酶工程 Enzyme Engineering.docx

n 酶工程 Enzyme Engineering
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n 绪 论
n 第一节 生物催化
n 第二节 酶工程的研究内容
n 第三节 国内外酶制剂工业概况
医药生物技术
农业生物技术
工业生物技术
环境生物技术
材料生物技术
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n 工业生物技术
n 含义：在工业规模的生产过程中使用或部分使用生物技术来实现产品的制造，这种技术是应用微生物和生物催化剂来提供产品和服务
n 核心目标：大规模利用生物体系（如细胞或酶）作为催化剂实现物质转化
n 生物催化（Biocatalysis)
n 利用酶或有机体（细胞或细胞器等）作为催化剂实现化学转化的过程。
n 以生物催化法合成的主要产品
n 趋势判断和需求分析
Ø 生物催化剂在精细化学品市场中呈现强劲的增长势头。
Ø 到2020年，通过生物催化技术，将实现化学工业的原料消耗、水资源消耗、能量消耗降低30%，污染物的排放和污染扩散减少30%。
n 趋势判断和需求分析
n 目前生物催化技术已成为各公司争夺的目标并且已成为一些公司谋求发展和提升地位的工具 。
n Degussa、DSM、Roche、BASF、Dow、Lonza等许多跨国公司都在积极采取措施，扩大他们在生物催化领域里的生产能力。
n 生物催化发展的主要推动力
新产品需求 (社会压力)
-健康：医药、检测
-日用品：洗涤用品、乳品、生物可降解塑料
环境 (法律法规压力)
－绿色化学、能源、温室效应
新发现或基础研究 (技术压力）
－基因工程 /定点突变/定向进化、代谢工程、组合化学

