延伸阅读-1.doc

附全文翻译希望能得到指证互动蛋白质组学研究技术：最新应用和进展Julia Petschnigg, Jamie Snider and Igor Stagljar蛋白质很少单独发挥其功能。一般情况下，它在多功能蛋白质复合体中发挥作用，这种多功能蛋白质复合体在所有生物功能中起核心作用。因此，在全球范围内进行蛋白质 - 蛋白质相互作用（即所谓的作用组）的研究已成为现代分子生物学至关重要的部分，这并不奇怪。多个合作伙伴进行蛋白质复合物的分析可以深入了解他们的分子功能及疾病的相关机制，从而更好的进行药物的靶标定位。现如今，揭示蛋白质相互作用的方法有多种，近日，在运用这些工具生成大型互动数据集方面取得了重大进展。在这里，我们对互动蛋白质组学研究技术的最新进展和应用进行简要的介绍。介绍蛋白质是所有细胞的重要组成部分，蛋白质间的相互作用对大部分细胞功能来说是至关重要的。像基因转导、细胞周期控制、信号转导和调节等基本过程均有赖于蛋白质复合物功能的正常发挥。在后基因组时代一个具有里程碑意义的事件就是有效的运用积累的基因组数据。因此，绘制蛋白质间相互作用（PPIs）的地图的技术已经成为蛋白质分析的重要技术，这些技术可剖析其功能。【1、2】。复合物中蛋白质组织和结构的改变常导致细胞功能障碍并最终导致疾病。因此，在研究疾病的病理生理学及定义新药靶位方面对蛋白质间相互作用彻底的研究显得尤为重要。【3】如今，应用于PPIs高通量研究的改进技术已经产生大范围PPI网络的几个模式有机体的子代。一般来说，分析PPIs的方法有两种：基因方法和生化方法。【1】生化方法（如共同免疫沉淀和亲和纯化），通过直接与蛋白质相互作用以确定复合物的组成来探究蛋白质相互作用组。而基因方法依据相互作用受体间的重建直接确定PPIs。在这些基因方法中，经典的酵母双杂交（Y2H）系统已经成为评估个体PPIs和全球蛋白质地图中应用最为广泛的方法，已经应用于人类相互作用组的研究。【4】到目前为止，许多Y2H的衍生方法和其他技术已经出现，其中大部分旨在 改进通量并且能在自然条件下研究PPIs。本文将对这些Ppi技术的新进发展做以综述，并对这些方法在生物医学研究中的近期重要应用进行总结。我们主要关注基因方法，因为大量以光谱学为基础的生物化学方法将另行讨论。蛋白质片段互补法（PCA）在PCA中，将两种目的蛋白与报告因子（如荧光蛋白或酶）的互补片段融合。如果通过蛋白质间相互作用变得接近，这些片段就能够正确折叠和组装，进而重建报告因子活力。值得注意的是该方法成功的关键是报告因子片段不能自发折叠，除非通过交互作用变得接近。由于该法可以使用使用各种不同的报告分子,它被看作是检测PPIs的“一般”方法。【5，6】蛋白质可以作为报告因子的有 -内酰胺酶，TEV蛋白酶，二氢叶酸还原酶（DHFR） ，荧光素酶和荧光蛋白（如GFP） （双分子荧光优势互补， BiFC ） ，等等 6。PCA方法可以用在低通量和高吞吐量模式中，在任何类型的细胞中，无论是在体外或在体内，允许在他们的自然背景下和适当的亚细胞室中检测PPIs5,6。图1 a和b所示为PCA示意图。Tarassov等人最近的一个重要研究阐释了PCA的应用。他们绘制了酵母酿酒酵母在体内蛋白质相互作用图谱。在该研究中，作者运用了一个选择性生存PCA法，该法基于小鼠二氢叶酸还原酶报告因子，该因子包含一个点突变，使其拥有氨甲蝶呤抗性但拥有其他正常的催化活性。