霍乱弧菌检验操作规程.doc

霍乱弧菌检验操作规程

1 范围

本操作规程规定了带菌者粪便，患者粪便、呕吐物、肛拭子，外环境水样，水生动物、食品等标本中的霍乱弧菌的检验方法。

2 检验依据

国家传染病诊断标准：WS 289—2008
卫生部疾病控制司《霍乱防治手册》第五版
北京市卫生防疫站《卫生防疫微生物检验操作规程》
《北京市常见传染病防制工作手册》
（北京市疾病预防控制中心传地所2008年12月内部资料）

3 设备和材料

3.1 冰箱： -20℃～4℃。
3.2 恒温培养箱： 36±1℃。
3.3 暗视野显微镜： 10×～100×。
3.4 架盘药物天平： 0g～500g, 精确至0.5g。
3.5 锥形瓶： 100 mL、500 mL。
3.6 灭菌吸管： 1mL (具0.01mL刻度)、10mL (具0.1mL刻度)。
3.7 灭菌平皿： 直径90 mm。
3.8 灭菌试管：10 mm×75 mm、16 mm×160 mm.。
3.9 灭菌注射器： 1 mL。
3.10 载玻片。
3.11 盖玻片。
3.12 无菌棉签。
3.13 500mL灭菌采样瓶。
3.14 生物安全柜：Ⅱ级。

4 培养基和试剂

4.1 碱性蛋白胨水（Ph8.8-9.0 ， 10—15mL/管 ， 10× 50mL/瓶）。
4.2 庆大霉素琼脂（15-20 mL/块）。
4.3 普通营养琼脂（15-20 mL/块）。
4.4 半固体培养基（3mL/小管，5mL/中管 ）。
4.5 霍乱弧菌单克隆抗体(国家CDC流研所提供， 5—10μL/菌落)。
4.6 泰国S＆A诊断血清（5—10μL/菌落)。

5 检验程序

霍乱弧菌检验程序见图1。

6 标本的收集与送检

要求见表标准与要求（一）—（四）

7 操作步骤

7.1 快速辅助诊断：其结果只是初步报告，不是确诊报告。
7.1.1 动力及动力抑制试验：
7.1.1.1 如是急性期病人的水样便，则用接种环或滴管取1滴水样便在玻片上然后盖上盖玻片，直接用暗视野显微镜观察动力；或加生理盐水1滴在玻片上，用接种环取较干的便1
环放置生理盐水中研匀，盖上盖玻片直接用暗视野显微镜观察动力；高度可疑的标本可取已增菌的碱性蛋白胨水1滴在玻片上然后盖上盖玻片，直接用暗视野显微镜观察动力。如在镜下见到穿梭样运动（象夜空中的流星）即动力试验阳性，否则阴性。
7.1.1.2 动力试验阳性的标本，则取O1和O139群霍乱弧菌诊断用单克隆抗体各2滴放置玻片上，取标本1滴或1环放在其中研匀，盖上盖玻片，用暗视野显微镜观察是否有原来的穿梭样运动，如穿梭样运动已迅速停止并凝集成块状即动力抑制试验阳性，否则阴性。
7.1.1.3 动力试验和动力抑制试验结果可口头初步报告，但不是确诊报告。双阳时口头报告高度可疑。
7.2 分离培养
7.2.1 粪便、呕吐物和肛拭子：对急性期病人水样便标本在碱性蛋白胨水增菌培养的同时可用接种环取一满环或用棉拭子直接接种在庆大霉素琼脂培养基上；所有病人标本都应接种碱性蛋白胨水增菌培养。37℃增菌6～8h后，从菌膜下表层取一接种环培养物，把接种环在试管壁上轻轻碰一下，待接种环上留有残液后划线接种庆大霉素琼脂培养基，划线时接种环在基线处反复多次划线以接种的菌液干了为准，最后用接种环从基线处开始不间断划线到完成或四区划线（必须划出单个菌落）。37℃培养，18h-24h。必要时（高度可疑或密接服药的病人）可取第一次增菌液1 mL转种于8-10mL碱性胨水管中37℃二次增菌培养6～8h后做分离。
7.2.2 水样：十倍浓缩碱胨水增菌培养法
水体的采集一般用无菌的500mL水样瓶采集相对静止的表层水(深度为30cm以内)
500mL，2～3小时内送检。取450mL水样，用1mol/L氢氧化钠调整至pH8.8-9.0。然后加
10倍浓缩碱性胨水50mL。为抑制杂菌可再加入1%亚碲酸钾0.25 mL和1000单位/ mL青霉素1 mL。37℃培养过夜划线接种庆大霉素琼脂培养基，接种划线方法同7.2.1。培养时把瓶盖打开三分之一。培养后取菌膜下表层培养物0.2-0.3 mL接转种于10mL碱性胨水管中作二次增菌，37℃培养6～8h，再划线接种庆大霉素琼脂培养基，37℃培养18-24h。接种划线方法同7.2.1。
7.2.3 食品及水产品样本：
7.2.3.1 液体食品：同7.2.2
7.2.3.2 涂抹标本：使用无菌棉签涂抹3～5只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔或食品等表面，直接接种到10 mL碱性蛋白胨水，37℃增菌培养8～12h划线培养。同时取菌膜下表层培养物接种庆大培养基分离培养同时吸0.2～0.1 mL转种于10mL碱性胨水管中作二次增菌，37℃培养8～12h再划线接种庆大霉素琼脂培养基，37℃培养18-24h。接种划线方

