WNT信号通路.ppt

Wnt/-catenin信号信号转导途径转导途径Wnt信号通路信号通路 人类人类Wnt基因家族由基因家族由1919个成员组成，编码具有个成员组成，编码具有2222或或2424个半胱氨酸残基个半胱氨酸残基的保守糖蛋白。的保守糖蛋白。WntWnt信号转导途径可以分为决定细胞命运的经典途径和控制细胞运动信号转导途径可以分为决定细胞命运的经典途径和控制细胞运动及组织极性的非经典途径。及组织极性的非经典途径。Wnt途径的发现途径的发现 Wnt基因于基因于1982年发现，最初是作为小鼠乳腺年发现，最初是作为小鼠乳腺肿瘤病毒优先整合的位点而被鉴定的，该基因能在肿瘤病毒优先整合的位点而被鉴定的，该基因能在细胞间传递增殖和分化信息，是一种癌基因，当时细胞间传递增殖和分化信息，是一种癌基因，当时被命名为被命名为Int基因基因(小鼠小鼠Int-1和和Int-3)。随后发现它与。随后发现它与果蝇的无翅基因果蝇的无翅基因(wingless)属直相同源基因属直相同源基因(orthologous gene)，从而将二者结合命名为从而将二者结合命名为Wnt基基因。随着研究的不断深入人们发现因。随着研究的不断深入人们发现Wnt基因家族非基因家族非常庞大，为多基因家族，其基因结构从低等的无脊常庞大，为多基因家族，其基因结构从低等的无脊椎动物到脊椎动物乃至人类具有高度保守性，其同椎动物到脊椎动物乃至人类具有高度保守性，其同源序列达源序列达27-83%，对动物的生长发育起着至关重要对动物的生长发育起着至关重要的作用。的作用。Wnt基因编码的基因编码的WNT蛋白，可启动细胞内蛋白，可启动细胞内信号传导途径，传导生长刺激信号，参与不同的发信号传导途径，传导生长刺激信号，参与不同的发育机制，如细胞分化，移行，以及决定细胞命运的育机制，如细胞分化，移行，以及决定细胞命运的增殖等。因其启动蛋白为增殖等。因其启动蛋白为WNT蛋白，故命名为蛋白，故命名为Wnt信号途径。信号途径。1996年，年，Wnt途径的主要成员被相继确定和克隆。途径的主要成员被相继确定和克隆。研究发现，这一信号途径主要包括三个环节，即由研究发现，这一信号途径主要包括三个环节，即由Wnt配体与胞膜受体的特异性结合，引发胞内一系配体与胞膜受体的特异性结合，引发胞内一系列级联反应，进而调节核内的基因表达。传统的信列级联反应，进而调节核内的基因表达。传统的信号途径系统观点认为，信号是从细胞表面到细胞核号途径系统观点认为，信号是从细胞表面到细胞核的线性传递。的线性传递。Wnt信号途径的起点为胞膜，由分泌信号途径的起点为胞膜，由分泌性信号蛋白性信号蛋白Wnt，通过跨膜的受体蛋白，经由多种通过跨膜的受体蛋白，经由多种细胞内蛋白将信号传至细胞核内。这点上看，它是细胞内蛋白将信号传至细胞核内。这点上看，它是一种与传统观点相一致的信号途径系统。然而许多一种与传统观点相一致的信号途径系统。然而许多研究发现，研究发现，Wnt途径和其他细胞功能、信号传递过途径和其他细胞功能、信号传递过程相互交叉，不是直线型的结构，而是一个网络调程相互交叉，不是直线型的结构，而是一个网络调节模式，具有几个关键调控点。节模式，具有几个关键调控点。Wnt途径总的框架途径总的框架1.Wnt/-cantenin途径，即典型的途径，即典型的Wnt/-cantenin信号信号途径途径(canonical Wnt/-cantenin pathway)。该途径该途径通过通过-cantenin的核易位，激活靶基因的转录活性。的核易位，激活靶基因的转录活性。2.2.平面的细胞极性途径平面的细胞极性途径(planar cell polarity pathway)，涉及涉及RhoA和和Jun N端激酶以及细胞骨架的重排。端激酶以及细胞骨架的重排。目前还没有实验资料证明该途径参与肿瘤的发展。目前还没有实验资料证明该途径参与肿瘤的发展。3.Wnt/ca2+途径，由途径，由Wnt5a和和Wnt11激活，增加胞内激活，增加胞内Ca2+含量，激活蛋白酶含量，激活蛋白酶C、磷脂酶磷脂酶C和转录因子和转录因子NF-AT。Wnt/Ca2+途径可以和典型的途径可以和典型的Wnt/-cantenin信号途径相互作用，但是该途径在肿瘤发信号途径相互作用，但是该途径在肿瘤发生中是否起作用尚不清楚。生中是否起作用尚不清楚。