药物跨膜转运载体docor.ppt

药物跨膜转运载体-ABC类载体一、ABC类转运体 ATP结合盒(ATP-binding cassette，ABC)类物质外排转运载体。这类转载体转运各种类型的底物如糖、氨基酸、金属离子、多肽、蛋白质以及各种脂溶性物质外排式跨膜转运。ABC类载体是许多生命过程必须的，缺陷可以引起多种疾病或与多种疾病有关如囊性纤维化、神经系统疾病、视网膜变性、胆固醇和胆汁转运缺失、贫血症和药物反应异常等。特点：1。与ATP结合，利用ATP跨膜转运物质。底物分子转运是单向的，通常是泵出细胞外。2。结构上：ATP-结合域,称之为核苷结合包(NBF)和跨膜(TM)域。该域一般由6个-螺旋段组成。NBF 含3个保守区域Walker A、Walker B和Walker C。在Walker A和B存在ATP结合点，而Walker C 为一签名区,位于Walker B 的上游，C 区是相应ABC载体特有性的。3。典型的ABC 载体有两个NBF 和两个TM域,NBF 存在于胞浆侧。发现48 个ABC 载体。这些基因根据区域的构成和氨基酸的同组关系分成7个亚型。许多ABC载体在脂质层的功能维持、脂肪酸转运和类固醇类转运方面有重要的作用。已发现14种与人类疾病相关的ABC基因 ABCC2（Abcc2）基因突变：与Dubin-Johnson 综合征有关。ABCC2 蛋白存在于肝细胞的管侧面膜上调节有机阴离子转运。在多有机阴离子转运载体（TR-）的缺陷的大鼠中，该大鼠已用作Dubin-Johnson 综合征的动物模型。ABCB7基因的错义与成高铁红细胞贫血症和失调（XLSA/A）相关。CFTR 蛋白为氯离子通道，与所有外分泌有关，缺陷导致胆囊纤维病变。ABCC8 是磺酰脲受体，对磺酰脲药物有高度的亲和力。磺酰脲类药物为治疗非胰岛素依赖性糖尿病，主要促进胰岛素的分泌。ABCC8基因突变可能type II 糖尿病有关。二、多药耐药（药物外排载体）所有ABC的外排在体均存在于细胞膜上，参与各种结构类型的药物、代谢物和化合物的外排。根据结构类型，药物外排载体分为四大类。ABC家族药物转运载体的预测二级结构。NBD,（ATP）核苷结合点,IN,细胞内,OUT 细胞外 药物载体在极性细胞（包括组织内皮或上皮细胞）中的定位。1.MDR1 P-糖蛋白(MDR1 P-glycoprotein)ABCB1.又称为MDR1，P-GP 或PGY1。人MDR1MDR3药物药物，脂质MDR基因MDR基因Mdr1a/mdr1bmdr2 药物药物，脂质P-GP 有两个相似和对称的半载体组成,每个半载体有一个ATP结合点和6个TM域。两个半载体只有43%氨基酸序列是一致的。先与ATP结合，再水解是药物转运必需的。,不同的底物转运需要的ATP分子是不同的，每转运一个药物分子出细胞,需要0.3-3个分子的ATP。P-gp 催化循环催化循环.药物和 ATP与Pgp 结合 P-GP转运柔红霉素(DNR)跨膜两步过程。环孢素A(CsA),XR9576(XR)和长春碱(VL)在细胞浆侧面阻断,维拉帕米(VER)在细胞外侧阻断(优先占领).2.P-GP 底物 P-GP有各种类型的底物如秋水仙碱阿霉素、长春碱、脂质、类固醇、化学异物和多肽等.似乎无共性1）多数底物是两性分子2)化合物脂溶性和氢键的数目决定底物与P-GP亲和力的重要参数。脂溶性大或氢键数目多，P-GP的亲和性高.电子供体基团间距离有一定范围是识别P-GP结合点必需的，至少其中一个2.5 0.3，另一个为4.6 0.6 MDR1 P-GP 抑制剂第一代P-GP抑制剂如维拉帕米、环孢素 A第二代或第三代抑制剂 PSC 833,GF120918 P-GP生理功能 1)肿瘤细胞 耐药原因之一 诱导性2）正常体内：生理性屏障（肠上皮、脑血管内皮细胞、胆小管上皮细胞、胎盘合胞体滋养细胞）1)血脑屏障 在脑血管内皮细胞腔侧面表达丰富的P-GP,成为许多药物难以通过血脑屏障的原因;一些疾病如癫痫诱导P-GP表达,成为顽固性癫痫的原因之一炎症下调P-GP表达,导致血脑屏障的通透性显著增加.Fig.Western blot showed expression of P-gp from the cerebral cortex of normal rats and PTZ-kindled rats.n=3.