DNA重组技术的基本工具(讲课).ppt

选修3生态工程生态工程生物技术的安全性生物技术的安全性和伦理问题和伦理问题胚胎工程胚胎工程细胞工程细胞工程基因工程基因工程现代生物科技现代生物科技专题专题你还记得我们吗？你还记得我们吗？氢键氢键 磷酸二酯键磷酸二酯键 DNA聚合酶聚合酶 限制性内切酶限制性内切酶 DNA连接酶连接酶 运载体运载体专题专题1.基因工程基因工程的基本内容的基本内容基因工程的概念1.1基因工程的基本工具1.2基因工程的基本操作程序基因工程的发展史1.3基因工程的应用1.4蛋白质工程的崛起基因工程的概念：基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过行严格的设计，并通过体外体外DNA重组重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在因工程是在DNA分子水平上分子水平上进行设计进行设计和施工的，因此和施工的，因此又叫做又叫做DNA重组技术重组技术或基因拼接技术。或基因拼接技术。别名：别名：操作环境：操作环境：原理：原理：操作水平：操作水平：结果：结果：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因重组DNA分子水平定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的品种。基因工程的产物这就要用到这就要用到定向改造生物定向改造生物的新技术的新技术基因工程基因工程基因工程的概念基因工程的发展史（自学了解）（自学了解）普通棉花普通棉花抗虫棉抗虫棉基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花(无抗虫基因)苏云金芽孢杆菌提取提取抗虫基因与运载体与运载体DNADNA拼接拼接导入导入棉花细胞(含抗虫基因)转基因棉花植株上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？“分子手术刀分子手术刀”限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶关键步骤一：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：关键步骤二：抗虫基因与棉花抗虫基因与棉花DNA“DNA“缝合缝合”关键步骤三：关键步骤三：抗虫基因进入棉花细胞抗虫基因进入棉花细胞“分子缝合针分子缝合针”DNADNA连接酶连接酶“分子运输车分子运输车”运载体运载体1、简称：简称：2、分布：、分布：一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶“分子手术刀分子手术刀”主要在原核生物中限制酶寻根问底(P4)你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是是什么吗？原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNADNA的入侵的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶限制酶就是细菌的一种就是细菌的一种防御防御性工具性工具，当外源，当外源DNADNA侵入时，会利用限制酶侵入时，会利用限制酶将外源将外源DNADNA切割切割掉，以保证自身的掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源切割外源DNADNA、使之失效使之失效，从而达，从而达到到保护自身保护自身的目的的目的。限制酶在原核生物中的作用思考与探究 P72 2、为什么限制酶不剪切细菌本身的、为什么限制酶不剪切细菌本身的DNADNA？通过长期的进化，含有某种限制酶的细胞，其通过长期的进化，含有某种限制酶的细胞，其DNADNA分子中或者分子中或者不具备不具备这种限制酶的这种限制酶的识别切割序列识别切割序列，或者通过甲基化酶，或者通过甲基化酶将甲基转移将甲基转移到所到所识别序列识别序列的碱基上，使的碱基上，使限制酶不能将其切开限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的不会使自身的DNADNA被切断，并且可以防止外源被切断，并且可以防止外源DNADNA的入侵。的入侵。以中轴线双侧的以中轴线双侧的DNA上碱基呈反向对称，重复排列上碱基呈反向对称，重复排列如：如：GAATTCCCCGGGCTTAAGGGGCCC限制酶所识别的序列有什么特点EcoR（在G与A之间切割）Sma（在G与C之间切割）Hind（在A与A之间切割）GAATTCCTTAAGCCCGGGGGGCCCAAGCTTTTCGAA中轴线（专一性）限制酶的识别特点限制酶的识别特点3、特点、特点:识别特定核苷酸列,切割特定切点（专一性）4.切点：磷酸二酯键EcoR黏性末端黏性末端GobackGoback 什么叫黏性末端？什么叫黏性末端？被限制酶切开的被限制酶切开的DNADNA两条单链的切口，带有几个两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸伸出的核苷酸，它们，它们之间正好之间正好互补配对互补配对，这样的切口叫，这样的切口叫黏性末端黏性末端。Sma平末端平末端平末端平末端4、结果：、结果：产生黏性未端和平末端以中轴线双侧的以中轴线双侧的DNA上碱基呈上碱基呈反向对称重复排列反向对称重复排列如：如：GAATTCCCCGGGCTTAAGGGGCCC限制酶所识别的序列有什么特点3、特点:4、结果：1、简称：2、分布：一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶主要在原核生物中限制酶识别特定核苷酸列,切割特定切点（专一性）产生黏性未端或平末端笔记 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性(平平)末端？末端？要切两个切口，产生四个黏性要切两个切口，产生四个黏性(平平)末端。末端。如果把两种来源不同的如果把两种来源不同的DNADNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生会产生相同的黏性相同的黏性(平平)末端末端，然后让两者的黏性，然后让两者的黏性(平平)末端末端黏合黏合起来，就似起来，就似乎可以合成重组的乎可以合成重组的DNADNA分子了。