DB15∕T 2112-2021 土壤中土霉素、四环素、金霉素残留量的测定 高效液相色谱法.pdf

ICS 65.100.01 CCS Z18 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 21122021 土壤中土霉素、 四环素、 金霉素残留量的测定 高效液相色谱法 Determination of oxytetracyline，tetracyline and chlortetracyline residuescontent inSoilHPLC method 2021-03-25 发布 2021-04-25 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 21122021 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 本文件由赤峰市农牧科学研究院提出。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。 本文件起草单位：赤峰市农牧科学研究院。 本文件主要起草人：邓宇、文辉、王岩、乌仁图雅、荣迪、李宝栋、王盛男、陈琪、赵剑平、娜日娜、曲颖超、李雯雯、索力墨、红敏、巴图、刘汉宇、张智勇。 DB15/T 21122021 1 土壤中土霉素、四环素、金霉素残留量的测定 高效液相色谱法 1 范围 本文件规定了土壤中土霉素、四环素和金霉素残留量的高效液相色谱检测方法。 本文件适用于土壤中土霉素、四环素和金霉素残留量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 395 农田土壤环境质量监测技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样经Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇溶液提取定容，HLB固相萃取小柱净化，经高效液相色谱仪测定，外标法定量。 5 试剂和材料 5.1 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 中规定的一级水。 5.2 乙腈（C2H3N） ：色谱纯。 5.3 甲醇（CH4O） ：色谱纯。 5.4 磷酸氢二钠（Na2HPO412H20） 。 5.5 乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA2H20） 。 5.6 柠檬酸（C6H807H20） 。 5.7 水合草酸（C2H2O42H20） 。 5.8 磷酸氢二钠溶液（0.4 mol/L） ：称取 143.26 g 磷酸氢二钠，用水溶解，定容至 1000 mL。 5.9 乙二胺四乙酸二钠溶液（0.1 mol/L） ：称取 37.22 g 乙二胺四乙酸二钠，用水溶解，定容至 1000 mL。 DB15/T 21122021 2 5.10 柠檬酸溶液（0.2 mol/L） ：称取 42.03 g 柠檬酸，用水溶解，定容至 1000 mL。 5.11 磷酸氢二钠-柠檬酸（Mcllvaine）缓冲液（pH=6.80.05） ：将 1000 mL 0.4 mol/L 磷酸氢二钠溶液（5.8）与 294 mL 0.2 mol/L 柠檬酸溶液（5.10）混匀。 5.12 Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液：取 Na2EDTA2H20（5.5） 、磷酸氢二钠-柠檬酸（Mcllvaine）缓冲液（5.11）和甲醇按 1+1+2（体积）比例混匀，必要时用 NaOH 溶液或 HCl 溶液调节 pH=7.200.05。 5.13 草酸溶液（0.01 mol/L） ：称取 1.26 g 草酸，用水溶解，定容至 1000 mL。 5.14 甲醇-水（1+19） ：量取 5 mL 甲醇与 95 mL 水混匀。 5.15 草酸-甲醇溶液（0.01 mol/L） ：称取 1.30 g 草酸，用甲醇溶解，定容至 1000 mL。 5.16 土霉素（oxytetracycline）标准物质：纯度大于等于 96.5 %、四环素（tetracycline）标准物质：纯度大于等于 94.2 %、金霉素（chlortetracycline）标准物质：纯度大于等于 99.5 %。 5.17 土霉素、四环素、金霉素标准储备溶液（2.00 mg/mL） ：准确称取一定量的土霉素、四环素、金霉素标准物质（5.16）于 100 mL 容量瓶中，分别用甲醇溶解定容，于 0 4 保存,存储期 1 个月。 5.18 土霉素、四环素、金霉素混合标准溶液（100 g/mL） ：分别取 5 mL 土霉素、四环素、金霉素标准储备液（5.17）至 100 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，储存于冰箱 0 4 保存,存储期1 个月。 5.19 土霉素、四环素、金霉素混合标准溶液使用液（20g/mL） ：吸取土霉素、四环素、金霉素混合标准溶液（5.18）10 mL 至 50 mL 容量瓶中，用 Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液（5.12）稀释至刻度，混匀，储存于冰箱 0 4 保存,存储期 1 个月。 5.20 固相萃取柱（N-乙烯基吡咯烷酮和二乙烯苯的共聚体-HLB 或相当者） ：60 mg/3 mL。使用前依次使用 5 mL 甲醇及 5 mL 水预处理，保持柱体湿润。 5.21 针式过滤头：0.22m（有机相） 。 