在含有抑制剂甲氨蝶呤媒介上生长的细胞阻止内源性DHFR酶的表达活性，是发生了交互作用的细胞选择性生长，从而重组耐药转导酶的变体。最终形成一个由1124种蛋白质包含2770种交互作用的高品质相互作用组图谱，这对其他研究中PPI信息的形成是一个很好的补充。【7】的另一个有趣的研究中，Wehr等人建立了一个PCA方法，该法用于分析活体哺乳动物中依赖快速化的作用，这常在信号转导同路中发挥关键作用，使他们成为有力的药物靶位。一种基于分割TEV报告因子系统的PCA，该法用于研究胞液和膜结合蛋白，TEV蛋白酶的重组导致荧光蛋白或荧光素酶的蛋白水解激活或转录因子的蛋白水解激活。科研人员研究了Bad蛋白质和各种14-3-3亚型之间以及膜结合ErbB4的蛋白质和各种接头蛋白间依赖磷酸化的相互作用。在适当的磷酸化条件下，这种高效可靠的方法能够灵敏的检测到相互作用，这表明了在检测瞬态和依赖修饰的交互作用时特定的PCA变体有效。在药物筛选和细胞生物学研究中，该研究的相应方法应该也适用于HTP模式。【8】针对各种不同目的，最近开发了其他的研究方法，包括在体外环境【9】化学库筛选或在嗜热生物体内PPI筛选。【10】尽管警告由于到重整的PCA蛋白的稳定性互动运动学和动力学受到损害，但是因其广泛的适用性和灵活性，再加上不断发展的新方法和报告系统，确保该系统将继续成为蛋白质组学研究的重要工具。膜酵母双杂交系统(MYTH)膜酵母双杂交方法是一有效方法，是传统酵母双杂交法的PCA相关变体。与传统酵母双杂交法不同的是，MYTH不需要在核中发生交互作用，因此，允许在他们细胞膜的自然文脉中应用全长膜蛋白。【11.12】MYTH系统是基于分裂泛素“的原则，通过观察发现高度保守的蛋白质泛素可以分裂为两个稳定的部分，一个氮末端（Nub）片段和一个炭末端片段（Cub）, 能够自发重构成一个完整长度的“伪-泛素分子。氮末端片段（NubG）突变减弱Cub/Nub结合亲和力，并允许部分调整为PPIs的感受器【13】。在MYTH中，在细胞胞浆中膜诱饵蛋白与一个连接到炭端的人工转录因子相融合。科研人员将可溶的或膜结合的猎物蛋白质与氮端片段融合。诱饵蛋白和猎物蛋白的交互作用将NubG和Cub紧密连接，让伪泛素形成，然后用去泛素酶识别，该酶可切割炭端，从而释放转录因子，导致报告基因表达。图1c为MYTH的示意图。进来Deribe等人用MYTH对人类表皮生长因子受体（ EGFR）有了更为深入的了解。【14】EGFR是 ErbB受体酪氨酸激酶家族成员，在细胞生长和分化的功能中扮演着重要的角色。包括细胞质赖氨酸去乙酰化酶HDAC6在内的87表皮生长因子受体已经检测完成。对于HDAC6的后续工作是制出关键交互界面图，并为HDAC6在一般受体因子稳定性和转运中起重要角色提供证据，揭示蛋白乙酰化在受体内吞和降解作用的调节中的新进展。【14】在最近的另一研究中，McGee等人用MYTH法辨别出了功能相关的蛋白质，这种蛋白质较小且其保守区域序列发散，用生物信息学的方法难以检测。该项研究检测到一种新的蛋白Caenorhabditis elegansKASH【15】。KASH蛋白和SUN蛋白共同作用形成复合物，该复合物包括和膜、中介传播和核内位电子转移组件。将C. elegans核膜SUN蛋白UNC-84作为饵，KDP-1被检测为新的KASH蛋白。随后的MYTH分析显示KDP-1和其他已知的SUN蛋白SUN-1也发生交互作用。最终作者得出：KDP-1在整个发展过程中的多个阶段均有重要作用。