FDA批准，正式作为治疗急性淋巴性白血病的药物使用；笔者等人利用单甲氧基聚乙二醇修饰木瓜凝乳蛋白酶，可以使酶的抗原性显著降低。 2.3. 酶的非水相催化酶在非水介质（有机溶剂介质、气体介质、超临界流体介质、离子液介质等）中进行催化反应的技术过程称为酶的非水相催化。酶在非水介质中的催化具有提高非极性底物或产物的溶解度、进行在水溶液中无法进行的合成反应、减少产物对酶的反馈抑制作用、提高手性化合物不对称反应的底物选择性、基团选择性、区域选择性、对映体选择性等显著特点[2]。酶的非水相催化在手性药物的拆分，发光高分子聚合物、导电高分子聚合物的生产、生物柴油的研制等方面显示出良好的应用前景。 2.4. 酶在手性化合物拆分方面的研究、开发和应用越来越广泛。如：环氧丙醇衍生物的拆分：2,3-环氧丙醇单一对映体的衍生物是一种多功能手性中间体。它可以用于合成β-受体阻断剂、爱滋病毒（HIV）蛋白酶抑制剂、抗病毒药物等多种手性药物。其消旋体可以在有机介质体系中用酶法进行拆分，获得单一对映体。例如，用猪胰脂肪酶（PPL）等在有机介质体系中对2,3-环氧丙醇丁酸酯进行拆分，得到单一的对映体。芳基丙酸衍生物的拆分[3]：2-芳基丙酸是手性化合物，其单一对映体衍生物是多种治疗关节炎、风湿病的消炎镇痛药物，如布洛芬、酮基布洛芬、萘普生等的活性成分。用脂肪酶在有机介质体系中进行消旋体的拆分，可以得到S-构型的活性成分。苯甘氨酸甲酯的拆分：苯甘氨酸的单一对映体及其衍生物是半合成β-内酰胺类抗生素，如氨苄青霉素、头孢氨苄、头孢拉定等的重要侧链。脂肪酶在有机介质中通过不对称氨解反应，可以拆分得到单一对映体。 2.5. 酶的定向进化酶的定向进化技术是模拟自然进化过程（自然随机突变和自然选择等），在体外进行基因的人工随机突变，建立突变基因文库，通过人工控制条件的特殊环境，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。酶定向进化的特点：酶的定向进化不需要事先了解酶的结构、催化功能、作用机制等有关信息，应用面广；通过全基因组重排、基因家族重排、DNA重排、易错PGR等技术，在体外人为地进行基因的随机突变，短时间内可以获得大量不同的突变基因，建立突变基因文库；在人工控制条件的特殊环境下进行定向选择，进化方向明确，目的性强。通过酶的定向进化，可以显著提高酶活力、增加酶的稳定性、改变酶的底物特异性等。例如，1993年，Chen KQ等人通过易错PCR技术进行定向进化，使枯草杆菌蛋白酶在60%的DMF中进行非水相催化的比活力提高157倍； 1994年，Stemmer通过DNA重排技术进行定向进化，使β－内酰胺酶的活力提高32000倍； 2000年，Wang等人用易错PCR技术进行定向进化，使天冬氨酸酶的米氏常数（Km）降低4.6倍，大大提高了酶与底物的亲和力，酶活力提高28倍，同时使热稳定性和pH稳定性显著提高； 2004年，Aharoni,a等人用全基因组重排技术进行定向进化，使大肠杆菌磷酸酶对有机磷酸酯的活力提高40倍，同时使该酶对有机磷酸酯的特异性提高2000倍。 3. 新型药用酶研究进展与应用前景 3.1. 核酸类酶核酸类酶是一类具有生物催化功能的核糖核酸（RNA）分子[4]。