微生物限度检查法.doc

中国药品检验标准操作规程2010版-微生物限度检查法

一、细菌、霉菌和酵母菌计数
１ 简述
细菌、霉菌和酵母菌计数是检测非规定灭菌制剂及原、辅料受微生物污染程度的方法。也是用于评价生产企业药用原料、辅料、设备、器具、工艺流程、环境和操作者的卫生状况的重要手段和依据。
细菌、霉菌和酵母菌计数均采用平板菌落计数法，这是活菌计数的方法之一，也是目前国际上许多国家常用的一种方法。以在琼脂平板上的细菌、霉菌和酵母菌形成一个独立可见的菌落为计数依据。该法测**果只反映在该规定条件下所生长的细菌（为一群嗜中温、需氧和兼性厌氧菌）、霉菌和酵母菌的菌落数。不包括对营养、氧气、温度、pH和其他因素有特殊要求的细菌、霉菌和酵母菌。
一个细菌、霉菌和酵母菌的菌落均可由一个或多个菌细胞生长繁殖而成。因此供试品中所测得的菌落数，实际为菌落形成单位数（colony forming unity，cfu），不应理解为细菌、霉菌、酵母菌个数。
2 设备、仪器
2.1 设备
2.1.1 洁净实验室
微生物限度检查应有单独的洁净实验室，每个洁净实验室应有独立的净化空气系统。
2.1.1.1 结构和要求
洁净实验室应采光良好、避免潮湿、远离厕所及污染区。操作间与缓冲间之间应有样品传递舱，出入操作间和缓冲间的门不应直对。洁净实验室内应六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墙壁与地面、天花板连接处应呈凹弧形，无缝隙，不留死角。操作间内不应安装下水道。
洁净实验室内的照明灯应嵌装在天花板内，室内光照应分布均匀，光照度不低于300LX。
2.1.1.2 温度、湿度 洁净实验室内的温度应控制在18～26℃，相对湿度最好在40％～60％。
2.1.1.3 操作间
操作间应安装空气除菌过滤层流装置。洁净度不应低于10000级，局部洁净度为100级（或放置同等级净化工作台）。操作间或净化工作台的洁净空气应保持对环境形成正压，不低于10Pa，操作间与缓冲间也应保持相对正压，不低于5Pa。操作台上备有药物天平，乙醇灯，火柴，乙醇棉球，大、小橡皮乳头等。
2.1.1.4 缓冲间 缓冲间内应有洗手盆和无菌衣、帽、口罩、鞋套等。
2.1.1.5 洁净级别及检查方法
通常采用尘粒数及浮游菌数或沉降菌数测定法（参照《医药工业洁净室》（区）悬浮粒子、浮游菌、和沉降菌的测试方法》的现行国家标准）进行洁净度验证。
不同洁净级别的微粒、浮游菌和沉降菌标准见下表1。
表l –不同洁净级别的微粒、浮游菌和沉降菌标准

洁净级别

尘埃数＜＜m3

浮游菌（个）＜＜m3

沉降菌（个）＜＜
（Ф90mm？0.5h）

微粒直径≥0.5μm

微粒直径≥5μm

100级

≤3,500

≤0

≤5

≤1

10000级

≤350,000

≤2000

≤100

≤3

100000级

3,500,000

≤20,000

≤500

≤10

沉降菌数测定（Ⅱ法）
洁净实验室操作台消毒擦拭处理后，先启动层流净化装置30min，将备妥的营养琼脂平板3个（经30～35℃预培养48h，证明无菌落生长）。以无菌方式（或经传递箱）移人操作间，置净化台左、中、右各1个，开盖，暴露30min后将盖盖上。在30～35℃培养箱内倒置培养48h，取出检查。3个平板生长的平均菌落数不超过1个。
有条件的单位，同时应检查洁净操作间和净化工作台上的浮游菌和微粒数。
操作问和净化工作台要定期检测其洁净度，分别应达到10000级和100级。如菌落数或微粒数超标，应清洗过滤系统中的过滤设施，必要时予以更换。
2.1.1.6 在每次操作前、后用0.1％苯扎溴铵溶液或其他适宜消毒液擦拭操作台及可能污染的死角，然后启动层流净化装置。
2.1.2 阳性菌实验室
涉及实验室监控菌株的分离鉴定、样品阳性菌株的分离分析、方法验证试验中的阳性菌操作等实验活动，应在专门的阳性菌实验室进行。除另有规定外，阳性菌实验室应符合国家Ⅱ级生物安全标准，阳性菌实验室应配备生物安全柜。阳性菌操作不得在供试品检验用洁净实验室内进行。
2.1.3 洁净实验室、阳性菌实验室与洗刷、灭菌、消毒、培养及结果观察的工作间等设施应相对集中，布局合理，避免污染，便于管理。
2.2 仪器
2.2.1 恒温培养箱（30～35℃）、生化培养箱（23～28℃）、微波炉、匀浆仪（3000～8000
r／min）或康氏振荡器、恒温水浴、电热干燥箱（100～300℃）、电冰箱、离心机、离心管、微孔滤膜及薄膜过滤器、蒸汽灭菌器（使用时要进行灭菌效果检查并应定期请有关部门检定）。
菌落计数器、显微镜（40×～1500×）、电子天平或药物天平（感量0.1g），pH计。
2.2.2 玻璃器皿
锥形瓶（250～300ml、500ml内装玻璃珠若干）、培养皿（9cm）、量筒（100ml，500m1）、试管（18mm×180mm）及塞、吸管（1m1分度0.0l，10m1分度0.1）、注射器（20ml或30m1）、涂布棒、注射针头、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）、不锈钢桶（带盖）。玻璃器皿用前应洗涤干净，吸管、量筒不挂水滴，无残留抗菌物质。吸管口上端距0.5cm处塞入约2cm的适宜疏松棉花，置吸管筒内或牛皮纸袋中。锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞，以免振荡时供试液污染瓶塞，再用牛皮纸包扎。玻璃器皿，均于160℃干热灭菌2h或高压蒸汽121℃灭菌30min，烘干备用。
2.2.3 用具
大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用70％～75％乙醇溶液浸泡）。无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。
接种环（白铱金或镍铬合金，环径4～5mm、长度6～10cm）、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、灭菌剪刀或灭菌手术刀和灭菌镊子、灭菌钢锥、灭菌称样纸、不锈钢药匙、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆、陶瓦盖（12cm）、实验记录纸等。
3 试液、稀释剂和试剂
3.1试液
3.1.1 0.1％苯扎溴铵溶液或其他适宜消毒液（供洗手、擦拭操作台面用）。
3.1.2 5％石碳酸溶液（配好后装入玻璃消毒缸内，供消毒带菌吸管用）亦可选用其他适宜消毒液。
3.1.3 75％乙醇溶液。
3.1.4 碘酊或碘伏溶液。
3.2 稀释剂和试剂
稀释剂配制后，采用高压蒸汽灭菌法灭菌。
3.2.1 0.9％无菌氯化钠溶液（附件二3.1）。
3.2.2 pH7.0无菌氯化钠?蛋白胨缓冲液（附件二3.5）。
3.2.3 无菌聚山梨酯80氯化钠?蛋白胨缓冲液（附件二3.4）。

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