Wnt信号途径 Wnt途径的组成和实现途径的组成和实现 研究研究Wnt途径的组成，主要运用基因和分子生物学相结合的手段加以途径的组成，主要运用基因和分子生物学相结合的手段加以分析与认定，分析与认定，Wnt途径候选分子的确定标准为：该分子失去功能显性，途径候选分子的确定标准为：该分子失去功能显性，则则Wnt信号途径的功能即消失，而该分子获得功能时，信号途径的功能即消失，而该分子获得功能时，Wnt信号途径也信号途径也同时具有功能。经过十多年的研究，目前认为同时具有功能。经过十多年的研究，目前认为Wnt途径的主要组成为：途径的主要组成为：Wnt信号蛋白，胞膜受体信号蛋白，胞膜受体FZD家族，胞浆内家族，胞浆内-catenin、Dsh、APC、GSK3等等蛋白分子蛋白分子,细胞核内细胞核内LEF/TCF转录因子家族等。转录因子家族等。胞内信号传递胞内信号传递 Wnt信号进入胞内后，将信号传递给信号进入胞内后，将信号传递给Dishevelled(Dsh)，活化的，活化的Dsh抑制由抑制由Axin、APC (adenomatous polyposis coli)和和GSK-3(serin/threonine glycogen synthasekinase 3)组成的复合物的活性组成的复合物的活性,使使-catenin不能被不能被GSK-3磷酸化。磷酸化的磷酸化。磷酸化的-catenin才可通过遍在蛋白化才可通过遍在蛋白化(ubiquitination)而被胞浆内的而被胞浆内的蛋白酶体所降解，由于非磷酸化的蛋白酶体所降解，由于非磷酸化的-catenin不能被不能被蛋白酶体降解，从而导致蛋白酶体降解，从而导致-catenin在胞浆内积聚，在胞浆内积聚，并移向核内。当游离的并移向核内。当游离的-catenin进入细胞核内，即进入细胞核内，即可与转录因子可与转录因子TCF/LEF(T-cellfactor/Lymphoid enhancer factor)结合，激活结合，激活TCFTCF转录活性，调节靶转录活性，调节靶基因的表达。因此基因的表达。因此,-catenin是否磷酸化是该信号是否磷酸化是该信号传递的关键因素。传递的关键因素。靶基因 目前已经研究鉴定出多种目前已经研究鉴定出多种Wnt途径的靶基因，它途径的靶基因，它们在细胞增殖、分化以及肿瘤形成中起重要作用。们在细胞增殖、分化以及肿瘤形成中起重要作用。主要包括：细胞周期和凋亡相关基因主要包括：细胞周期和凋亡相关基因c-myc和和cyclinD1,生长因子如生长因子如VEGF(vascular endothelial growth factor),胃泌素胃泌素(gastrin)、HGF(hepatocyte growth factor)、c-met等。参与肿瘤进展的基因等。参与肿瘤进展的基因MMP7(matrilysin)、MMP26、CD44和和Nr-CAM,转转录因子录因子ITF-2(immunoglobulin transcription factor-2)和和Id2,其他靶基因如其他靶基因如COX-2等等.由于这些因子在细由于这些因子在细胞增殖、分化以及肿瘤发生发展中分别体现不同的胞增殖、分化以及肿瘤发生发展中分别体现不同的特点，因此特点，因此Wnt信号传递是一种由多因子组成、涉信号传递是一种由多因子组成、涉及多个环节、多种调控的复杂过程。及多个环节、多种调控的复杂过程。在正常生长的成熟机体中，细胞的生长、增殖和分化等具有一定的规在正常生长的成熟机体中，细胞的生长、增殖和分化等具有一定的规律性和有序性。有限生长的细胞在没有律性和有序性。有限生长的细胞在没有Wnt信号时，信号时，Wnt通路呈关闭状通路呈关闭状态。但当态。但当Wnt途径激活时，就可能导致许多细胞出现灾难性的变化，使途径激活时，就可能导致许多细胞出现灾难性的变化，使细胞发生异常的增生和分化，导致肿瘤形成。细胞发生异常的增生和分化，导致肿瘤形成。Wnt途径异常激活主要见于：途径异常激活主要见于：1 1）组成）组成Wnt途径的蛋白、转录因子或基因被破坏或变异，导致该途径关闭途径的蛋白、转录因子或基因被破坏或变异，导致该途径关闭或局部途径异常活跃；或局部途径异常活跃；2 2）过多）过多Wnt信号使整个途径异常活跃，细胞进行不必要的增殖；信号使整个途径异常活跃，细胞进行不必要的增殖；3 3）细胞内其他因素通过）细胞内其他因素通过Wnt途径来刺激或诱发细胞产生异常反应。途径来刺激或诱发细胞产生异常反应。在在Wnt途径中途径中,-catenin-TCF/LEF复合体无疑是复合体无疑是Wnt途径的枢纽。如途径的枢纽。