它可以催化本身RNA的剪切或剪接作用，还可以催化其它RNA、DNA、多糖、酯类等分子进行反应。核酸类酶具有抑制人体细胞某些不良基因和某些病毒基因的复制和表达等功能。表达的功能。据报道，一种发夹型核酸类酶，可使爱滋病毒（HIV）在受感染细胞中的复制率降低90%，在牛血清病毒（BLV）感染的蝙蝠肺细胞中也观察到核酸类酶抑制病毒复制的结果。这些结果表明，适宜的核酸类酶或人工改造的核酸类酶可以阻断某些不良基因的表达，从而用于基因治疗或进行艾滋病等病毒性疾病的治疗。 3.2. 端粒酶端粒酶是催化端粒合成和延长的酶。端粒酶是一种核糖核蛋白，包含蛋白质和RNA两种基本成分[5]。其RNA组分中含有构建端粒重复序列的核苷酸模板序列。在合成端粒的过程中，端粒酶以其本身的RNA组分作为模板把端粒重复序列加到染色体DNA的末端，使端粒延长。端粒的存在不但可以避免外界因素对DNA的破坏，而且可以在复制过程中，通过牺牲自我而避免染色体DNA受损，以维护染色体结构和功能的完整性。单细胞四膜虫等纤毛虫类的端粒很短，细胞内始终保持高活性的端粒酶，酶活性的抑制将导致细胞寿命缩短。人的正常体细胞内有很长的端粒，却没有检测到端粒酶的活性。这是由于人体端粒的合成和延长是在胚胎发育期进行的，随着细胞分化，在人体的正常细胞内（除了生殖细胞和干细胞等以外），端粒酶的生物合成和酶活性都受到抑制。而在分化程度较低的癌细胞中却可明显地检测得到端粒酶的活性。因此可以通过测定细胞内的端粒酶活性，诊断细胞是否发生了癌变。 3.3. 抗体酶抗体酶又称为催化性抗体。是一类具有生物催化功能的抗体分子。抗体是由抗原诱导产生的能与抗原特异结合的免疫球蛋白。要使抗体成为具有催化功能的抗体酶，只要在抗体的可变区赋予酶的催化特性，就可能成为抗体酶。抗体酶同时具有抗体的高度特异性以及酶的高效催化能力。是通过人工设计，采用现代生物技术而获得的一类新的生物催化剂，有些是在自然界原本不存在的。抗体酶的制备方法主要有诱导法和修饰法。修饰法是对抗体进行分子修饰，在抗体与抗原的结合部位引进催化基团，而成为具有生物催化活性的抗体。诱导法是抗体酶制备的主要方法，是在特定的抗原诱导下合成抗体酶的方法。根据所采用的抗原不同，诱导法有半抗原诱导法和酶蛋白诱导法。结语：酶工程作为生物工程的重要组成部分，其作用之重要、研究成果之显著已为世人所公认。充分发挥酶的催化功能、扩大酶的应用范围、提高酶得应用效率是酶工程应用研究的主要目标。21世纪酶工程的发展主题是：新酶的研究与开发、酶的优化生产和酶的高效应用。除处采用常用技术外，还要借助基因学和蛋白质组学的最新知识，借助DNA重排和细胞、噬菌体表面展示技术进行新酶的研究与开发，目前最令人瞩目的新酶有核酸类酶、抗体酶和端粒酶等。要采用固定化、分子修饰和非水相催化等技术实现酶的高效应用，将固化技术广泛应用于生物芯片、生物传感器、生物反应器、临床诊断、药物设计、亲和层析以及蛋白质结构和功能的研究，使酶技术在制药领域发挥更大的作用。