得益/成本降低 (商业压力)
-生物分离
n 生物催化剂工程的目标
n 开发生物催化剂：催化性能更好、更快，成本更低
n 开发生物催化剂工具：催化反应更广泛，功能更多样
n 改善性能: 稳定性, 活性，溶剂兼容性
n 开发分子模型: 新酶的快速重新设计
n 创造新技术: 用于新生物催化剂的开发
n 当前生物催化的研究热点
n 新酶或已有酶的新功能的开发
n 根据已有底物开发新的酶反应
n 利用突变或定向进化技术改善生物催化剂性能
n 利用重组DNA技术大规模生产生物催化剂
n 利用有机溶剂或共溶剂开发新的反应体系
n 体内或体外合成的多酶体系
n 克服底物和产物抑制
n 精细化工品或医药合成技术的放大
n 辅因子再生
n 生物催化剂的修饰
n 生物催化剂的固定化
n 第一节结束
n 点击返回
n 第二节 研究内容
n 一．概念：
n 二．酶工程研究简史
n 三．研究内容
n 一． 概念：
n 酶工程（ Enzyme Engineering）
n 从应用目的出发研究酶，在一定的生物反应装置中利用酶的催化性质，将相应原料转化成有用的物质。是酶学和工程学相互渗透结合形成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学。
n 酶的定义
n 二. 酶工程研究简史
n 1926 美国的Sumner从刀豆中得到脲酶结晶（1947年诺贝尔奖）
n 1970 美国的Smith 发现限制性内切酶（1979年诺贝尔奖）
n 1969 日本固定化氨基酰化酶，第一次将固定化酶成功地应用于工业生产。——酶工程诞生
n 1986 美国 核酶发现获得诺贝尔奖
n 1. 酶的发现及研究历史
n 人们对酶的认识起源于生产与生活实践。
n 夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。
n 公元前12世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。
n 春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。
麴的英文翻译 ：yeast; a ferment for brewing
n 酶者，酒母也
n 西方国家19世纪对酿酒发酵过程进行了大量研究。直到1897年，德国巴克纳Buchner兄弟用石英砂磨碎酵母细胞，制备了不含酵母细胞的抽提液，并证明此不含细胞的酵母提取液也能使糖发酵，说明发酵与细胞的活动无关。从而说明了发酵是酶作用的化学本质，为此Buchner获得了1911年诺贝尔化学奖。
n 1896年,日本的高峰让吉首先从米曲霉中制得高峰淀粉酶,用作消化剂,开创了有目的的进行酶生产和应用的先例。
n 1878年, 给酶一个统一的名词，叫Enzyme，这个字来自希腊文，其意思“在酵母中”。
n 后来对酶的作用机理及酶的本质做了深入研究，1930年，证实酶是一种蛋白质；
n 80年代初发现了具有催化功能的RNA——核酶(ribozyme)，这一发现打破了酶是蛋白质的传统观念，开辟了酶学研究的新领域，现已鉴定出4000多种酶，数百种酶已得到结晶，而且每年都有新酶被发现。
n 2.酶的应用历史
n 1908年,德国的罗姆制得胰酶,用于皮革的软化。
n 1908年,法国的波伊登(Boidin)制备了细菌淀粉酶,应用于纺织品的退浆。
n 1911年,美国的华勒斯坦(Wallestein)制得木瓜蛋白酶,用于除去啤酒中的蛋白质浑浊。
n 此后,酶的生产和应用逐步发展。然而在50年代以前停留在从微生物，动物或植物中提取酶,加以利用阶段.由于当时生产力落后,生产工艺较繁杂,难以进行大规模工业化生产。
n 1949年,用液体深层培养法进行细菌淀粉酶的发酵生产,揭开了近代酶工业的序幕。
n 50年代以后,随着生化工程的发展,大多数酶制剂的生产已转向微生物流体深层发酵的方法。酶的应用越来越广泛。
n 50年代：开始了酶固定化研究。1953年德国科学家首先将聚氨基苯乙烯树脂与淀粉酶,胃蛋白酶,羧肽酶和核糖核酸酶等结合,制成了固定化酶。
n 60年代，是固定化酶技术迅速发展的时期。1969年,日本的千烟一郎首次在工业上应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸。出现了“酶工程”这个名词来代表有效利用酶的科学技术领域。
n 1971年第一届国际酶工程学术会议在美国召开,当时的主题即是固定化酶，进一步开展了对微生物细胞固定化的研究。
n 1973年,千烟一郎首次利用固定化的大肠杆菌细胞生产L-天冬氨酸。
n 1978年,日本的铃木等固定化细胞生产 α -淀粉酶研究成功.所以说,70年代是固定化细胞技术取得进展的时期.
n 80年代，固定化细胞已能用于生产胞外酶,因此,80年代又发展了固定化原生质体技术,排除了细胞壁这一障碍。
n 在酶的固定化技术发展的同时,酶分子修饰技术也取得了进展。
n 60年代，用小分子化合物修饰酶分子侧链基团,使酶性质发生改变;
n 70年代,修饰剂的选用、修饰方法上又有了新的发展。
n 此外,对抗体酶,人工酶,模拟酶等方面,以及酶的应用技术研究 ,在近20年均取得了较大进展,使酶工程不断向广度和深度发展,显示出广阔而诱人的前景。
n 三． 研究内容
n （一）化学酶工程
n （二）生物酶工程
n (一）化学酶工程
n 1 自然酶的开发
n 2 酶的化学修饰
n 3 酶的固定化
n 4 人工合成酶的研究
n （二）生物酶工程
n 1 酶基因的克隆表达
n 2 酶的遗传修饰
n 3 酶的遗传设计
n 第二节　小结
n 概念：
n 酶学研究简史
n 研究内容
n 第二节结束
n 点击返回
n 第三节：国内外酶制剂工业概况
n 一． 国外酶制剂生产和应用现状
n 二． 我国酶工业发展阶段
n 二． 国内外酶制剂生产应用差异
n 四． 酶与现代生活
n 一． 国外酶制剂生产和应用现状
n 1 世界三大酶制剂公司
n Novo Nordisk （丹麦）
n Genencor International(美国）
n Cuitor(芬兰）
n 三大公司销售额占世界总额的70%
n 二 我国酶工业发展阶段
n 1 1965 无锡酶制剂厂 淀粉酶
n 2 1979 糖化酶
n 3 碱性蛋白酶
n 4 中性蛋白酶
n 5 1993 耐高温淀粉酶
n 6 1998 国外大公司纷纷入驻1999年投产
n 国内酶制剂销售额比例
n 三．国内外酶制剂生产应用差异
n 1． 规模：国外多公司重组
n 国内重复建设、效益低
n 2 投入： 国外：开发经费高达15%，甚至19%销售额
n 国内：研究、开发投入不足，占1%销售额
n 3 开发重点国外：大力研制、开发新酶种和新用途
n 国内：品种少、剂型少
n 四．酶与现代生活
n 乙型肝炎病毒(hbv)pcr酶免检测试剂
n
雪豹fe生物酶健齿牙膏
狗--活性酶除臭剂
“酶可邦”还你绿水蓝天
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1.使用的酶制剂类别
一类是水解酶类
淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、乳糖酶等, 占有市场销售额的75%以上。
约有60%以上的酶制剂已用基因改良菌株生产,
ＮＯＶＯ公司使用的菌种有80%是基因重组菌株。
二类是非水解酶
主要是分析试剂用酶和医药工业用酶占市场销售额10%左右,并有逐年增大的倾向。
食品工业中,用于淀粉加工的酶所占比例仍是最大,为15%;其次是乳制品工业,占14%。
另外，酶在食品、纺织、制革工业等传统的应用。
2.我国酶制剂工业十五和2015年发展目标