如前所述，前所述，Wnt途径激活是以途径激活是以-catenin定位变化定位变化-易位为基础，一旦易位为基础，一旦-catenin易位于细胞核内，与易位于细胞核内，与TCF/LEF结合，即可启动结合，即可启动Wnt途径。因此，途径。因此，Wnt途径的调控可分为两部分：上游各组分结构和功能变化导致途径的调控可分为两部分：上游各组分结构和功能变化导致-catenin降解障碍，引起降解障碍，引起-catenin胞浆内积聚；核内胞浆内积聚；核内-catenin激活激活TCF/LEF引起下游靶基因转录，通过推动细胞周期发展或产生异常蛋白，引起下游靶基因转录，通过推动细胞周期发展或产生异常蛋白，使细胞发生癌变。使细胞发生癌变。-catenin是第一个被确定为是第一个被确定为Wnt途径的成员。在途径的成员。在细胞内细胞内,-catenin具有二个定位池：一个是位于细具有二个定位池：一个是位于细胞膜胞膜,与与E-cadherin和和-catenin形成粘附复合体，参形成粘附复合体，参与细胞黏附；另一个则在胞浆。与细胞黏附；另一个则在胞浆。-catenin基因定位基因定位于于3p21，由，由16个外显子组成，其中外显子个外显子组成，其中外显子3的第的第37，33，41，45位密码子编码区域构成位密码子编码区域构成-catenin蛋白蛋白的的NH2末端，是末端，是GSK3的结合部位，也是致癌活化的结合部位，也是致癌活化的位点，该区域的定向突变或缺失可导致的位点，该区域的定向突变或缺失可导致-catenin活性过高，致使活性过高，致使GSK3对对-catenin降解受阻，降解受阻，-catenin在胞浆内积聚。在胞浆内积聚。Clements对对311例胃癌标本例胃癌标本进行进行-catenin的检测，发现的检测，发现29%病例存在病例存在-catenin核内易位，核内易位，19%存在存在3号外显子突变。号外显子突变。研究发现，许多肿瘤中存在着不同程度的研究发现，许多肿瘤中存在着不同程度的-catenin基因突变。如结直肠基因突变。如结直肠癌、肝细胞癌、甲状腺癌、卵巢癌和皮肤癌癌、肝细胞癌、甲状腺癌、卵巢癌和皮肤癌,-catenin突变率可达突变率可达50以上，前列腺癌、子宫内膜癌和以上，前列腺癌、子宫内膜癌和Wilms瘤等为瘤等为15左右，胃癌为左右，胃癌为26。突变位点多集中在外显子突变位点多集中在外显子3区域，特别是区域，特别是GSK3的结合部位。的结合部位。-catenin的的定位改变，除了受其本身基因突变的影响外，定位改变，除了受其本身基因突变的影响外，Wnt途径上游各组分形态途径上游各组分形态和功能的变化也可影响和功能的变化也可影响-catenin的状态。主要包括的状态。主要包括Wnt,APC,GSK-3和和Axin。APC(adenomatous polyposis coli)是一种与结肠癌是一种与结肠癌发生有关的抑癌基因。定位于发生有关的抑癌基因。定位于5q21，长度长度10.4kb，编码一组较大的多结构域蛋白，属于胞浆蛋白，具编码一组较大的多结构域蛋白，属于胞浆蛋白，具有支架蛋白的作用。有支架蛋白的作用。APC蛋白、蛋白、Axin和和GSK3,可与可与-catenin形成复合物，而促进形成复合物，而促进-catenin发生磷酸化，发生磷酸化，使使-catenin得以被蛋白酶降解。在固有的和散在的得以被蛋白酶降解。在固有的和散在的大多数结直肠肿瘤中，均已发现有大多数结直肠肿瘤中，均已发现有APC基因的突变基因的突变或缺失。或缺失。APC基因突变可发生于任何外显子，其中基因突变可发生于任何外显子，其中以第以第15外显子外显子（654-2843密码子）最为常见密码子）最为常见2000，1020-1169密码子和密码子和1323-2075密码子编密码子编码区域被认为是码区域被认为是-catenin与与APC的结合位点，该区的结合位点，该区域突变即导致域突变即导致-catenin不能与不能与APC结合，进而不能结合，进而不能被被GSK3磷酸化，以致磷酸化，以致-catenin降解受阻而积聚于降解受阻而积聚于胞浆。因而胞浆。因而APC是是Wnt途径的负调控因子。在其他途径的负调控因子。在其他癌症如髓母细胞瘤，侵袭性纤维瘤病，乳腺癌等也癌症如髓母细胞瘤，侵袭性纤维瘤病，乳腺癌等也可见可见APC异常。异常。Axin具有多个蛋白具有多个蛋白-蛋白作用域，与蛋白作用域，与APCAPC一样起支一样起支架蛋白的作用，是支架蛋白复合体的构建基础。架蛋白的作用，是支架蛋白复合体的构建基础。