表1 通过体内酶活力变化进行疾病诊断酶疾病与酶活力变化淀粉酶胆碱酯酶酸性磷酸酶碱性磷酸酶谷丙转氨酶谷草转氨酶 γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）醛缩酶精氨酰琥珀酸裂解酶胃蛋白酶磷酸葡糖变位酶 β-葡萄糖醛缩酶碳酸酐酶乳酸脱氢酶端粒酶山梨醇脱氢酶（SDH） 5’-核苷酸酶脂肪酶肌酸磷酸激酶（CK） α-羟基丁酸脱氢酶单胺氧化酶（MAO）磷酸己糖异构酶鸟氨酸氨基甲酰转移酶乳酸脱氢酶同工酶葡萄糖氧化酶亮氨酸氮肽酶胰脏疾病，肾脏疾病时升高，肝病时下降肝病，肝硬化，有机磷中毒、风湿等，活力下降前列腺癌，肝炎，红血球病变是活力升高佝偻病，软骨化病，骨癌，甲状旁腺机能亢进时，活力升高，软骨发育不全等活力下降肝炎等肝病，心肌梗塞等，活力升高肝病，心肌梗塞等，活力升高原发性和继发性肝癌，活力增高至200单位以上，胰头癌、阻塞性黄疸、肝硬化，胆道癌等，血清中酶活力升高急性传染性肝炎，心肌梗塞，血清中酶活力显著升高急慢性肝炎，血清中活性增高胃癌时，活力升高；十二指肠溃疡时，活力下降肝炎癌症时，活力升高肾癌及膀胱癌，活力升高坏血病，贫血等活力升高肝癌，急性肝炎，心肌梗塞，活力显著升高，肝硬化，活力正常癌细胞中含有端粒酶，正常体细胞内没有端粒酶活性急性肝炎，显著提高，阻塞性黄疸及胆道疾病，基本不升高阻塞性黄疸，肝癌，活力显著增高急性胰腺炎，活力明显增高，胰腺癌，胆管炎患者，活力升高心肌梗塞，活力显著升高，肌炎，肌肉创伤，活力升高心肌梗塞，心肌炎，活力增高肝脏纤维化，糖尿病，甲状腺机能亢进，活力升高急性肝炎，活力极度升高；心肌梗塞，急性肾炎，脑溢血，明显很高急性肝炎，急速增高，肝癌，明显升高心肌梗塞，恶性贫血，LDH4增高，白血病，肌肉萎缩，LDH2增高，白血病，淋巴肉瘤，肺癌，LDH3增高，转移性肝癌，结肠癌，LDH4增高；肝炎、原发性肝癌、脂肪肝、心肌梗塞、外伤、骨折，LDHH5增高测定血糖含量，诊断糖尿病肝癌、阴道癌、阻塞性黄疸，活力明显升高表2用酶测定物质的量的变化进行疾病诊断酶测定的物质用途葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶+过氧化物酶尿素酶谷氨酰胺酶胆固醇氧化酶 DNA聚合酶葡萄糖葡萄糖尿素谷氨酰胺胆固醇基因测定血糖、尿糖、诊断糖尿病测定血糖、尿糖、诊断糖尿病测定血液、尿液中尿素的量，诊断肝脏肾脏病变测定脑脊液中谷氨酰胺的量，诊断肝昏迷，肝硬化测定胆固醇含量，诊断高血脂等通过基因扩增。基因测序，诊断基因变异，检测癌基因表3 酶在疾病治疗方面的应用酶名来源用途淀粉酶蛋白酶脂肪酶纤维素酶溶菌酶尿激酶链激酶链道酶青霉素酶 L-天冬酰胺酶超氧化物歧化酶凝血酶胶原酶右旋糖甘酶胆碱酯酶溶纤酶弹性蛋白酶核糖核酸酶尿酸酶 L-精氨酸酶 L-组氨酸酶 L-蛋氨酸酶谷氨酰胺酶 α-半乳糖苷酶核酸类酶降纤酶木瓜凝乳糖蛋白酶抗体酶胰脏、麦芽、微生物胰脏、胃、植物、微生物胰脏、微生物霉菌蛋清，细菌人尿链球菌链球菌蜡状芽孢杆菌大肠杆菌微生物，植物，动物血液，肝脏等动物，蛇，细菌，酵母菌细菌微生物细菌蚯蚓胰脏胰脏牛肾微生物微生物微生物微生物牛肝，人胎盘生物，人工改造蛇毒番木瓜分子修饰，诱导治疗消化不良，食欲不振治疗消化不良，食欲不振，消炎，消肿，除去坏死组织，促进创伤愈合，降低血压治疗消化不良，食欲不振治疗消化不良，食欲不振治疗各种细菌性和毒性疾病治疗心肌梗塞，结膜下出血，黄斑部出血治疗血栓静脉炎，咳痰，血肿，骨折外伤治疗炎症，血管栓塞，清洁外伤创面治疗青霉素引起的变态反应治疗白血病预防辐射损伤，治疗红斑狼疮，皮肌炎，结肠炎，氧中毒治疗各种出血病分解胶原，消炎，化脓，脱痴，治疗溃疡预防龋齿治疗皮肤病支气管炎，气喘溶血栓治疗动脉硬化，降血脂抗感染，祛痰，治肝癌治疗痛风抗癌抗癌抗癌抗癌治疗遗传缺陷病（弗勃莱症）基因治疗，治疗病毒性疾病溶血栓治疗腰间盘突出，肿瘤铺助治疗与特异抗原反应，清除各种致癌性抗原表4 