【15】MYTH系统也应用于像G蛋白偶联受体（GPCR）这样较大的多通道的膜蛋白中。最近的研究工作为调查-阿片受体（ MORS）及连接阿片受体激动剂（如吗啡）改变神经元功能的分子机制。Jin等人用全长GPCR为饵筛选了人类MOR的新的交互作用蛋白。假定的孤儿G蛋白偶联受体GPR177被确定为一个相互作用因子16。这项研究首次成功采用全长人类GPCR为饵进行MYTH筛选，并阐释了GPR177作为交互作用蛋白的作用，该蛋白参与阿片受体激动剂的细胞调节反应。【16】总的来说，这些研究清楚地表明MYTH系统可以成功应用于高吞吐量和低吞吐量模式中，以确定各种生物体中完整膜的相关作用因子和有明显不同功能、结构和亚细胞定位的膜相关蛋白。然而，其缺点在于，某些生物体缺乏相关因子或蛋白修饰，其蛋白质在酵母的周围环境中不会发生交互作用。然而，在现有的蛋白质组学技术中MYTH占据独一无二的地位，并且在以后研究膜蛋白的相互作用中仍是非常宝贵的技术。共振能量转移技术（ RET）系统RET用于实时监测交互作用，因此，能应用于体内动力学过程的研究。【17、18】经典的技术是基于荧光RET或生物发光RET蛋白的RET检测.RET的原则是在兴奋的捐献者和受者蛋白间无辐射能量转移的情况下进行空间关系的研究。在FRET中经典的捐赠者和受者蛋白是绿色荧光蛋白GFP的蓝绿色（CFP）和 黄色（YFP）变种。BRET与FRET相似，但不需要外部光源来激发捐者。取而代之的是，他依赖于花虫荧光素酶（而非CEP），该酶可产生与YEP激发光相容的激光。【18】图1d为RET原则的示意图。FRET和BRET法广泛应用于G蛋白偶联受体激活过程中研究G蛋白偶联受体齐聚反应。19,20.代表着哺乳动物基因最大家族，他们是细胞信号转导过程中的重要组分，约有30%的个体化药物靶向作用于GPCRs【21】，研究这些受体是非常有意思的。最近，BRET和FRET已融合产生一个新技术，叫sequential BRET-FRET(SRET)，可以识别由三种不同蛋白质的物理作用形成的异聚体。【22，23】在SRER中，由荧光素酶伴侣融合蛋白触发受体介导的荧光素酶氧化，及由BRET介导的第二融合蛋白的激发和随后FRET介导的第三蛋白激发。用SRET, Carriba等人咋活细胞中确证了异三聚体亚基G蛋白和配合物的大麻素CB1 ，多巴胺D2和腺苷A2A受体。【22】另一基于RET的方法为时间分辨FRET(TR-FRET),该法可减弱经典FRET法经常出现的由于使用一个长寿命发光的荧光团（铕穴）而出现的漂泊效应。【19】TR-FRET已广泛应用于活细胞表面GPCR低聚体的研究，TR-FRET法结合了HTP法和SNAP标签法。【24】在此，DNA修复蛋白（ O6-烷基鸟嘌呤- DNAalkyltransferase ）和O6-烷基鸟嘌呤衍生物发生了一个不可逆的反应，这可用各种化学荧光团选择性标记。在该项研究中，Maurel等人研究了细胞表面GPCRs的低聚装配，结果表明，而代谢型谷氨酸受体被组装作为严格的二聚体， -氨基丁酸受体B型（ GABAB ）受体，也可以形成高次低聚物。另一基于荧光的方法为荧光漂白后恢复（FRAP）法，该法用于研究活细胞中跨膜受体的寡聚化。【25】受体由抗体固定，监控未固定受体的横向流动。这些研究显示beta1肾上腺素能受体建立瞬态交互作用，beta2肾上腺素能受体来自稳定低聚物。