Axin的的RGS功能域功能域(regulators of G protein signaling domain)，能与全长的能与全长的APCAPC结合，但不能与截短的无结合，但不能与截短的无活性活性APC结合。结合。APC-Axin-GSK-catenin形成复合形成复合物时，物时，GSK靠近靠近-catenin而促使其磷酸化，因此也而促使其磷酸化，因此也是是Wnt途径的负调控因子。在肝癌、结直肠癌、乳途径的负调控因子。在肝癌、结直肠癌、乳腺癌等肿瘤中检测到腺癌等肿瘤中检测到Axin基因突变，目前基因突变，目前Axin被认被认为是抑癌分子，其基因突变可促进肿瘤的发生。为是抑癌分子，其基因突变可促进肿瘤的发生。GSK(serin/threonine glycogen synthase kinase 3)可使可使-catenin磷酸化，磷酸化，磷酸化位点为磷酸化位点为-catenin的的4 4个个N N端位点端位点（s33,s37,T4,s45），），这些磷酸氨基这些磷酸氨基作为作为-catenin磷酸化的一种标志，表明它将被蛋白酶体通过水解而降解。磷酸化的一种标志，表明它将被蛋白酶体通过水解而降解。GSK3是是Wnt途径的负调控因子，同时也是候选抑癌分子。在途径的负调控因子，同时也是候选抑癌分子。在Wnt信号通信号通路发生异常时是否存在路发生异常时是否存在GSK3的突变问题尚少探讨，但已有在结肠癌中没的突变问题尚少探讨，但已有在结肠癌中没有检测到有检测到GSK3突变的报道，突变的报道，GSK3是否具有其他功能，以及可能在其他是否具有其他功能，以及可能在其他途径中发挥重要的作用还有待研究。途径中发挥重要的作用还有待研究。DSH(Dishevelled)是是Wnt途径正调控因子，其途径正调控因子，其N端的端的DIX域，可结合域，可结合Axin，中央区的中央区的PDZPDZ域，为蛋白域，为蛋白-蛋白相互作用的位点，可结合多种蛋白蛋白相互作用的位点，可结合多种蛋白质，如质，如CKI-,CBP/Frat,酪蛋白激酶酪蛋白激酶等，而其等，而其C端端DEP域则具有调节细域则具有调节细胞的极性及移动的作用。胞的极性及移动的作用。Wnt分泌蛋白及其受体分泌蛋白及其受体FZD在肿瘤中也可出现在肿瘤中也可出现异常表达。在结肠癌、胃癌中，可见异常表达。在结肠癌、胃癌中，可见Wnt2、Wnt5A、FZD1/2表达明显高于正常粘膜组织。但表达明显高于正常粘膜组织。但Wnt基因的基因的突变和错义表达与人类肿瘤的直接联系迄今尚待阐突变和错义表达与人类肿瘤的直接联系迄今尚待阐明。明。To等对等对12例胃癌标本（例胃癌标本（7 7例为肠型，例为肠型，4 4例弥散型，例弥散型，1例混合型）检测例混合型）检测Wnt受体受体FzE3及其相关蛋白及其相关蛋白hsFRP的变化情况，研究发现，的变化情况，研究发现，75病例存在病例存在FzE3表达上表达上调，同时也观察到调，同时也观察到-catenin，hsFRP和和cyclinD异常异常表达。在胃癌细胞株的研究中发现，表达。在胃癌细胞株的研究中发现，FZD2，FZD5，FZD7，FZD8，FZD9在不同的细胞株异常表达；在不同的细胞株异常表达；Wnt家族的多个成员在另外一些细胞株也检测出有家族的多个成员在另外一些细胞株也检测出有的情况高表达。的情况高表达。TCF是是Wnt途径下游组分，属于途径下游组分，属于DNA结合蛋白，包括结合蛋白，包括1个个HMG盒子盒子(highmobility group)和和-catenin作用域。作用域。HMG盒子具有与盒子具有与DNADNA结合的活结合的活性，通过与其它因子发生作用，而激活转录活性。有趣的是，性，通过与其它因子发生作用，而激活转录活性。有趣的是，TCF转录转录因子家族的不同成员具有不同的特性。尽管它们都可结合因子家族的不同成员具有不同的特性。尽管它们都可结合DNA，但在大，但在大部分情况下并不能激活转录，只有与部分情况下并不能激活转录，只有与-catenin发生作用后，才可激活转发生作用后，才可激活转录过程。有报道在结直肠癌中，检测出录过程。有报道在结直肠癌中，检测出Tcf-4突变，且同时存在突变，且同时存在APC或或-catenin的突变，推测的突变，推测Tcf-4突变可能是附加突变。突变可能是附加突变。Wnt途径激活与肿瘤细胞的侵袭和转移途径激活与肿瘤细胞的侵袭和转移 癌细胞最为重要的生物学特征是具有侵袭和转癌细胞最为重要的生物学特征是具有侵袭和转移的能力，这是造成恶性肿瘤患者预后不佳和导致移的能力，这是造成恶性肿瘤患者预后不佳和导致死亡的主要原因。