酶制剂工业是生物技术产业化的重要工业部门，不仅是食品发酵工业的基础，也是许多相关产业发展的支柱。预计全世界到2008年增长到30亿美元，年增长6%)。
我国的酶制剂工业是一个年轻而有活力的高新技术产业。在销售额方面保持年均增长8%，“十五”期间，要淡化产量增长意识，走科技型、实力型发展之路，使行业实现多品种、优质量、低消耗、高效益、无污染发展。
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发展目标和实施：
应用菌种选育、培育的现代化技术，开发酶制剂的新品种，拓展应用的新领域。
工业酶领域，开发低温、高碱的洗涤剂工业用酶，(碱性纤维素酶、碱性淀粉酶)，并形成复合优势；
开发水解纤维素、木质素类新酶种，消化桔杆，改革农村燃料结构，增加饮料及工业原料资源。

注重开拓纺织工业用酶，还要重视制革、造纸和纸浆、化妆品、医药、环保等部门使用的新酶种及其应用开发（如皮革酶浸水制剂、SOD等）
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3. 酶的应用情况

目前美国占24.7%，用量最大；其次是欧洲联盟，占23%，发展中国家也在惊人的增长。

我国统计有100多家生产厂，最大的是无锡酶制剂厂。全国26家酶制剂生产企业总产量达27.2万吨,年增长8.8%,产销率达到95%。中国目前生产50多个酶制品（主要是淀粉酶，糖化酶, 碱性蛋白酶）。丹麦Novo公司在天津合资生产酶制剂,主要生产洗涤用酶。
万吨以上企业达10家,
5000吨以上企业达19家。
大量的为小规模，平均规模为1.0462吨。

3-1. 食品领域
在低聚糖用酶开发之后，开发玉米、大豆、马铃薯的深加工、精加工用酶；
开发蛋白质、油脂工业等领域使用的酶种；
饲料用酶的研究、开发和应用工作。
加强酶制剂后提取的工艺研究，液体酶制剂的比重在提高，但工艺、装备上还需攻关。

