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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本幻灯片资料仅供参考，不能作为科学依据，如有不当之处，请参考专业资料。谢谢,大量物理过程能够用方程来描述，即线性微分方程来描述，如：,万有引力定律（伽利略）；,行星运动,(,牛顿）；,白炽金属发出辐射（普朗克）。,生命系统结构和过程怎样用数学方程来描述？,生命系统结构和过程相互作用并形成网络，显然要复杂得多。我们今天要学习课程就是用线性微分方程来描述微生物工程中一个动力学过程，当然它是一个近似描述。,第1页,目标,：,微生物工程基本任务是高效地利用微生物所含有内在生产力，以较低能耗和物耗最大程度地生产生物产品，所以必须对微生物反应整个过程实现有效控制。微生物动力学为这一目标提供了部分理论依据。,第十二章 微生物反应动力学,第2页,内容：,微生物反应动力学是硕士物反应速度规律，即细胞生长速率、基质利用速率和产物生成速率改变规律。,基质,（碳源）,细胞,产物,第3页,方法：,用数学模型定量地描述生物反应过程中细胞生长速率、基质利用速率和产物生成速率等原因改变，到达对反应过程有效控制。,已发展出好几个动力学模型，我们介绍一个,“发酵过程动力学分型”,。,第4页,一、微生物发酵过程分型,二、分批培养动力学,1.,细胞生长动力学,2.,基质消耗动力学,3.,产物生成动力学三、连续培养动力学,1.,单级连续培养动力学,2.,多级串联连续培养动力学,3.,细胞循环使用单级连续培养动力学四、连续培养实施,第5页,12.1,发酵动力学分型,这种动力学分型方法讨论是,产物形成与底物利用关系,即产物形成速度与碳源利用关系。它将微生物发酵过程分为三个类型：,.,产物形成,直接,与碳源利用相关,.,产物形成,间接,与碳源利用相关,.,产物形成,表面上,与碳源利用无关,第6页,12.1.1,第,型（,与生长相关型）,菌体生长、碳源利用和产物形成几乎同时出现高峰。,产物形成、碳源利用、菌体生长,同时出现高峰,1.,细菌生长类型,(,指终产物就是菌体本身,);,如酵母、蘑菇菌丝、苏云金杆菌等培养。,细菌产量,/,碳源消耗,“,产量常数”,2.,代谢产物类型；指产物积累与菌体增加相平行，并与碳源消耗有准量关系。如酒精、乳酸、山梨糖、葡萄糖酸、,-,酮戊二酸等。,3.,氯霉素、杆菌肽,第7页,发酵第一类型,比生长速率，,g/(g.h);,碳源利用比速率，,g/(g.h),；,产物形成比速率，,g/(g.h),。,时间,h,第8页,12.1.2,第,型（与部分生长相关型）,第一时期：细菌快速生长，产物极少或全无；,第二时期：产物高速形成，生长也可能出现,第二个高峰，碳源利用在这两个,时期都很高。,特点：从生源来看，发酵产物不是碳源直接,氧化，而是细菌代谢主流产物。,可分两种类型：,1.,产物形成是经过连锁反应过程。,丙酮丁醇，先形成乙酸和丁酸，再形成丙酮和丁醇。,2.,产物形成不经过中间产物积累。菌体生长与产物积累显著分在两个时期。如柠檬酸。,第9页,发酵第二类型,比生长速率，,g/(g.h);,碳源利用比速率，,g/(g.h),；,产物形成比速率，,g/(g.h),。,时间,h,第10页,12.1.3,第,型,(,与生长不相关型,),特点,:,产物形成普通在菌体生长靠近或到达最,高生长时期,即稳定时。,产物形成与碳源利用无准量关系。,产量远低于碳源消耗。（最高产量普通不超出碳源消耗量,10%,。如抗生素、维生素属这类。,第11页,发酵第三类型,比生长速率，,g/(g.h);,碳源利用比速率，,g/(g.h),；,产物形成比速率，,g/(g.h),。,时间,h,第12页,一、微生物发酵过程分型,二、分批培养动力学,1.,细胞生长动力学,2.,基质消耗动力学,3.,产物生成动力学三、连续培养动力学,1.,单级连续培养动力学,2.,多级串联连续培养动力学,3.,细胞循环使用单级连续培养动力学四、连续培养实施,第13页,二、分批发酵动力学,1,、几个基本概念：,菌体生长速率,比生长速率,底物消耗速率,产物生产速率,比产物生产速率,得率因子,第14页,二、分批发酵动力学,菌体浓度、生长速率和比生长速率,(cell density,growth rate and specific growth rate),菌体浓度,(cell density,or cell concentration,X,g/L),干重：,105,烘干至恒重,;,比色法：在一定菌体浓度范围内，菌体浓度与培养液吸光值成正比,;,DNA,或,RNA,含量测定,;,离心法近似测定,;,发酵液粘度。