癌细胞的侵袭和转移包括以下几死亡的主要原因。癌细胞的侵袭和转移包括以下几个过程：癌细胞粘附性改变，从原发灶脱落，突破个过程：癌细胞粘附性改变，从原发灶脱落，突破基底膜，与细胞外基质作用，侵入周围基质和邻近基底膜，与细胞外基质作用，侵入周围基质和邻近组织，然后侵入淋巴管或血管，随血流或淋巴，在组织，然后侵入淋巴管或血管，随血流或淋巴，在远部器官或组织建立新的癌细胞集落。在此过程中，远部器官或组织建立新的癌细胞集落。在此过程中，涉及到细胞粘附性的改变，细胞外基质的降解，细涉及到细胞粘附性的改变，细胞外基质的降解，细胞增殖的改变及肿瘤血管形成等。随着对胞增殖的改变及肿瘤血管形成等。随着对Wnt途径途径研究的深入，发现研究的深入，发现Wnt途径异常激活后，其靶基因途径异常激活后，其靶基因中有些是与癌细胞的侵袭转移相关的基因，因而推中有些是与癌细胞的侵袭转移相关的基因，因而推测测Wnt途径也可参与肿瘤的侵袭和转移。途径也可参与肿瘤的侵袭和转移。细胞间粘附的破坏可促进癌细胞的迁移和浸润，细胞间粘附的破坏可促进癌细胞的迁移和浸润，导致侵袭和转移。导致侵袭和转移。-catenin在细胞中起着双重作用：在细胞中起着双重作用：除了参与除了参与Wnt信号转导外，还与信号转导外，还与E-cadherin形成复合形成复合物定位于细胞膜，维持细胞间的粘附。在结肠癌研物定位于细胞膜，维持细胞间的粘附。在结肠癌研究中发现，在肿瘤侵袭前缘，癌细胞膜上究中发现，在肿瘤侵袭前缘，癌细胞膜上E-E-cadherin表达基本消失，然而胞核内可观察到表达基本消失，然而胞核内可观察到-catenin表达。因而表达。因而Wnt途径可能影响途径可能影响E-cadherin的的表达，利于癌细胞的侵袭。表达，利于癌细胞的侵袭。APCAPC的突变也可通过激活的突变也可通过激活Asef，降低降低E-cadherin介导的细胞间的粘附。靶基因介导的细胞间的粘附。靶基因Nr-CAM为免疫球蛋白类粘附分子，参与细胞间的为免疫球蛋白类粘附分子，参与细胞间的连接，可转化成纤维细胞，肿瘤的侵袭和转移与该连接，可转化成纤维细胞，肿瘤的侵袭和转移与该靶基因活动性增加亦密切相关。靶基因活动性增加亦密切相关。CD44基因编码合成的基因编码合成的CD44属于细胞粘附分子，属于细胞粘附分子，主要参与细胞主要参与细胞-细胞、细胞细胞、细胞-基质之间的特异性粘连基质之间的特异性粘连过程，影响细胞的生长、浸润和迁移，在癌症的生过程，影响细胞的生长、浸润和迁移，在癌症的生长、淋巴结转移和远距离器官种植方面起着重要的长、淋巴结转移和远距离器官种植方面起着重要的作用。其拼接变异体作用。其拼接变异体CD44在正常粘膜上皮不表达，在正常粘膜上皮不表达，在转移性结肠癌中表达明显增强，且与不良预后有在转移性结肠癌中表达明显增强，且与不良预后有关，在胃癌等肿瘤中也观察到类似情况。有研究表关，在胃癌等肿瘤中也观察到类似情况。有研究表明明CD44可明显促进肿瘤细胞的分裂增殖和循环肿瘤可明显促进肿瘤细胞的分裂增殖和循环肿瘤细胞在继发器官的定位，并能通过促进细胞在继发器官的定位，并能通过促进ras基因的表基因的表达增加迁移蛋白的产生，是肿瘤转移的促进基因。达增加迁移蛋白的产生，是肿瘤转移的促进基因。另外，另外，CD44表达阳性的癌细胞可产生免疫逃避，因表达阳性的癌细胞可产生免疫逃避，因而容易经淋巴道引起肿瘤细胞的侵袭和转移。虽然而容易经淋巴道引起肿瘤细胞的侵袭和转移。虽然CD44在肿瘤转移过程中起作用。在肿瘤转移过程中起作用。在肿瘤侵袭和转移过程中，细胞外基质的降解是在肿瘤侵袭和转移过程中，细胞外基质的降解是重要的步骤，癌细胞只有破坏细胞外基质才可侵入重要的步骤，癌细胞只有破坏细胞外基质才可侵入血管，随血流转移到其它器官。蛋白水解酶可使细血管，随血流转移到其它器官。蛋白水解酶可使细胞外基质降解，其中最为重要的是基质金属蛋白酶。胞外基质降解，其中最为重要的是基质金属蛋白酶。MMP-7是蛋白溶解酶家族成员，通过降解基底膜和是蛋白溶解酶家族成员，通过降解基底膜和细胞外基质，促使肿瘤细胞的侵袭和转移。在转移细胞外基质，促使肿瘤细胞的侵袭和转移。在转移性结肠癌的研究中，应用细胞系、动物模型或人癌性结肠癌的研究中，应用细胞系、动物模型或人癌标本，均观察到标本，均观察到MMP-7的高表达。作为的高表达。