酸菜源耐高糖乳酸菌的筛选及其驯化.doc

酸菜源耐高糖乳酸菌的筛选及其

摘要：从内蒙古传统酸菜汁中分离出34株乳酸菌，经不同糖浓度MRS改良培养基中的耐糖筛
选，获得1株耐糖能力较强的乳酸菌NMS5-1，其耐糖浓度可达48%。通过对菌株NMS5-1的耐
高糖驯化，使其耐糖浓度可提高到55%，并且其活菌数达到3.6×108cfu/mL。通过L9(33)正交试验，菌株NMS5-1的最佳培养条件为培养温度35 ℃、初始pH值6.5、培养时间33 h，在此培养条件下其活菌数可达到8.3×108cfu/mL。

关键词：乳酸菌；耐高糖；筛选；驯化

Screening and domestication in glucose tolerance of lactic acid bacteria isolated from sauerkraut

Abstract:
The 34 strains of lactic acid bacteria, isolated from Inner Mongolia traditional sauerkraut juice,
were measured by glucose tolerance. The one strain NMS5-1 was selected to strong glucose tolerance in
MRS improved medium, and its concentration of sugar-tolerance was reached to 48%. By domestication
of high-sugar tolerance test, the strain NMS5-1 can survive in MRS improved medium with concentration
of sugar to 55% and its viable count reached 3.6×108cfu/mL. By L9(33) orthogonal test, the optimal culture
conditions of strain NMS5-1 were as follows: culture temperature of 35 ℃, culture time of 33 h and initial
pH value of 6.5. In this culture condition, the viable count reached 8.3×10
8
cfu/mL.