由RET法和BIFC法演变而来的一组新方法已用于三聚体和四聚体蛋白质符合物的研究，如所示的腺苷A2A低聚物或AP-1 NF- kB的三元复合物及异源三聚体G蛋白的阶低聚物26,27。基于RET方法的主要优点在于他能在体内进行实时检测并维持生理环境。然而，RET类方法的缺点是只能用于中等通量的筛选而不能广泛应用于HTP的扩展和筛选。LUMIER （基于发光的哺乳动物相互作用组定位）尽管HTP技术很少应用于哺乳动物细胞，但是LUMIER是一种适用于96孔格式的自动化的方法。图1e这一方法的原理。LUMIER最初用于TGF-b相互作用组制图，将TGF-b途径关键成分与花虫荧光素酶融合，用518FLAG标记共免沉淀蛋白文库猎物蛋白，后检测荧光素酶活性。【28】检测的相互作用组显示和其他信号转导网络的新连接，如激活的p21基因蛋白激酶途径，闭合蛋白，一个紧密连接的结构组件。近来，LUMIER应用于新的WNT /-catenin的途径组件的识别。在信号转导通路中Wnt起关键作用，其改变常与疾病和癌症的发生有关。添加640子集使细胞内的信号成分变得丰富，则可识别负的Wnt信号的调节因子Ube2m和Nkd1【29】。在一项相关研究中，控制细胞增值和凋亡的Hippo途径和发现的Wnt信号有联系，能确证TAZ为Wnt/b-catenin信号的调节因子。Wnt信号的激活导致过度磷酸化紊乱（DVL）,最终导致beta-catenin靶基因的激活，TAZ和DVL的相互作用抑制磷酸化进而抑制Wnt基因/-catenin的信号。【30】作为四个综合方法中的一种，LUMIER一直用于HTP数据的正交验证，给Y2H数据一个置信度得分。【31】但应该注意的是LUMIER中蛋白质是过度表达的，这可能对弱的或瞬态相互作用有影响，但会使这种方法易于发生假阳性。一般来说，LUMIER是研究正常条件下哺乳动物PPIs强效的自动化、HTP模式方法，在以后研究哺乳动物信号转导通路中定会有可观的价值。哺乳动物的蛋白质 - 蛋白质相互作用管道（MAPPIT）及其衍生技术哺乳动物的蛋白质 - 蛋白质相互作用管道中PPIS发生于完整哺乳动物细胞的胞质中。由于分析读出位点（核）和相互作用位点（胞质）在空间上是分开的，这一系统还有另一控制机制，即与其配体依赖项结合。该系统基于I型细胞因子信号转导通路；通过与配体结合，I型细胞因子受体亚单位丛集，导致反式的磷酸化和Janus激酶(JAKs)活化。接着JAKS将受体末端的酪氨酸残基磷酸化，导致STATs(信号转导与转录激活因子)的激活.然后STATs二聚化、固定到核上并启动靶基因转录。【32】在MAPPIT中，胞质受体区域的点突变导致受体难以接近STATs，而仍可激活JAK。因此，将饵蛋白与这一信号缺失细胞因子受体（EpoR 或 leptin 受体）融合，部分糖蛋白gp130上的猎物蛋白包含功能性的recruitment位点。通过饵蛋白和猎物蛋白的相互作用，发生受体的功能性互补作用，导致STAT对接及转录激活。图1f为MAPPIT原理图。到目前为止，MAPPIT一直成功应用于HIV反转录酶的二聚化【33】和HIV-1辅助蛋白Vif1与宿主限制因子Apobec3G【34】相结合的研究，这表明MAPPIT或许可作为新的方法筛选人类完整细胞中抗-HIV复合物。MAPPIT易于广泛应用并一直用于cDNA文库的筛选、识别含蛋白（CIS）的SH-2和促红细胞生成素受体和瘦素受体的伴侣细胞因子信号2蛋白（SOCS-2）的抑制因子。【35】近来MAPPIT也用于验证大规模的筛查方案的质量。