作为Wnt途径的途径的靶基因，靶基因，MMP-7不仅在结肠癌中与不仅在结肠癌中与-catenin共表达，共表达，而且在侵袭前缘，可观察到而且在侵袭前缘，可观察到MMP-7与胞核内与胞核内-catenin共存。共存。Wnt途径的靶基因途径的靶基因COX-2可增强可增强MMPs的表达，促进肿瘤的侵袭转移。的表达，促进肿瘤的侵袭转移。肿瘤的生长和扩散与血管生成密切相关，启动血管生成是肿瘤增殖的先肿瘤的生长和扩散与血管生成密切相关，启动血管生成是肿瘤增殖的先决条件。目前已发现有十数种促进肿瘤血管生成的生长因子，如决条件。目前已发现有十数种促进肿瘤血管生成的生长因子，如VEGF,EGF,TGF,FGF,Angiopoietin等。而等。而Wnt途径对血管的生成具有调途径对血管的生成具有调节作用，其靶基因节作用，其靶基因VEGF参与血管的生成。参与血管的生成。COX-2也可增强一些生长因子也可增强一些生长因子如如PDGF等的表达，等的表达，APC的突变可提高的突变可提高COX-2的活性。的活性。Holnthoner等研究等研究表明表明Wnt途径可部分介导成纤维细胞生长因子途径可部分介导成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）促进肿瘤的血促进肿瘤的血管生成能力。管生成能力。虽然没有确切的资料证明虽然没有确切的资料证明Wnt的非典型途径的非典型途径Wnt/Ca2+和平面的细胞极性途径参与肿瘤的发生和平面的细胞极性途径参与肿瘤的发生发展，但它们的激活可间接影响典型发展，但它们的激活可间接影响典型Wnt途径中的途径中的成分，如成分，如Wnt/Ca2+途径可激活途径可激活PKC,PKC的活化可的活化可使使GSK3失活，进而抑制失活，进而抑制-catenin的磷酸化，使胞的磷酸化，使胞浆内浆内-catenin含量升高，有研究发现含量升高，有研究发现PKC活化也可活化也可激活激活JNK。因为因为PKC是多基因家族，每个成员具有是多基因家族，每个成员具有不同的组织表达特异性，因此与典型不同的组织表达特异性，因此与典型Wnt途径间的途径间的相互关系和影响错综复杂，许多的机制还有待研究。相互关系和影响错综复杂，许多的机制还有待研究。平面的细胞极性途径也可涉及平面的细胞极性途径也可涉及Jun的活化。的活化。应用多种分子生物学方法，通过研究应用多种分子生物学方法，通过研究Wnt途径主要组分的基因表达情途径主要组分的基因表达情况，观察有无突变、缺失等改变，例如基因芯片，况，观察有无突变、缺失等改变，例如基因芯片，DNA测序分析，测序分析，SSCP分析等。通过分析等。通过RT-PCR技术，检测技术，检测Wnt途径相关基因的途径相关基因的mRNA水平，水平，特别是实时特别是实时PCR技术的出现和发展，使研究的精确性大大提高。传统的技术的出现和发展，使研究的精确性大大提高。传统的Northern杂交因其高敏感性也常用于杂交因其高敏感性也常用于Wnt途径的研究。途径的研究。在在Wnt途径中最终发挥生物效应的是蛋白分子，因而检测其蛋白表达水途径中最终发挥生物效应的是蛋白分子，因而检测其蛋白表达水平和分布具有重要意义。免疫组化染色即可定量分析，又可定位观察各因平和分布具有重要意义。免疫组化染色即可定量分析，又可定位观察各因子的表达情况，是最常用的方法之一。已经克隆的抗体主要有：子的表达情况，是最常用的方法之一。已经克隆的抗体主要有：-catenin抗体，抗体，APC抗体，抗体，TCF4和和TCF3/4抗体，抗体，Wnt1、Wnt2和和Wnt10抗体等，抗体等，结合结合western印迹杂交，可以为更加深入研究印迹杂交，可以为更加深入研究Wnt途径的作用机制提供条途径的作用机制提供条件。件。胞外分泌蛋白和受体胞外分泌蛋白和受体 Wnt基因编码长度为基因编码长度为350400氨基酸的分泌型糖氨基酸的分泌型糖蛋白，含有蛋白，含有2224个半胱氨酸残基。在哺乳动物有个半胱氨酸残基。在哺乳动物有16个个Wnt家族成员，通过与细胞表面、细胞外基质家族成员，通过与细胞表面、细胞外基质 的联系而体现信使的作用。的联系而体现信使的作用。Wnt的受体分为两种：的受体分为两种：一是一是FZD(Frizzled)受体家族成员，是具有受体家族成员，是具有7个跨个跨膜片段的受体，其膜片段的受体，其N N端富含半胱氨酸，是端富含半胱氨酸，是Wnt蛋白的蛋白的高亲和力结合位点，目前已发现高亲和力结合位点，目前已发现1111种；种；另一种是低密度脂蛋白受体相关蛋白另一种是低密度脂蛋白受体相关蛋白LRP5和和LRP6，为，为Wnt配体的共受体成员。