食品及水产品、物品表面涂抹涂样本表面涂拭物
病人粪便标本
水样、液体食品等标本

增菌３７℃过夜培养

增菌３７℃ 8-12h

增菌３７℃ 6-8h

二次增菌３７℃6-8h

二次增菌３７℃8-12h

二次增菌３７℃6-8h

动力试验（+）
动力抑制试验（+）
庆大平皿划线培养３７℃18-24h

每皿挑取9-10个可疑菌落血清凝集试验
口头报告高度可疑

霍乱分群诊断（单克隆抗体）

Ｏ１３９群

Ｏ１群

霍乱分型诊断

凝集和氧化酶试验阳性：
确诊报告
PCR
（测 CT）

分纯（普通琼脂）３７℃18-24h

半固体琼脂３７℃18-24h
分纯（普通琼脂）

上送菌种

图1

法同7.2.1。
7.2.3.3 固体食品：25-50克标本放入碱性胨水中增菌培养同7.2.3.2。标本与碱性胨水的比例为1：5。
7.3 可疑菌落：每一庆大霉素琼脂平板上各挑取9-10个少于9个的全部挑取)可疑菌落做玻片凝集试验进行鉴定。可疑菌落的形态：略带青灰色、半透明、扁平、微隆起、光滑湿润。如延长培养时间或室温放置到48h，菌落略带黄色，中心形成黑色金属碲沉淀。
7.4 鉴定分型
7.4.1 玻片凝集试验
7.4.1.1 01、0139群霍乱弧菌初步鉴定：挑取可疑菌落与01群、0139霍乱弧菌单克隆抗体做玻片凝集试验。如可疑菌落很快(一般在10s内)出现肉眼可见的明显凝集颗粒，在生理盐水中不凝集者判为阳性。均为阴性时方可报告：未检出01、0139群霍乱弧菌。
7.4.1.2 分纯：用接种环取抗原抗体复合物接种于普通营养琼脂板上分纯，37℃过夜培养。
7.4.1.2 复核及分型：挑取可疑菌落和纯培养物进行复核及分型。01、0139群霍乱弧菌用诊断血清和单克隆抗体复核。01群霍乱弧菌分型使用小川型及稻叶型的单价血清和单克隆抗体做玻片凝集反应，同时用生理盐水做对照。与小川型单价血清和单克隆抗体凝集，与稻叶型单价血清和单克隆抗体不凝集者为小川型。与小川型单价血清和单克隆抗体不凝集，与稻叶型单价血清和单克隆抗体凝集者为稻叶型。与小川型、稻叶型单价血清和单克隆抗体均呈明显凝集者为彦岛型。
7.4.2 氧化酶试验和菌种保存：取纯单个菌与相应的血清和单克隆抗体进一步验证鉴定的结果，如凝集阳性者做氧化酶试验。氧化酶试验时应注意不要用过期试剂和金属铁质的接种针（环），操作见WS 289—2008附录A（ A.4.1.2）。氧化酶试验阳性者保存菌种：用接种环取单个菌落穿刺半固体培养基中，底部1/3以下不必穿刺。37℃过夜培养，换胶塞密封室温保存。
7.4.3 PCR检测霍乱毒素基因，见WS 289—2008附录B。
7.4.4 菌种上送：半固体一支；纯培养普通琼脂一块；填写统一的送检单。