目前，要逐步实现现代化，使酶制剂升级换代，符合安全、卫生、环保的要求。

3-2.工业用酶
3-2-1. 加工业
淀粉酶 葡萄糖异构酶 蛋白酶 核酸酶
淀粉→葡萄糖→果糖, 蛋白质→氨基酸， 核酸→核苷酸
利用酶知识，已经建立了一个相当规模的有机酸工业
主要有机酸：柠檬酸,苹果酸,乳酸醋酸衣康酸（甲叉丁二酸）,
葡萄糖酸（右旋葡萄糖酸）, L-(+)-酒石酸,
曲酸（带有取代基团的γ-吡喃酮）
3-2-2. 改进质量
果胶酶 葡萄糖苷酶 溶菌酶
果,酒汁→澄清; 大豆→脱生 食品→防腐、灭菌;
淀粉酶
纺织工业→脱浆
3-2-3. 制革工业
蛋白酶脂肪酶 蛋白酶
皮革→脱毛,软化 洗涤剂→提高去污力
3-2-4. 三废处理
从茄病镰刀菌分离的分解氰化物的酶
氰化物--------------------------→去氰
3-3. 医疗用酶
多酶片（蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶，纤维素酶等）
消炎酶（胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，菠萝、木瓜蛋 白酶，溶菌酶，溶葡球菌酶，尿激酶）
抗肿瘤酶 ( 天冬酰胺酶 )
正常细胞含天冬酰胺合成酶
天冬酰胺合成酶
L-天冬氨酸+ATP+NH3---------------→ L-天冬酰胺 + ADP + Pii
肿瘤细胞无此功能 ，靠吸收血中天冬酰胺，癌
细胞才能存活。给病人以天冬酰胺酶，分解天冬酰胺，血中没有天冬酰胺，癌细胞就死亡。
天冬酰胺酶
L-天冬酰胺 + 水--------------→ L-天冬氨酸 + NH3

其他用酶和遗传病治疗用酶：
淀粉葡萄糖酶→糖质堆积症
透明质酸酶→提高毛细血管通透性，增进药物吸
腺苷脱氨酶（PEG修饰）→治疗免疫缺陷病，已经用于临床
医用药物酶的应用上存在问题：
1）异体蛋白引起免疫反应
2）酶不纯，引起各种副作用
3）酶在体内降解，时间短
4）药物无法定向分布
解决办法
1)制成微胶囊
2)制成衍生物
3)制成脂质体包埋与免疫系统隔开(酶蛋白),保护起来
4)酶上引入一定基团，起导向作用
3-4. 酶分析应用
1) 酶为分析工具—— 酶法分析
2) 酶为分析对象——酶活力测定 （均基于动力学来实现）
酶法分析举例
a) 发酵液中成分非常复杂,用专一作用于某一氨基酸的脱羧酶为工具酶；测定CO2的量，就知道某一氨基酸的量。
L-Lys脱羧酶
L-Lys 尸胺 + CO2 CO2 电极测出CO2的量

优点: 不用分离,专一性强,尤其测定一些纯化中不稳定的酶 
b) 偶联指示酶法（解决工具酶反应不够灵敏的问题）
己糖激酶 Mg++
Glucose + ATP G-6-P 工具酶反应
G-6-P脱氢酶
G-6-P + NADP+ NADPH + 6-P-G酸

测定葡萄糖，用还原糖法不专一
用测定NADPH很容易，灵敏度可测到10-12 mol/ml
 重要一点：偶联指示酶活力 >> 工具酶
酶法分析发展方向：简便，用试纸, 微量。
3-5. 酶知识应用于工业生产
顺乌头酸酶
1） TCA中，乙酰CoA 柠檬酸 异柠檬酸
在生产中除了大部分是柠檬酸外，还有异柠檬酸，因为有顺乌头酸酶存在，用氟乙酸抑制顺乌头酸酶,可以提高柠檬酸产量
2）有机磷农药制备原理：抑制昆虫中的乙酰胆碱酯酶，
使昆虫在生理上出现失调而死亡。
3）磺胺药 细菌核苷酸合成酶辅酶的竞争性抑制剂
如Lys的生产：
Asp→→→天冬氨酸-β-半醛→高丝氨酸→Thr →Lys

只要控制Thr的量，克服协同调控，Lys就可以大量生产。
菌株进行诱变，选出突变菌株，在培养细菌的培养基中只要加入少量Thr，就能生产大量的Lys
酶标免疫技术：
70年代从免疫学发展起来的一种分析方法
特点：免疫学的专一性和酶高效催化的结合
方法：
1）酶标记物与抗原或抗体结合，形成复合物
2）由于抗体和抗原定量专一性结合
3）测定结合于抗原-酶或抗体-酶的酶活性的大小，推断出抗体或抗原的量。