酶在药物制造方面的应用酶主要来源用途青霉素酰化酶 11-β-羟化酶 L-络氨酸转氨酶 β-络氨酸酶 α-甘露糖苷酶核苷磷酸化酶酰基氨基酸水解酶 5’-磷酸二酯酶多核苷酸磷酸化酶无色杆菌蛋白酶核糖核酸酶蛋白酶 β-葡萄糖苷酶微生物霉菌细菌植物链霉菌微生物微生物桔青梅等微生物微生物细菌微生物动物，植物，微生物黑曲霉等微生物制造半合成青霉素和头孢菌素制造氢化可的松制造多巴（L-二羟苯丙氨酸）制造巴多制造高效链霉菌生产阿拉伯糖腺嘌呤核苷（阿糖腺苷）生产L-氨基酸生产各种核苷酸生产聚肌胞，聚集苷酸由猪胰岛素转变为人胰岛素生产核苷酸生产L-氨基酸生产人参皂贰-Rh2 参考文献： [1]邓红涛，吴健等.酶的固定化及其应用的研究进展[J].膜科学与技术,2004.48-53 [2]吴梧桐.酶工程技术的研究及其在医药领域的应用[J].药学进展,1994.129-134 [3]郑成.酶工程的研究进展简述[J].韶关学院学报(自然科学版),2001.39-44 [4]郭勇.酶工程研究进展与发展前景[J].华南理工大学学报(自然科学版),2002.130-133 [5]穆小民.酶的开发利用与酶工程[J].生物技术,1995.5-8 感谢信我的毕业论文是在尊敬杨春文老师的精心指导下完成的，感谢杨春文老师，感谢他的睿智，感谢他的幽默，感谢他的渊博。在撰写论文期间，杨老师对我的宽容和理解使我受益匪浅，而杨老师严谨的治学度和广泛的涉猎将成为我人生的积淀，我永生难忘。感谢我的班主任杨全录老师，感谢他的细致，同时也感谢他在我有困难得时候所给与我无私的帮助。杨全录老师是我的良师益友，我尊重他，也感谢他。感谢杨老师的辛劳，感谢杨老师的随和，虽然时日有限，却给我终生收益无穷之道。感谢学校的师老师，冯老师，李老师等其他老师，他们用为人师表的风范，深刻阐释了 “教书人为本，育人德为先”的宗旨，这些都使我感到由衷的钦佩。也祝他们恩泽遍天下，桃李香九州。同班的同学们也要各奔前程了，三年来我们用我们的智慧、才情、汗水和毅力为我们将来的成功播撒下奋斗的汗水，为我门的青春留下的是无缘无悔。而今我们即将离去，直到这时候我才我是多么的留恋学校的一花一草，他们将永远尘封进我记忆的档案。来自五湖四海的兄弟姐妹们相聚在一起，一起承担，一起分享，这让我相信原来这世界上还真有缘分，但班级的和谐，融洽却让我更加的相信，缘是天意，分在人为。感谢三年来他（她）们对我的关心和照顾，祝各位兄弟姐妹们都一路顺风前程似锦。感谢我的父母，感谢他们对我继续求学的理解和支持，给我营造幸福港湾的同时又给了我一次继续求学成才的机会。感谢你们！罗玉麟 2011年09月28日 THANKS !!! 致力为企业和个人提供合同协议，策划案计划书，学习课件等等打造全网一站式需求欢迎您的下载，资料仅供参考可修改编辑

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