(*p0.01 vs Normal)Fig.P-gp functional activity in hippocampus and cerebral cortex of normal rats and PTZ-kindled rats.Samples of 60min after a single dose of 0.2mg/kg Rh123.n=4.(*p0.05,*p0.01 vs Normal)Fig.Distribution of PB in brain tissues of normal rats,kindled rats and kindled rats treated with CsA(5 mg/kg).Samples of 60min after a single dose of 10mg/kg PB.Data were expressed as ratio values as meanSD(n=4).(*p0.05,*p0.01 vs normal rats,#p0.05,#p0.01 vs kindled rats).2)在肝-胆和肠中作用 生物利用度的原因(1)保护机制 防止毒物由胃肠道进入体内。(2）肠上皮细胞中P-GP分泌功能成为许多药物吸收差的原因之一,成为药物口服吸收的障碍。野生型小鼠灌胃 50 mg/kg 紫衫醇约有95%的药物原型从粪中排泄.同时口服P-GP抑制剂环孢素A(50 mg/kg),PSC 833(50 mg/kg),GF120918(25 mg/kg),LY335979(80mg/kg)或R101933(80 mg/kg),显著降低粪中原型药物的排谢分数，分别为32.4%,12.5%,6.2%,34.9%和73.6%。在mdr1a/1b基因敲除小鼠，粪中原型排泄分数只有6%。3)P-gP介导的药物外排,符合载体转运的特点，存在饱和特性某些底物的M-M常数不同底物和剂量肠道P-GP的作用是不同的。A.地高辛通常剂量是0.5到1mg，肠内的浓度不到10mol/l，低于Km 58 mol/l。P-Gp 在吸收方面有重要的意义，可能是该药物吸收程度地和变异大的主要原因。B.剂量大于50mg，肠内药物浓度达到mmol/l 水平，可能超过相应药物的Km 值，P-GP的活性处于饱和，P-GP对药物吸收的贡献不大。Indinavir：P-GP的底物，剂量高达 800mg，肠内浓度超过 1 mmol/L,远远大于Km 140 mol/L，p-GP的作用对贡献不大。仍然有好的生物利用度C.一些药物如环孢素（200700mg）、紫杉醇（100200 mg），尽管剂量很高，由于这些药物的溶解度和释放度低，肠内的浓度低于Km值，但P-GP对吸收的影响仍然很大。D.某些药物吸收程度随剂量增加而增加如(S)-()-talinolol计量校正的AUC 由 12.5 mg 剂量的18 g.h/l 增加到 200 mg 剂量的36g.h/l。4)肠中P-GP也是机体重要保护机制之一，免受各种肠中毒素的侵害。如Mdr1a缺陷小鼠产生一种大肠炎症，类似人类的肠内部炎。正常情况下，肠中的P-GP 阻止毒素进入肠壁内.复杂性和注意问题:抑制胃肠道上P-GP功能,必然降低屏障功能,增加毒物(素)进入体内!肠不同部位P-GP的表达不同.图6.人肠中不同部位P-gp和villin IOD ratio比值平均和变异.1/2代表十二指肠/近端空肠，3/4,5/6,和7/8 分别代表中段至远端空肠，近端回肠支远端回肠。3)胎盘 屏障 P-GP 存在于胎盘合胞体滋养层顶侧面膜。类似于血脑屏障，防止有毒物质从母体进入胎儿。在P-GP缺陷或基因敲除动物，avermectin,地高辛,saquinavir和紫杉醇通透性增加1020倍。对于多数治疗药物而言，在胎盘上的低通透性当然是需要的，但在有些情况下，成为治疗上的障碍。如对于HIV治疗，希望在婴儿出生前，有一个合适的“负荷剂量”，降低在出生过程中母-婴HIV感染的频率乳腺癌耐药蛋白(BCRP)1.乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein,BCRP,ABCG2）。BCRP 只有一个NBF 和TM域，为半ABC 载体。BCRP mRNA 最早发现于胎盘中。BCRP 首先是从乳腺癌细胞中分离得到的，称之为乳腺癌耐药蛋白。