【31】为提高吞吐量和研究更复杂相互作用，现已将MAPPIT应用于多项领域。一种新的MAPPIT变种方法利用一系列模式：阵列MAPPIT用于猎物蛋白阵列收集的HTP筛选。用这种方法可识别出SKP1和ElonginC新的结合部分。【36】在异数MAPPIT中，包含一种修饰酶，用于检测依赖修饰的交互作用，该法可用于TGF-信号传导中依赖磷酸化的Smad蛋白相互作用【37】MASPIT是哺乳动物的三杂交互动管道，类似于酵母三杂交方法，用于小分子蛋白质交互作用的识别。近期用MASPIT法，识别出几种新的ephrin酪氨酸激酶受体的抑制因子。【38】通过既定PPIS的分裂反MAPPIT生成阳性读出。【39】该饵蛋白与信号转导元件细胞因子受体相融合，而猎物蛋白与磷酸酶结构域相融合，这可是JAKS去磷酸化。只有破坏饵-猎物蛋白相关重组信号，才可筛选出小分子文库组成干扰这些靶标相互作用的复合物。运用这一技术，肿瘤抑制基因P53和MDM2的相互作用可被小分子Nutlin-3干扰，FKBP12 和 ALK的PPI显示被免疫抑制剂FK506抑制。【39】总之，通过不同变种的结合，MAPPIT在药物发现和靶标分析中有重要价值。噬菌体展示技术噬菌体呈现技术是识别和优化多肽片段新功能的强效方法。多肽被呈现在细菌噬菌体的表面，实现多肽与噬菌体外壳蛋白的融合。通过噬菌体的组装，融合基因加入噬菌体颗粒中，编码多肽即可展现在表面上，在表型和基因型间建立一个物理连接。噬菌体库有人工的和自然的现有肽、蛋白质和呈现在噬菌体上的蛋白质变体组成，为创建一个大而多样的猎物蛋白提供了一个简单的方法。图1g描述了这一方法的基本原理。最初由大肠杆菌特异M13噬菌体发展而来，如今这一系统包括一系列其他噬菌体，并且被广泛应用，如抗体制图，识别新PPIS，疫苗设计或有新的特异性抗体的发展等等【40】最近，噬菌体呈现技术已用于改进补体C3受体因子CRIg的疗效。【41】补体系统是抵抗细菌和病毒感染的先天性免疫防御的第一道防线。另一补体途径在各种炎症和自身免疫系统疾病中起重要作用，隐藏针对这些途径的靶向治疗引起人们极大兴趣。CRIg的IgV区域(CRIg-EDC)可结合补体成分C3b抑制补体途径。Li等人旨在建立与C3b拥有高亲和性的CRIgECD，通过将C3b与CRIg的晶型数据融入噬菌体展示途径。他们发现两个位点的突变可将C3b的亲和力提升数倍，在研究中用患关节炎的小鼠模型，用新型的CRIg-ECD突变株治疗后可显著降低临床分数。【41】噬菌体展示技术的另一应用示例是蛋白质中肽结合域的识别。像PDZ/SH3/SH2这类肽识别分子将蛋白质中的motifs与调节PPIS特异性结合。最近，通过噬菌体展示技术筛选方法的应用，检出了结合酵母SH3的特异性肽段。该研究表明个体SH3域用期配体特性可获得结合选择性。在一般情况下，噬菌体展示技术是一个非常强大的多功能的工具，特别适合用于分子间相互作用的快速筛查和优化，这使得他在药物开发中有重要作用。蛋白质微阵列蛋白质微阵列技术是基于对平面或珠的表面显示固定蛋白质的应用【43-45】（见图1h）。他们适用于多样本的同时分析，并且有一系列临床和科研运用价值。蛋白质微列阵技术有许多形式，一般来说，大部分可归结为两个主要类别之一；功能性列阵，用于探测特殊蛋白质活性或同步检测作用于宿主靶位的某种试剂；定量阵列，用于检测特定蛋白质的存在和水平，特别是来源于细胞和组织的。【44】功能性阵列，一般而言由激活纯化的蛋白质点组成，技术上其生产富有挑战性，但拥有广泛的应用前景。