配体的共受体成员。经典经典WNT信号转导通路信号转导通路 经典信号转导通路是经典信号转导通路是Wnt蛋白通过蛋白通过Frizzled(FZD)家族特异受体和家族特异受体和LRP5LRP6辅助受体结合，触发辅助受体结合，触发细胞内的信号转导，使细胞内的信号转导，使-连环蛋白连环蛋白(-catenin)聚集的聚集的级联反应过程。在经典级联反应过程。在经典Wnt信号转导缺乏时，信号转导缺乏时，-catenin与与Axin-APC-GSK-31等形成降解复合物，结等形成降解复合物，结合后的合后的-catenin发生磷酸化，进而与泛素化蛋白结发生磷酸化，进而与泛素化蛋白结合被泛素化降解。在经典合被泛素化降解。在经典WntWnt信号存在时信号存在时,-catenin将不再被将不再被CKI和和GSK3 磷酸化，而是在胞浆磷酸化，而是在胞浆中聚积并进入细胞核中聚积并进入细胞核 。核内的。核内的-catenin与与T T细胞因细胞因子淋巴增强因子子淋巴增强因子(TCFLEF)等转录因子和等转录因子和Legless蛋白蛋白(BCL9和和BCL9L)及及PYGO剖结合形成复剖结合形成复合物。合物。TCFLEF-catenin-Legless-PYGO复合物复合物启动靶基因启动靶基因FGF20，DKK1，WISP1，MYC，and CCND1 等的转录。等的转录。非经典非经典wnt信号转导通路信号转导通路 非经典非经典wnt信号是通过信号是通过fzd家族受体和辅受体家族受体和辅受体ROR2和和RYK转导的。在该通路中，小转导的。在该通路中，小G蛋白蛋白(RHOA，RHOU，RAC，和，和CDC42)和和c-jun N端激酶是端激酶是DVL依赖的效应分子，而依赖的效应分子，而Nemo样激酶样激酶(NLK)和活化和活化T细细胞核因子胞核因子(NFAT)则是钙依赖效应分子则是钙依赖效应分子 。NLK磷酸磷酸化化TCFLEF转录因子去抑制经典的转录因子去抑制经典的wnt信号通路。信号通路。NFAT转录因子早期胚胎发生和致癌作用转移过程转录因子早期胚胎发生和致癌作用转移过程中起作用。非经典中起作用。非经典Wnt信号被转导到信号被转导到DVL-或者或者Ca2+依赖的级联反应，并与细胞极性信号通路重叠依赖的级联反应，并与细胞极性信号通路重叠 。Wnt基因家族成员的基因家族成员的wnt-1，wnt-3和和wnt-10b都是由都是由MMTV诱发小鼠诱发小鼠乳腺癌的过程中活化的痛基因小鼠乳腺癌的过程中活化的痛基因小鼠wnt-1，wnt-2，Wnt-3a，wnt-5a，wnt-7基因在体外均具有转化细胞的能力目前研究表明，基因在体外均具有转化细胞的能力目前研究表明，wnt基因基因及其受体异常与人类肿瘤的发生可能相关例如，及其受体异常与人类肿瘤的发生可能相关例如，wnt-2和和wnt-5a可可能与大肠癌发生、发展有关能与大肠癌发生、发展有关DKK-1失活在大肠癌进展中也可能起重失活在大肠癌进展中也可能起重要作用要作用Wnt信号转导通路中与肿瘤发生相关的靶基信号转导通路中与肿瘤发生相关的靶基因因 一旦经典一旦经典Wnt信号转导通路被激活，将会使靶基因过度表达，从而影信号转导通路被激活，将会使靶基因过度表达，从而影响细胞的增殖、分化，促进肿瘤的发生。第一个被确定响细胞的增殖、分化，促进肿瘤的发生。第一个被确定Wnt信号转导通信号转导通路的靶基因是原癌基因路的靶基因是原癌基因c-myc。人们在结直肠癌细胞中发现，因人们在结直肠癌细胞中发现，因APC突突变而形成的变而形成的p连环蛋白连环蛋白-Tcf4复合体，通过与复合体，通过与c-myc基因启动子上基因启动子上Tcf4的结的结合位点作用，使之活化表达，从而解释了为什么合位点作用，使之活化表达，从而解释了为什么c-myc在结直肠癌许多阶在结直肠癌许多阶段都处于过表达状态。段都处于过表达状态。cyclinD1是调节细胞进入增殖期的主要因子，目前已被证实为原癌基因。是调节细胞进入增殖期的主要因子，目前已被证实为原癌基因。1999年，年，Osamu等等 发现，发现，p连环蛋白连环蛋白Tcf4复合体可与复合体可与cyclinD1启动子启动子作用，引起其高表达；他们还发现活化的作用，引起其高表达；他们还发现活化的Ras也能通过上述的也能通过上述的cyclinD1启启动子上不同于动子上不同于TcfLef结合位点的区域来加强结合位点的区域来加强cyclinD1转录。此后，在实转录。