8 质量控制

8．1 用接种环取完标本、诊断血清、做完每一份标本实验等，接种环应严格在酒精灯火焰上消毒，避免交叉污染。
8．2 玻片凝集试验阳性时，一定同时做生理盐水对照。在生理盐水中不凝集者，方可判断为阳性。
8．3 标本、增菌管、培养平皿要严格编号，标识清晰，避免结果错报。
8．4 诊断血清、培养基保存在指定温度范围内；诊断血清要在有效期内使用，培养基保存不超过一个月。

9 实验室生物安全

9．1 标本检测要穿实验专用服、戴口罩、手套，用过的口罩、手套放黄色污物袋中，及时高压处理。
9．2 用过的玻片及时放入消毒缸中浸泡；实验完毕，用浸泡消毒液的抹布擦拭实验台面，或紫外线照射消毒。
9．3 消毒制品要有有效的批准文号，在有效期内使用。 配制的消毒使用液，要表明配制日期。
9．4 标本、培养物、实验废弃物等，要经高压消毒处理后，方可丢弃。

13

标准与要求（一）

内 容
霍乱诊断标准
WS289-2008

2009年霍乱检测具体要求

一．标本
的收集
1．标本种类
患者粪便、呕吐物、
肛拭子必取
肠道门诊以患者粪便为主；
爆发疫情患者粪便、呕吐物、肛拭子必取；
水样，
水生动物、污染的标本以涂抹为主、
食品（可疑或剩余）等标本。
2．标本数量
水样便取1-3 mL
成形便取指甲大小
肛拭子用直肠棉拭
或采便管取
水样便或呕吐物取1-3 mL；
成形便取指甲大小；
肛拭子用采便管；
水样500mL，
涂抹标本以3-5支无菌棉拭涂抹后为一件。
食品
液体：250 mL；固体：25-50克

标准与要求（二）

内 容

霍乱诊断标准
WS289-2008

2009年霍乱检测具体要求

二．标本
的送检
1．运送液种类
碱性蛋白胨水（增菌液）；
文腊二氏保存液；
Cary-Blair二氏半固体保存培养基；
pH8.8~9.0
碱性蛋白胨水
（增菌液）
2．运送液数量

标本与保存液比例约为1：5
pH8.8~9.0
碱性蛋白胨水
（增菌液）
10—15mL

标准与要求（三）

内 容
霍乱诊断标准
WS289-2008
2009年
霍乱检测具体要求

三．标本
的分离培养
1． 直接
分离培养
急性期病人水样便直接接种选择性培养基

肠道门诊：急性期病人水样便直接接种选择性培养基；动力、制动试验。
爆发疫情患者粪便、呕吐物、肛拭子直接接种选择性培养基。
2． 增菌后
分离培养
所有标本用碱性蛋白胨水放37℃增菌6~8h后接种选择性培养基