分子了。思考?GobackGobackGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGGAATTCGAATTCCTTAAGCTTAAGEcoREcoRG GAATTCAATTCCTTAACTTAAG GG GAATTCAATTCCTTAACTTAAG G不同来源的不同来源的DNADNA片段混合片段混合将不同种来源的将不同种来源的DNADNA片段片段连连接起来接起来生物生物A A基因片段基因片段生物生物B B基因片段基因片段G GAATTCAATTCCTTAACTTAAG GG GAATTCAATTCCTTAACTTAAG G酶酶切切1 1、作用、作用:把把DNADNA片段片段拼接成新的拼接成新的DNADNA，2 2、作用原理：、作用原理：催化磷酸二酯键形成,（不是氢键）二、DNA连接酶“分子缝合针”可把黏性末端之间的可把黏性末端之间的缝隙缝隙“缝合缝合”起来，起来，即即恢复被限制恢复被限制酶酶切开的两个核苷酸之切开的两个核苷酸之间间的磷酸二的磷酸二酯键酯键T T4 4DNADNA连接酶连接酶3、类型：类型EcoliEcoliDNADNA连接连接酶酶T T4 4DNADNA连接酶连接酶来源来源功能功能大肠杆菌大肠杆菌T T4 4噬菌体噬菌体只能连接只能连接黏性末端黏性末端能连接能连接黏性末端黏性末端和和平末端平末端DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶用途用途寻根问底(P6)DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶是一回事吗聚合酶是一回事吗?为什么为什么?将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键作用对象DNA复制基因重租基因重租4、DNADNA连接酶与连接酶与DNADNA聚合酶比较聚合酶比较3、类型类型EcoliDNA 连接酶来源：大肠杆菌作用特点：只连接黏性末端T4DNA 连接酶来源：T4噬菌体作用特点：连接黏性末端和平末端2、作用原理：、作用原理：催化磷酸二酯键形成1 1、作用、作用:：二、DNA连接酶把把DNADNA片段片段拼接成新的拼接成新的DNADNA，笔记 1、载体必须具备的条件：能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；具有一至多个限制酶切点，以便与 外源基因连接具有某些标记基因，便于进行筛选。对受体细胞无害 三、基因进入受体细胞的载体 “分子运输车”2、常用的载体：质粒，噬菌体的衍生物，动植物病毒等能能复制复制并带着并带着插入的目的基插入的目的基因一起复制因一起复制有有切割位点切割位点有有标记基因标记基因3、质粒本质：小型本质：小型环状DNA分子。分布：许多细菌、分布：许多细菌、酵母菌等生物酵母菌等生物三、运载体三、运载体1、质粒：2 2、需要的条件、需要的条件：有1多个限制酶切点能在受体细胞中自我复制，或整合到受体细胞的 染色体DNA上复制有某些标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。对受体细胞无害3 3、常用运载体、常用运载体：质粒、噬菌体的衍生物噬菌体的衍生物或某些动植物病毒 笔记1、在基因工程中，切割运载体和、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的含有目的基因的DNA片段，需使片段，需使用（用（）A.同种限制酶同种限制酶B.两种限制酶两种限制酶C.同种连接酶同种连接酶D.两种连接酶两种连接酶反馈练习：2 2、不属于质粒被选为基因运载体的理由是、不属于质粒被选为基因运载体的理由是AA、能复制、能复制（）BB、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 CC、具有标记基因、具有标记基因DD、它是环状、它是环状DNADNAD3、下列不适合用于基因工程的运载体是（）A、质粒 B、噬菌体 C、细菌 D、病毒选我C4、下列说法正确的是：（）A、限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、重组技术所用的工具酶是限制酶、连接酶、运载体D、利用运载体在宿主细胞内对目的基因进行大量复制的过程可称为“克隆”选我D审题2和7能连接形成ACGTTGCA；4和8能连接形成GAATTCCTTAAG；3和6能连接形成GCGCCGCG；1和5能连接形成CTGCAGGACGTC。教材P7思考与探究11)基因转移载体的发现2)工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明技术发明命使基因工程的实施成为可能1967年罗思和赫林斯基发现细菌质粒有自我复制能力,为基因转移找到一种运载工具.1970年阿尔伯(W.Arber)、内森斯(D,Nathans)、史密斯(H.C.Smith)细菌中发现了第一个限制酶1977年科学家又发明了DNA序列分析方法1965年桑格发明了氨基酸序列分析技术4)DNA体外重组的实现体外重组的实现1972年伯格(P.Berg)首先在体外进行了DNA改造的研究,成功地构建了第一个人工体外重组DNA分子.1973年博耶和科恩使重组DNA转入大肠杆菌中,转录出相应的mRNA,并使外源基因可以在原核细胞中成功表达,至此表明基因工程正式问世.1973年科学家才将质粒作为基因的载体使用这是基因工程发展史上第一个成功的基因克隆实验1973年科恩第一个建成“基因工程菌”，并创立基因工程模式1973年称这“基因工程元年”，科恩被称为基因工程发展史上的创始人科恩并向美国申报了世界上第一个基因工程的专利技术5)重组DNA表达实验的成功1980年第一个转基因小鼠问世1982年采用显微注射技术培养目出”超级小鼠”1983年培育出第一例转基因烟草1988年穆里斯发明了PCR技术,使基因工程技术得到了进一步的发展和完善.获1993年诺贝尔化学奖1993年中国农业科学院的科学成功之路地培育出抗棉铃虫的转基因抗虫棉6)第一例转基因动物问世7)PCR技术的发明