Key words:
lactic acid bacteria; high-sugar tolerance; screening; domestication

乳酸菌是一类能从可发酵碳水化合物产生大
量乳酸的一群形态与生理学特征不完全相同的革
兰阳性菌通称
[1-2]
。乳酸菌广泛分布于自然界，可
以栖居于人和各种动物消化道及器官内
[3]
，乳酸菌
大多数无毒无害，而且具有促消化、降胆固醇、
提高免疫力和预防肿瘤等益生功效
[4-6]
。因此，近
几年来乳酸菌也称为“益生菌”，成了国内外研
究的热点，在工、农、医和食品等与人类密切相
关的领域都呈现着很高的应用价值。目前，乳酸
菌也常应用于蔬菜、水果等的发酵
[7]
，经发酵的
果蔬产品，具有口感与风味独特、营养与保健价
值提高等特点。果酱是高糖产品，即使是低糖果
酱，其含糖量也在25%～50%
[8]
，乳酸菌在高糖
渗透压环境下的生长会受到限制，从而影响产品
的发酵。因此，用于发酵高糖产品的乳酸菌必须
能够耐受高糖渗透压。但是，在国内乳酸菌在果
蔬酱发酵方面的研究较少，特别是乳酸菌在耐高
糖、耐高渗透压方面的研究报道甚少。本试验通
过乳酸菌在耐高糖筛选的基础上，对其进行耐高
糖驯化，逐步提高其耐渗透压能力，为高糖发酵
食品如果酱等的开发提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
供试菌种及培养基：供试菌种是从内蒙古地
区传统发酵酸菜汁中分离的34株乳酸菌，保藏于
内蒙古农业大学食品科学与工程学院微生物实验
室；培养基：MRS改良液体培养基、MRS改良固
体培养基在实验室制备；无水葡萄糖：天津市永
大化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
SW-GJ-2FD超净工作台：苏州安泰空气技术
有限公司；TU1810紫外可见分光光度计：北京普
析通用仪器有限责任公司；电热恒温培养箱：上
海一恒科学仪器有限公司；酸度计。
1.3 试验方法
1.3.1 耐高糖乳酸菌的筛选 从内蒙古传统酸菜汁
中分离纯化的34株乳酸菌为供试菌株，分别接种
在含不同糖浓度的MRS改良液体培养基中，在37
℃培养24 h后观察其生长情况。根据乳酸菌生长
特性筛选出耐高糖菌株。
1.3.2 筛选乳酸菌的耐高糖驯化 以筛选出来的耐
高糖乳酸菌株为对象，以其可以正常生长的糖浓
度为驯化起点，将MRS改良液体培养基的糖浓度
水平按2%逐级递增以进行耐高糖驯化。在每个糖
浓度水平上驯化5代后再转接到下一级糖浓度水平
进行驯化，并对其驯化后的第1代和第5代的活菌
数采用平板计数法进行计数。
1.3.3 筛选乳酸菌在不同糖浓度下的生长趋势 将
驯化后的乳酸菌接种在不同糖浓度水平MRS改良
液体培养基中，37 ℃下培养至30 h。在培养期
间，每隔3 h测定一次培养液的OD值(培养液稀释8
倍后，用TU1810紫外可见分光光度计，在620 nm
下测定)。
1.3.4 耐高糖乳酸菌最佳培养条件的探索 在单因
素试验的基础上，设计3因素3水平(温度、pH值和
培养时间)的正交优化试验，以OD值为测定指标，
探索耐高糖乳酸菌的最佳培养条件。
2 结果与分析
2.1 耐高糖乳酸菌的筛选
从内蒙古传统酸菜汁中分离出的34株乳酸菌
在含不同糖浓度MRS改良液体培养基中的生长情
况见表1(列了部分菌株)。
表1 供试乳酸菌在不同糖浓度MRS改良液体培养基中的
生长状况(列部分菌株)
菌株号
葡萄糖浓度/%
25 30 35 40 45 48 50
S1-2 +++ - - - - - -
S1-5 - - - - - - -
S2-3 ++ - - - - - -
S2-6 - - - - - - -
S3-2 +++ +++ + - - - -
S3-4 +++ +++ ++ - - - -
S4-6 - - - - - - -
NMS5-1 +++ +++ +++ +++ ++ + -
S6-3 +++ +++ +++ +++ - - -
S6-5 ++ + - - - - -
注：+++表示生长数量多，菌液浑浊；++表示生长数量较多，菌液较
浑浊；+表示有少量生长，菌液稍显浑浊；-表示不生长，培养液清透。
从表1可知，大部分菌株在糖浓度达30%以
上时不能生长，在糖浓度达到40%时，只有2株
乳酸菌NMS5-1和S6-3能正常生长；当糖浓度提
高到45%时，只有菌株NMS5-1能生长；当糖浓度
达到50%时，所有菌株都不能生长。因此，菌株
NMS5-1的耐糖能力相对较强，其最高耐糖浓度为
48%。
2.2 筛选乳酸菌的耐高糖驯化
以筛选菌株NMS5-1为供试菌株进行耐高糖驯
化试验，结果见表2。
由表2可以看出，菌株NMS5-1在各糖浓度条
件下驯化5代后，其活菌数均明显提高，并且其耐食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
2013年 第38卷 第10期
生物工程
· 14 ·
糖浓度从48%提高到55%。菌株NMS5-1在含糖
量55%的MRS改良液体培养基中驯化第5代的活
菌数可达到3.6×10
8
cfu/mL，比驯化第1代提高
了2.4倍。
2.3 不同糖浓度对乳酸菌生长速度的影响
NMS5-1在不同糖浓度培养基中的生长情况
见图1。
要对自身的机制作出相应的调节来适应环境，所
以出现生长延滞的现象。
2.4 耐高糖乳酸菌的最佳培养条件的确定
根据单因素试验结果，进行3因素(培养温
度、初始pH值、培养时间)3水平正交优化试验，
其结果见表3。
由表3可见，菌株NMS5-1的最佳培养条件组
合是A
1
B
2
C
3
，即最佳培养温度为35 ℃、最佳初始
pH值为6.5、最佳培养时间为33 h。在此培养条
件，验证试验表明下其OD值达到0.445，活菌数达
到8.3×10
8
cfu/mL。各因素对菌株NMS5-1生长速
度的影响大小依次为A＞B＞C，即影响主次因素
依次为培养温度、初始pH值、培养时间。
3 结论
从内蒙古传统酸菜汁中分离的34株乳酸菌，
经不同糖浓度MRS改良培养基中的耐糖筛选，获
得1株耐糖能力较强的乳酸菌NMS5-1，其耐糖浓
度可达48%。通过对菌株NMS5-1的耐高糖驯化，
使其耐糖浓度从48%提高到了55%，在该糖浓度条
件下其活菌数可达到3.6×10
8
cfu/mL。在MRS改良
液体培养基中，随着糖浓度的提高，菌株NMS5-1
的生长速度减慢，其对数生长期和最高活菌数出
现时间均延长。经3因素3水平正交优化试验，菌
株NMS5-1的最佳培养条件为培养温度35 ℃、初始
pH值6.5、培养时间33 h，在此培养条件下其活菌
数可达到8.3×10
8
cfu/mL。各因素对菌株NMS5-1
生长速度的影响大小依次为A＞B＞C，即影响主
次因素依次为培养温度、初始pH值、培养时间。
参考文献：