6 仪器和设备 6.1 超高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器。 6.2 天平：感量 0.01 g，0.00001 g。 6.3 低温冷冻离心机：转速大于 3500 r/min。 6.4 恒温水浴振荡器：振荡频次不小于 300 r/min。 6.5 氮吹仪。 6.6 固相萃取装置。 6.7 真空泵。 6.8 pH 计：测量精度0.02。 6.9 容量瓶：玻璃，10 mL，50 mL，100 mL，1000 mL。 DB15/T 21122021 3 6.10 具塞离心管：50 mL。 6.11 移液枪：量程 20L，100L，1000L。 6.12 漩涡混匀仪：振荡频率不小于 2800 r/min。 6.13 样品筛：0.5 mm。 7 分析步骤 7.1 样品采集 土壤样品采集按照NY/T 395的规定执行。 7.2 样品制备 土壤样品采集后去除杂质，在室温条件下自然风干，粉碎，全部通过0.5 mm样品筛（6.13），密封保存。 7.3 提取 称取过筛样品1 g2 g（精确至0.01 g）于50mL具塞离心管中，加入20 mL Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液（5.12），室温振荡20 min（6.4），于 3500 r/min离心10 min，取上清液至另一离心管中。残渣中再依次加入20 mL、10 mL Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液（5.12），重复提取两次，合并上清液并定容至50 mL。 7.4 净化 移取上清液5 mL于具塞离心管中，置于氮吹仪上，40 浓缩至原体积的一半左右，加适量水稀释至体积约5 mL，控制流速以1 mL/min的速度通过已活化处理的HLB固相萃取柱，用5 mL甲醇-水(5.14)淋洗固相萃取柱，弃去全部流出液。真空抽干10 min，用5 mL草酸-甲醇（5.15）洗脱液洗脱，收集洗脱液并在40 氮吹浓缩至近干，用2.00 mLNa2EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液（5.12）涡旋溶解残渣，过0.22m滤膜（5.21）进行测定。 7.5 测定 7.5.1 液相色谱仪参考条件 色谱柱：C18色谱柱，柱长250 mm，内径4.6 mm，粒径5.0 m。 流动相及梯度洗脱条件：见表1。 流速：1.0 mL/min。 检测波长：355 nm。 柱温：30 。 进样量：20L。 DB15/T 21122021 4 表1 流动相及梯度洗脱条件 时间 min 流动相乙腈（5.2） % 流动相0.01 mol/L 草酸(5.13) % 流动相甲醇(5.3) % 022 8 84 8 2223 15 70 15 2332 15 70 15 3233 8 84 8 3335 8 84 8 7.5.2 液相色谱测定 分别移取不同体积20g/mL混合标准溶液使用液 （5.19） 于10 mL容量瓶中， 用Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液 （5.12） 定容至刻度， 逐级稀释配制成0.1g/mL、 1.0g/mL、 2.0g/mL、 5.0g/mL、 10.0g/mL和20.0g/mL的系列标准工作液，进样测定。以色谱峰面积进行外标法定量。标准工作液及试样液中土霉素、四环素、金霉素的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。试样浓度不在线性范围内时将样品稀释后进样。标准品液相色谱图参见附录A。 7.5.3 空白试验 除不加样品外，其余均按照上述测定步骤进行。 7.5.4 定性分析 在仪器最佳工作条件下， 按照液相色谱条件测定样品溶液和标准溶液， 如果样品溶液中某组分保留时间与标准溶液的某一组分保留时间相差在0.5 %以内，可认定相同组分。 8 结果计算 样品中被测组分的含量Xi，数值用毫克每千克（mg/kg）表示，按式（1）计算，保留2位有效数字： = V 1000 1000(1) 式中： Xi样品中被测组分含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； Ci从工作曲线得到的被测组分溶液浓度的数值，单位为微克每毫升（g/mL）； f稀释倍数； V样品的稀释液定容体积，单位为毫升（mL）； m样品称样量，单位为克（g） 。 9 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10 %。 DB15/T 21122021 5 10 检出限、定量限和回收率 10.1 本方法的检出限：土霉素 0.54 mg/kg，四环素 0.66 mg/kg，金霉素 0.84 mg/kg。 10.2 本方法的定量限：土霉素 1.61 mg/kg，四环素 1.99 mg/kg，金霉素 2.51 mg/kg。 10.3 土霉素回收率：71.66 %93.93 %，相对标准偏差（RSD） ：0.31 %4.73 %；四环素回收率：77.20 %97.33 %，相对标准偏差（RSD） ：0.47 %4.68 %；金霉素回收率：72.04 %96.92 %，相对标准偏差（RSD） ：0.64 %4.98 %。 DB15/T 21122021 6 附录A （资料性） 土霉素、四环素、金霉素标准物质色谱 土霉素、四环素、金霉素标准物质色谱图见图A.1 注1：土霉素保留时间：17.240 min。 注2：四环素保留时间：21.071 min。 注3：金霉素保留时间：31.356 min。 图A.1 土霉素、四环素、金霉素标准物质色谱图