肠道门诊非水样便放37℃增菌6~8h后接种选择性培养基；动力、制动试验。
爆发疫情患者粪便、呕吐物、肛拭子放37℃增菌6~8h后接种选择性培养基；
外环境标本37℃二次增菌。

标准与要求（三）

内 容
霍乱诊断标准
WS289-2008
2009年
霍乱检测具体要求

三．标本
的分离培养
3.分离培养基种类
强选择性培养基：
庆大霉素琼脂、4号琼脂和TCBS琼脂
弱选择性培养基：碱性营养琼脂
强选择性培养基：
庆大霉素琼脂
4. 培养时间和可疑菌落的描述
标本接种分离培养基放37℃培养18~24h
可疑菌落：
庆大霉素琼脂和4号琼脂：灰色、圆形、透明或半透明、光滑、湿润、扁平、大小约为2mm.
碱性营养琼脂:无色，其余同上
灰色、圆形、透明或半透明、光滑、湿润、扁平、大小约为2mm.

标准与要求（四）

内 容
霍乱诊断标准
WS289-2008
2009年
霍乱检测具体要求

四．菌株
鉴定
1.菌株初筛
玻片凝集试验:
O1、0139群
挑庆大霉素琼脂、4号琼脂和碱性营养琼脂5个以上可疑菌落
氧化酶试验:
肠道门诊：
玻片凝集试验
O1、0139群
挑庆大霉素琼脂9~10个可疑菌落

标准比较与要求（四）

内 容
霍乱诊断标准
WS289-2008
2009年
霍乱检测具体要求

四．菌株
鉴定
2. 菌株复筛
玻片凝集试验:
氧化酶试验:
区CDC:
玻片凝集试验
用普通琼脂的纯菌
O1、0139群、小川、稻叶
氧化酶试验
PCR检测霍乱毒素基因
2.菌株上送
按菌株管理要求进行上送
半固体一支
普通琼脂一块
立即送检或电话联系根据情况而定，填写统一的送检单

北京市肠道传染病样本送检表

送检单位： 送检日期： 年 月 日
标本来源：散发病例/ 疫情 / 监测 / 鉴定 /其他（请注明） 采样日期： 年 月 日
检测项目：霍乱弧菌 / 志贺菌 / 肠致泻性大肠杆菌 / O157：H7 / 沙门菌 / 腹泻病毒 / 其他（请注明）
编号
姓名
性
别
年
龄
主要症状
粪便性状
标本类型
临床检测结果

采样地点

检测结果
（所有检测结果均报）

备注
粪便
可疑阳性培养物

其他
白细胞
红细胞
其他
试验

主要症状：1发热（ ℃）；2腹泻（ 次/天）；3腹痛；4恶心；5呕吐（ 次/天）；6里急后重；7其他（请描述，如呼吸道症状）：（可多选）
粪便性状：1稀便，2水样便，3米泔水样便，4洗肉水样便，5粘液便，6脓血便，7血便，8其他（请注明）：
检测腹泻病毒：需将原始粪便样本保存在便盒立即送检。24小时内不能送检的，冻存在-20℃冰箱内，运送时加冰运送。
送样人及联系电话： 收样单位： 收样人： 收样日期： 年 月 日

北京市肠道门诊
O1群与O139群霍乱弧菌的检验程序

标本
（粪便）

快速试验 增菌分离培养 直接分离培养
增菌培养
（碱胨水）
（水样便）

37℃ 6~8小时

37℃ 18~24小时

动力试验（+）
制动试验（+）

分离培养
（庆大霉素琼脂）

玻片凝集阳性
（O1群、O139群诊断血清）
凝集可疑菌落

初步报告
（区CDC复核）

37℃ 18~24小时

纯培养
（区CDC接种普通琼脂）

确诊报告
（区CDC复核鉴定）

确 诊 报 告

菌株上送
（市CDC核查、分型）

O139群

北京市疾病预防控制中心制