第一次在耐阿霉素的MCF7乳腺癌细胞株(MCF-7/AdrVp)中克隆到BCRP。鼠类命名为Bcrp1BCRP 是细胞株对丝裂霉素、阿霉素和柔红霉素抗癌药物等产生耐药的主要原因。BCRP主要在细胞膜上，存在于细胞的顶侧面上.2.BCRP/Bcrp1 介导的耐药 BCRP 的底物与P-GP,MRP1和MRP2的底物间有较大的重叠性 细胞株对丝裂霉素,拓朴替康,9-氨基喜树碱,柔红霉素,SN-38,flavopiridol,吲哚咔唑,拓朴酶抑制剂(NB-506 和 J-107088),细胞染料如罗丹明123,Lysotracker绿,BBR3390以及荧光素-BODIPY-prazosin.对长春新碱,紫杉醇和顺铂等抗癌药无耐药性不同药物诱导表达的结果往往存在差异。某些药物诱导表达BCRP细胞株对蒽醌类有很高的耐药性,而另一些药物诱导BCRP表达的细胞株,相对丝裂霉素而言，则对蒽醌类几乎没有耐药性。有些诱导表达BCRP细胞株对拓朴替康的耐药性相当高,但另一些诱导表达BCRP细胞株的耐药很低存在两种突变株：野生型 482 位上的氨基酸为Arg两种突变型:Thr和Gly。不同的BCRP对底物的作用不同。野生型与突变型比较 野生型 突变型482 位A Arg Thr或Gly底物叶酸及其衍生物 +-罗丹明123 -+LysoTracker 绿 -+柔红霉素 -+丝裂霉素 +bodipy-prazosin +Hoechst 33342 +抑制剂新生霉素 +-3.BCRP/Bcrp1 抑制剂（1）GF120918;P-GP 抑制剂，也是有效的BCRP/Bcrp1 抑制剂;抑制药物外排泵BCRP和P-GP（2）fumitremorgin C(FTC),是有效的BCRP-抑制剂,但在体有神经毒性，其中两种类似物Ko132和 Ko134)活性比FTC大，Ko134 细胞毒性很低，在体可以用很高剂量,可以显著增加小鼠口服拓扑替康的生物利用度。（3）某些HIV 蛋白酶抑制剂强效的BCRP抑制剂.z在表达野生型BCRP的HEK细胞株中，ritonavir,saquinavir 和nelfinavir 是有效地抑制 BCRP介导的丝裂霉素转运，其IC50 分别为19.5,19.5 和 12.5 mol/l。（4）植物酚类化合物：5,7-二羟黄酮(Chrysin)和biochanin A，silymarin,橙皮素（hesperetin）,栎精（quercetin）,黄豆苷（daidzein）,stilbene resveratrol。（5）香豆霉素抗生素：新生霉素（6）酪氨酸激酶抑制剂：STI-571(imatinib mesylate),ZD1839(Iressa;gefitinib)和 N-4-(3-溴苯)胺-6-喹唑啉-2-丁胺(EKI-785)4.BCRP/Bcrp1 组织分布 在人的胎盘中，BCRP mRNA 表达非常高，而在鼠类胎盘相对弱。相反，在小鼠的肾脏表达最高，而在人的肾脏表达低表达。BCRP 在胎盘合胞体滋养层膜的母体侧、在肝细胞的胆管侧、肠的腔面侧膜，与MDR1 P-GP的定位相似。BCRP 也存在与乳腺的小叶和排泄管的顶侧面。BCRP 高表达于鼠原始造血干细胞中。分化的造血干细胞系中，几乎不表达，但前红细胞和自然杀伤淋巴细胞可以表达Bcrp1。在人中，BCRP表达与鼠相类似，在干细胞中有较高的表达，而在起源细胞表达降低，只有在自然杀伤细胞和成红血球细胞表达，而在其他分化的细胞中没有表达 BCRP 在脑血管内皮细胞高度表达,表达量高于MDR和MRP1.3.BCRP/Bcrp1药理生理作用 1）BCRP分布与P-GP有重叠性 提示BCRP/Bcrp1 的作用类似P-GP。2）保护机制 阻止从胃肠吸收毒物吸收,促进排泄脱镁叶绿(甲酯-)酸 A（PHA）是叶绿素一种降解产物，为一种光毒性成分。PHA在体内外排转运是BCRP介导的，为ABCG2的特异性底物。一项研究显示Bcrp1/小鼠对的PHA光毒敏感性是的野生鼠100 倍以上，在敏感性增加的同时，伴随随高的血药浓度。与正常食物比较，喂养含PHA 或含20%紫花苜蓿食物后，血药浓度分别增加17和24倍，而野生鼠喂养任何食物，血浆中PHA浓度都在检测浓度以下.3）血脑屏障的重要组成部分之一。与野生型鼠比较,mdr1a缺陷小鼠和野生型小鼠,长春碱脑摄取增加2倍,但哌唑嗪摄取不变不影响,丝裂霉素的摄取反而有所降低。