LAMP技术及应用.ppt

LAMP技术及应用LAMPLAMP技术简介技术简介 环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是由日本研究人员发明的一种新型的体外等温扩增特异核酸片段的技术。该技术可以在等温条件下（约65）进行核酸扩增反应，克服了传统PCR反应需要通过反复的热变性过程获得单链模板的缺点，从而实现在恒温条件下进行连续快速的核酸扩增，并且可以通过简易直观的目测判读结果，相比传统PCR大大节省了时间和实验操作步骤。LAMP法和其他PCR法的比较LAMP法和其他PCR法的比较技术特点特异性高4条引物靶向目标基因6个区段，特异性高于PCR和qPCR灵敏度高扩增模板可低至每测试10拷贝或更少。检测时间短恒温扩增，省却温度循环，扩增时间60min。设备简易，可同时检测多批样本不需特定或高端检测仪器，恒温设备即可，例如水浴锅，可以随时放入后续批次样本。LAMP法使用的酶链置换型链置换型DNADNA聚合酶聚合酶:Bst DNA Polymerase:Bst DNA Polymerase扩增对象为双链扩增对象为双链DNADNA时，其中一条链解离的同时进行链延长。时，其中一条链解离的同时进行链延长。LAMPLAMP法使用最适温度法使用最适温度6565的聚合酶。的聚合酶。LAMP法的引物设计LAMP法的原理LAMP法的原理LAMP法所需的试剂LAMP法常规操作步骤LAMP法的检测方法琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法 由由LAMPLAMP原理可知，原理可知，LAMPLAMP反应的最终扩增产物是茎环反应的最终扩增产物是茎环DNADNA组组成的混合物，即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。成的混合物，即有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。因此，因此，LAMPLAMP扩增产物在扩增产物在2 2的琼脂糖凝胶糖上呈现的是典型的梯的琼脂糖凝胶糖上呈现的是典型的梯状条带。（图状条带。（图A A）肉眼观察法肉眼观察法 在在LAMPLAMP反应过程中，可以通过产生的副产物焦磷酸镁白色反应过程中，可以通过产生的副产物焦磷酸镁白色沉淀的产生来肉眼直接判断扩增反应是否进行。（图沉淀的产生来肉眼直接判断扩增反应是否进行。（图B B）通过荧光染料检测通过荧光染料检测 有时，通过肉眼观察白色沉淀来检测会存在一定的误差，所有时，通过肉眼观察白色沉淀来检测会存在一定的误差，所以也可通过添加荧光染料，如溴化乙锭以也可通过添加荧光染料，如溴化乙锭(EB)(EB)、SYBR GreenISYBR GreenI等进行等进行染色，来检测扩增是否发生。（图染色，来检测扩增是否发生。（图C C）LAMP法的应用领域 食品领域食物中毒致病菌的检测食品的卫生管理食物中毒的防止灵活运用LAMP法能够简单、快速地进行基因扩增的特征，LAMP技术在各个领域都得到广泛的应用。临床领域病原菌、病毒的检测 及鉴定 农业领域植物病害的早期发现 及蔓延防止转基因作物的检测 环境领域环境、水中病原微生物 的检测 工业领域工业产品用大量 DNA的生产成为可能 畜牧业领域雌雄性别判断病原微生物的检测遗传病的发现LAMP法在结核菌检测中的应用靶标限定:结核分枝杆菌复合群临床上感染人类的是结核分枝杆菌复合群，包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌、卡氏分枝杆菌。对检测对象的准确限定能避免假阳性过高而增加治疗成本，长远来说，更有利于避免耐药性的产生。gyrB基因作为结核分枝杆菌重要的功能基因，在复合群进化过程中非常保守，LAMP法检测即以gyrB基因作为靶标。LAMP法在结核菌检测中的应用适宜的检测对象以临床上引起结核感染的结核分枝杆菌复合群为检测对象，可避免假阳性过高。反应管预装反应体系扩增及检测在全封闭反应管中进行，有效降低气溶胶污染；用户操作简便、减少操作误差。结果易读产物和显色液直接显色即可肉眼判断结果。技术特点：LAMP法在结核菌检测中的应用临床试验 LAMP法和对照试剂（BD快速培养）对比结果灵敏度89.54%阳性结果预期值98.13%特异性98.93%阴性结果预期值93.77%总符合率95.31%LAMP法在结核菌检测中的应用临床试验 LAMP法和对照试剂（TB-qPCR）对比结果阳性一致率=88.56%阴性一致率=93.06%总符合率=91.36%LAMP法在结核菌检测中的应用现有结核诊断方法和环介导恒温扩增法比较一点建议实验室严格PCR分区 溶液配制区、样品处理区、检测区基本操作 混匀、吸取 模板最后加入，按照先阴性、后阳性，从低到高梯度环境污染 UV照射 DNAZAP等DNA降解试剂谢 谢!