[1]　凌代文,东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京:
中国轻工业出版社,1998:6
[2]　杨洁彬,郭兴华,张旎,等.乳酸菌-生物学基础及应用[M].
北京:中国轻工业出版社,1996:1-10
[3]　云月英,王文龙.乳酸菌与健康[J].农产品加工,2009,(1):
67-68
[4]　J L Rasic, L F Vuicc, M Skringer, et a1. Assimilation of
Cholesterol by some Culture of Lactic Acid Bacteria and
Bifidobacteria[J]. Biotechnol Lett,1992,14:39-44
[5]　赵雅.乳酸菌生理功能研究进展[J].技术交流,2009,(1):
图1 NMS5-1在不同糖浓度培养基中的生长情况
表2 菌株NMS5-1在不同糖浓度条件下不同驯化代数的长势 cfu/mL
驯化代数
糖浓度/%
42 44 46 48 50 52 55
第1代 9.2×10
8
9.0×10
8
7.1×10
8
5.3×10
8
3.3×10
8
1.9 ×10
8
1.5×10
8
第5代 1.2 ×10
9
1.0 ×10
9
9.4×10
8
8.0 ×10
8
5.2×10
8
4.4×10
8
3.6×10
8
由图1可以看出，菌株NMS5-1的进入对数
生长期的时间随糖浓度的升高而延长，在糖浓度
为42%的培养基中培养3 h便进入对数生长期，而
在糖浓度为46%和50%的培养基中经过6 h后才进
入对数生长期，当糖浓度提高到55%时，则需要
9 h以上。而且，随着培养基中糖浓度的提高菌株
NMS5-1的生长速度减慢，同一个时间段的活菌数
明显降低。这可能是由于糖浓度过高，乳酸菌需
表3 菌株NMS5-1的L
9
(3
3
)正交试验结果
试验号
因素
OD值
培养温度/℃A 初始pH B 培养时间/h C
1 1(35) 1(5.5) 1(27) 0.338
2 1 2(6.5) 2(30) 0.426
3 1 3(7.5) 3(33) 0.438
4 2(37) 1 2 0.355
5 2 2 3 0.430
6 2 3 1 0.367
7 3(39) 1 3 0.278
8 3 2 1 0.316
9 3 3 2 0.331
k
1
0.401 0.324 0.340
k
2
0.384 0.391 0.371
k
3
0.308 0.379 0.382
R 0.093 0.067 0.042· 15 ·
食 品 科 技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
2013年 第38卷 第10期
生物工程
74-75
[6]　敬思群.优质乳酸菌的应用[J].中国乳业,2002,(6):18-20
[7]　赵玲艳,邓放明,杨抚林.乳酸菌的生理功能及其在发酵
果蔬中的应用[J].中国食品添加剂,2004,(5):77-80
[8]　崔志强.低糖果酱开发现状与工艺要点研究[J].食品研究
与开发,2005,26(4):38-41
收稿日期：2013-01-23 *通讯作者
基金项目：国家自然科学基金项目(31270060)；中央高校基本科研业务费专项资金项目(2012HGZY0020)。
作者简介：卢莹(1989—)，女，安徽合肥人，硕士研究生，主要从事食品生物技术的研究工作。
卢 莹，倪 林，钱梅双，叶 明
*
(合肥工业大学生物与食品工程学院，合肥 230009)
摘要：亚油酸甲酯具有较强的触杀、产卵抑制和驱避作用。对一株粒毛盘菌产油脂突变株Z60胞
外油脂进行了GC-MS分析，其中亚油酸甲酯(C
18
:
2
)占总脂肪酸甲酯质量分数的32.7%。以亚油酸
甲酯含量为指标，在单因素基础上，采用正交实验对亚油酸甲酯的纯化条件进行了优化，最佳
条件为3.0 g粒毛盘菌胞外油脂，6.6 g尿素，16.5 mL甲醇溶液，-5 ℃包合18 h，亚油酸甲酯纯度
为50.1%。进一步利用硝酸银薄层层析法对其进行分离，分离后亚油酸甲酯气相色谱纯度提高到
96.7%。
关键词：粒毛盘菌；亚油酸甲酯；尿素包合法；硝酸银薄层层析法
中图分类号：TS 264.4 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2013)10-0015-05
Purification of methyl linoleate and analysis of oils produced by
Lachnum mutant strain
LU Ying, NI Lin, QIAN Mei-Shuang, YE Ming
*
(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei
230009)
Abstract:
Methyl linoleate has strong bioactivity of touch kill, oviposit inhibition and repellency. Gas
chromatography-mass spectrometry analysis of extracellular lipids produced by Lachnum mutant strain
Z60 was performed and the results indicated that the content methyl linoleate was 32.7%. Based on the
single factor experiment, the conditions of purification of methyl linoleate were optimized by orthogonal
test. The results were as follows: fatty oils 3.0 g, urea 6.6 g, methnol 16.5 mL, -5 ℃ inclus 18 h. Under
this condition, the purity of methyl linoleate reached 50.1%. Furthermore, separation of methyl linoleate
by using the AgNO
3
-TLC method was performed, and gas chromatographic purity of separated methyl
linoleate was up to 96.7%.
Key words:
Lachnum; methyl linoleate; urea inclusion; AgNO
3
-TLC
粒毛盘菌突变株油脂GC-MS
分析及其亚油酸甲酯的纯化