合用GF120918使哌唑嗪和丝裂霉素转运增加2.1和3倍,但GF120918不影响长春碱的转运。在野生型鼠，PSC833增加长春碱的脑摄取,但不影响和丝裂霉素的摄取。合用GF120918使哌唑嗪和丝裂霉素摄取分别增加1.5和2倍,GF120918也使长春碱的摄取增加。abcg2 mRNA 主要在脑微血管中表达，约是皮层的700 倍。（4）在骨髓细胞的“傍细胞群”（side population，SP）中作用。从骨髓中分离到一类细胞，这类细胞用Hoechst 33342染色，结合双波长荧光显示浅红色和浅蓝色荧光，用维拉帕米预处理，浅着色细胞消失。这类细胞称之为傍细胞群。？浅着色提示细胞内Hoechst 33342浓度低，研究显示在SP细胞中表有BCRP/Bcrp1，促进Hoechst 33342外排所致.SP中富含未分化的干细胞，而在分化的干细胞系中BCRP/Bcrp1表达低或缺乏。类似SP也出现在骨骼肌和胚胎等其他组织干细胞,伴随Bcrp1 的高表达.BCRP/Bcrp1高表达可能是各种干细胞的一般特性.功能？ABCG2 基因缺陷引起骨髓中和骨骼肌中SP细胞数降低，用转染BCRP（-/-）骨髓细胞移植小鼠内导致细胞再注入（repopulation）能力降低，造血细胞对丝裂霉素敏感性增加,与正常小鼠比较，Mdr1a/1b 和 Bcrp1缺陷小鼠研究的各种造血功能正常，在SP几乎消失.血祖先细胞对丝列霉素的敏感性增加。用 Bcrp+/+和Bcrp-/-小鼠祖先细胞研究显示，在正常氧功能条件下，两种细胞的克隆数相同，但缺氧条件下，Bcrp-/-小鼠祖先细胞的克隆数下降。阻断BCRP功能显著降低Bcrp+/+在缺氧条件下的生存力。ABCG2 mNRA 在造血干细胞（SP,34+/38-.34+/KDD+细胞群）中表达高，而在定向分化的祖细胞（34+/33+,34+/10+）中表达显著下降。在大多数成熟细胞中,表达低,但在自然杀伤细胞和成红血球细胞表达高。ABCG2可能对造血干细胞中SP形成起重要的贡献。在定向分化阶段，ABCG2 下调，暗示该基因可能在多能干细胞方面有独特的生理功能.P-GP,MRP1和 MRP 2 的协同转运1.协同转运 许多ABC载体能同时转运多种不同底物，可能存在协同转运，增加转运效率。MRP1转运长春新碱和依托甙需要还原型GSH参与。GSH 促进 MRP1依赖性的依托甙或长春新碱转运，长春新碱和依托甙也刺激MRP1-依赖性的GSH.用转染的MRP2的Sf9细胞膜囊摄取试验显示不同物质对MRP2转运雌二醇-17-葡萄糖醛酸甙作用不同，4种类型：1)刺激摄取 sulfanitran,pantoprazole,奥米拉唑,laneoprazole,丙磺舒、squinavir,醋氨酚-葡萄糖醛酸甙,青霉素 G;2）低浓度刺激转运，高浓度刺激作用降低 利尿磺胺，苯磺唑酮，吲哚美辛，glibenclamide,牛磺胆酸和甘胆酸；3）抑制摄取 GSSG,GS-DNP 4)无影响 MTX和 GSH。P-GP 介导的转运有类似的现象。P-GP 有两个不同的正相协同的结合点和转运点。一个倾向于模型底物Hoechst 33342，另一个倾向于罗丹明 123。一些化合物(不是所有的)根据他们的刺激罗丹明 123 转运和抑制Hoechst转运能力大小归为Hoechst(“H”)类或罗丹明(“R”)类。BQ102 促进P-GP 转运柔红霉素和阿霉素,这种促进可以被维拉帕米抑制。对不同的底物作用不同,由于BQ102 促进物质转运,降低细胞对某些底物的毒性。图图 维拉帕米抑制QB102促进细胞外排罗丹明123作用.(a)维拉帕米对抗QB102-介导细胞内罗丹明123浓度降低.(b)罗丹明123 消失曲线QB102 对细胞对不同P-GP 底物的敏感性的影响.KB8-5-11细胞在有10mol/l 或没有QB102存在情况下,与受试药物工培养3天,测定IC50.结果为IC50变化情况意义化合物间交叉刺激或抑制有时是很复杂的,药物转运刺激程度有时相当大。当刺激剂同时服用时,由于促进药物转运，可能会改变相应药物的药理作用，尤其是药物在肠上皮、血脑屏障、胎盘屏障上的转运。因此研究是否存在交叉激活现象很有意义，一方面肠中MRP2、P-GP的转运激活，可能导致药物的口服利用度降低，从而降低疗效，另一方面促进有毒物质的排泄。