最近有一项关于该技术的应用的有趣示例，Kaushansky等人成功的用蛋白质阵列法定位了新ErbB4磷酸化位点。用阵列覆盖人类基因组中大部分SH2和PTB区域，研究人员用一系列新的ErbB4的衍生磷酸化肽段识别出包含DNA结合蛋白STAT1在内的几种新的相互作用因子【46】。定量列阵在特异分子和标志物的识别和研究中非常有效，在翻译后修饰的分析中也有重要作用，使得他们成为临床应用和研究领域（如信令网络）中非常有前景的工具【44，47】这些阵列可用于前进模式，即有抗体和其他良好定义的固定于某一表面的捕获剂，这一点可由裂解液探测到并可用二抗或标记的样本蛋白看到，逆向模式，即用裂解液直接进行蛋白质固定，然后用标记抗体直接分析某种具体的蛋白【44，45，47】。定量列阵已用于多种用途，并且有望在个体化医疗中作为有效诊断工具，医生基于个体化生物标志物的配置文件可为患者提供具体的诊疗方案【45】。例如，Dupuy等人最近描述了一种改进的涉及到酪胺放大的近红外荧光检测法。研究人员在HEK293细胞中使用的卵泡刺激激素引发信号转导级联反应，结果表明，该法有较好的动态范围和高灵敏度，能够在亚attomole范围检测磷酸化的蛋白质。【48】蛋白质芯片为一个功能强大的方法可用于一系列的研究和临床应用。尽管仍需在技术上增加其效用，可访问性和敏感性，他们可用的工具集蛋白质组学技术承诺中占据日益重要的地位结论和观点经过本研究，对PPIS有了一个正确的了解，并对所涉及蛋白质的亚细胞结构有了一定了解进而能进一步了解其功能。到现在为止，大部分HTP交互作用数据均是来源于经典的酵母双杂交法，因为该法有较高的稳定性和实惠性。虽然近来Y2H法一直能提供高品质的而精致交互信息【49】，但该法有其内在的局限性，如他对核交互作用的限制、用酵母作为宿主系统。显然，哺乳动物系统能为酵母为基础的系统提供一些优势，但在技术上这一点很有挑战性，且不能扩展到HTP模式。PCA法 ，基于RET-的方法或MAPPIT等方法可在哺乳动物细胞中操作，可以和质谱方法（ AP-MS ）一起广泛应用于亲和纯化，这常常是PPIS选择HTP常用方法。虽然AP-MS要求比较严格的蛋白复合物生化隔离，但它可以适用于范围广泛的细胞类型，如最近在一个新的AP- MS方法中已获得满病毒猎物库。【50】目前的PPI地图也受到限制，因为它们在很大程度上单维的，因此，未来的工作也必须把重点放在扩大PPI映射到多个方面，如在对特定药物的反应、或那些依赖磷酸化的途经和蛋白质修饰中调查PPIS,为与方法发展上的显著进步相一致，在大型数据集的质量的评价中需作出改进。大型数据集常易出现高的假阳性或假阴性率。虽然现有的计算机方法可对此作出改正，整合像表达谱一样的外部数据集，或使用替代生物信息学方法，可以大大提高PPI网络的可靠性，但是仍有许多工作需要完成51 。PPI网络的验证将越来越需要认证方法的增强和优质参数的整合【52】在PPIS网络的复验中正交技术是一个有应用前景的方法。这有助于识别真正的点击率和消除误报，因为技术间可起到互补作用，克服单项技术的缺点。该法已用于人类和线虫交互作用组高通量Y2H数据的验证。4,53,54.总体而言，新的PPI检测方法的持续发展和更好的验证方法在于提高质量和的HTP数据的可信度。随着蛋白质组学研究的发展，我们将继续以惊人的速度作出新发现和治疗进展以更进一步获得高分辨率，实时了解在细胞内发生的基本过程。