此后，在实验性毒物诱发的大鼠结直肠癌中发现验性毒物诱发的大鼠结直肠癌中发现cyclinD1过度表达，并与过度表达，并与B B连环蛋白连环蛋白基因突变有关；反义基因突变有关；反义cyclinD1 cDNA的表达，可使结直肠癌细胞生长明的表达，可使结直肠癌细胞生长明显抑制，并能阻止裸鼠中显抑制，并能阻止裸鼠中SW480结直肠癌细胞生长，结果表明结直肠癌细胞生长，结果表明cyclinD1在肿瘤发生中起着关键作用在肿瘤发生中起着关键作用 。抗凋亡基因抗凋亡基因survivin在正常结肠上皮隐窝的基部表达，并激活在正常结肠上皮隐窝的基部表达，并激活Wnt信号。信号。此外，在结直肠肿瘤中此外，在结直肠肿瘤中survivin表达增加，表明表达增加，表明survivin是是Wnt信号转导信号转导通路的靶基因通路的靶基因 。与肠道肿瘤发生密切相关的基因即环氧酶。与肠道肿瘤发生密切相关的基因即环氧酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)，可能也是可能也是p p连环蛋白连环蛋白Tcf复合物的转录复合物的转录靶基因。靶基因。Dolmetsch等等 发现，发现，Wnt-1在小鼠乳腺上皮细胞中的表达，能在小鼠乳腺上皮细胞中的表达，能上调上调COX-2基因的转录，其基因的转录，其mRNA和蛋白水平均升高，前列腺素和蛋白水平均升高，前列腺素 E2(PGE2)生成增多。生成增多。研究表明研究表明-catenin是一个多功能蛋白，它存在于内皮细胞的细胞连接处。是一个多功能蛋白，它存在于内皮细胞的细胞连接处。当有血管内皮生长因子存在的情况下当有血管内皮生长因子存在的情况下,-catenin会发生酪氨酸磷酸化，会发生酪氨酸磷酸化，之后细胞连接松散，细胞活动能力增强。因此，在抑制肿瘤新血管生成之后细胞连接松散，细胞活动能力增强。因此，在抑制肿瘤新血管生成方面，血管内皮生长因子则被认为是最主要的抗肿瘤治疗靶点。内皮抑方面，血管内皮生长因子则被认为是最主要的抗肿瘤治疗靶点。内皮抑素素(endostatin)是是X型胶原的羧基末端片段，是一种特异的血管生成型胶原的羧基末端片段，是一种特异的血管生成抑制因子。抑制因子。它能直接作用于内皮细胞，通过抑制血管内皮生长因子阻断细胞连接它能直接作用于内皮细胞，通过抑制血管内皮生长因子阻断细胞连接处处-catenin的作用，来抑制内皮细胞的迁移；另一方面，通过使细胞质的作用，来抑制内皮细胞的迁移；另一方面，通过使细胞质中中-catenin降解，来干扰它对基因表达的调节作用，从而达到抑制肿瘤降解，来干扰它对基因表达的调节作用，从而达到抑制肿瘤血管的生成。血管的生成。Wnt信号转导通路的组成信号转导通路的组成 Wnt基因属于原癌基因，其编码的基因属于原癌基因，其编码的Wnt蛋白是分泌性蛋白。在脊椎动物蛋白是分泌性蛋白。在脊椎动物中已发现至少中已发现至少2020种，其中人类有种，其中人类有l6l6种。长度大约为种。长度大约为350 380个氨基酸。个氨基酸。起始为疏水信号序列，其后包含着几个糖基化位点，并且富含半胱氨酸。起始为疏水信号序列，其后包含着几个糖基化位点，并且富含半胱氨酸。wnt受体蛋白佛力子受体蛋白佛力子(FZ)(FZ)位于细胞膜上，由位于细胞膜上，由FZD基因家族编码，是一族反基因家族编码，是一族反复复7 7次穿越细胞膜的跨膜蛋白。次穿越细胞膜的跨膜蛋白。-连环蛋白连环蛋白（-catenin)是是Wnt信号通路中有调信号通路中有调控转录活性的关键成员，能在细胞核内与控转录活性的关键成员，能在细胞核内与Wnt通路通路另一成员另一成员TCF结合从而激活靶基因的转录。糖原合结合从而激活靶基因的转录。糖原合成激酶成激酶3(GSK3)是一种丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，是一种丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，起到破坏起到破坏APCAPC复合体的关键作用。在无复合体的关键作用。在无Wnt信号时有信号时有活性，将磷酸根加到活性，将磷酸根加到-catenin的四个的四个N N端位点使这些端位点使这些磷酸氨基酸作为磷酸氨基酸作为-catenin上的一种标志。在上的一种标志。在wnt信信号存在时，磷酸化号存在时，磷酸化-catenin促使促使-catenin降解。降解。APC是一种与结直肠癌发生有关的抑癌基因，能结是一种与结直肠癌发生有关的抑癌基因，能结合合wnt