,第15页,二、分批发酵动力学,生长速率,(r,X,),：,单位时间内菌体浓度增加量,比生长速率,(,),：,单位时间内单位菌体量所产生菌体增加量,第16页,二、分批发酵动力学,在常规培养条件下一些微生物最大比生长速率,(,max,/h,):,产黄青霉：,0.12,甲烷单孢菌：,0.53,构巢曲霉：,0.36,贝内克氏菌：,4.24,第17页,二、分批发酵动力学,底物浓度、底物消耗速率和比底物消耗速率,(substrate concentration,S;substrate consumption rate,r,S,and specific s.c.r.),碳源,总糖,(total sugar),，斐林滴定法或,DNS,法,还原糖,(reducing sugar),，斐林滴定法或,DNS,法,氮源,氨基氮,(amino-nitrogen),，甲醛滴定法,总氮,限制性底物或限制性基质,第18页,二、分批发酵动力学,底物消耗速率,(r,S,),：,单位体积发酵液在单位时间内所消耗底物量。,比底物消耗速率,(q,S,),：,单位菌体量在单位时间内所消耗底物量。,第19页,二、分批发酵动力学,产物浓度、产物生产速率与比产物生成速率,(product,P,；,product formation rate and specific p.f.r.),化学分析,比色法，化学反应后比色,气相色谱,(gas chromatography,GC),液相色谱,(high performanced liquid chromatography,HPLC),生物分析方法,生物效价（如抗生素含量测定）,酶活性测定,酶联免疫分析等,第20页,二、分批发酵动力学,产物生成速率,(r,P,),：,单位体积发酵液在单位时间内所生成产物量。,比产物生成速率,(q,P,),：,单位量菌体在单位时间内所生成产物量。,第21页,12.2,分批培养动力学,分批培养指是一次投料，一次接种，一次收获间歇式培养方式。,这种培养方式操作简单。,发酵液中细胞浓度、基质浓度和产物浓度均随时间改变。,第22页,12.2.1,分批培养中,细胞生长,动力学,在分批培养中细胞浓度,X,要经历延迟期、对数生长久、减速期、稳定时和衰亡期五个阶段。,第23页,分批培养中细胞浓度改变,1.,延迟期；,2.,对数生长久；,3.,减速期；,4.,稳定时；,5.,衰亡期,1,2,3,4,5,t,lnX,第24页,12.2.1.1,延迟期,微生物接种后，细胞在新环境中有一个适应期。,适应期长短与菌龄、接种量、辅助酶（活化剂）、以及一些小分子、离子相关,。与培养基浓度无关。,第25页,12.2.1.2,对数生长久,在这阶段中，因为培养基中营养丰富，有毒物质少，细胞快速生长，其生长速率与细胞浓度成正比：,式中：,X,细胞浓度,(kg/m,3,);,t,时间,(s);,-,比生长速率,(s,-1,),。,积分：,第26页,式中比生长速率,与微生物种类、培养温度、培养基成份及限制性基质浓度等原因相关。,(,是一个变量！）,在对数生长阶段，细胞生长不受限制所以比生长速率到达最大值,m,，,如在时间,t,1,时细胞浓度为,X,1,，则在,t,2,时细胞浓度为,X,2,第27页,第28页,细胞浓度随时间呈指数生长，细胞浓度增加一倍所需时间称,倍增时间,（,doubling time,t,d,),细菌倍增时间：,0.251h,酵母,:1.152h,霉菌,:26.9h,第29页,12.2.1.3,减速期,经过对数生长久细胞大量繁殖，培养基中营养物质快速消耗，有害物质逐步积累，细胞比生长速率逐步下降，进入减速期。,无抑制性基质时,式中,:S,限制性基质浓度,;K,m,饱和常数。,该式称,Monod,方程式，是经验公式。,当限制性基质浓度很低时，增加基质浓度能够提升细胞比生长速率；但，若限制性基质浓度靠近,K,m,时，再增加其浓度 就不能提升比生长速率。,第30页,2.,有抑制性基质时，发生抑制现象。如以醋酸为基质培养产阮假丝酵母，用亚硝酸盐培养硝化杆菌等。这时细胞比生长速率：,式中：,K,is,抑制常数。,还有一些产物抑制经验公式：,式中：,P,产物浓度；,k,k,1,k,2,-,是常数。,第31页,12.2.1.4,静止期,营养物质耗尽，有害物质大量积累，细胞浓度到达最大值，不再增加。此时细胞比生长速率为零。,12.2.1.5,衰亡期,细胞开始死亡，,式中：,X,m,静止期细胞浓度；,细胞比死亡率；,t,进入衰亡期时间,第32页,课程叙述方法：,一、微生物发酵过程分型二、分批培养动力学,1.,细胞生长动力学,2.,基质消耗动力学,3.,产物生成动力学三、连续培养动力学,1.,单级连续培养动力学,2.,多级串联连续培养动力学,3.,细胞循环使用单级连续培养动力学四、连续培养实施,第33页,12.2.2,分批培养中,基质消耗,动力学,12.2.2.1,得率系数,微生物细胞内生化反应极为复杂，总反应能够用下式表示：,碳源,+,氮源,+,氧 细胞,+,产物,+CO,2,+H,2,O,菌体生长,量,相对于基质消耗,量,收得率称,生得率,其定义为：,式中 相对于基质消耗,实际生长,得率,(g/g,g/mol),；,干细胞生长量,(g),；,基质消耗量,(mol,g),。,对于氧，细胞得率系数为：,第34页,在培养过程中，细胞产生除二氧化碳和水之外，还产出产物。以消耗基质,产物得率,系数为,式中,相对于基质消耗实际产物得率,(g/mol,g/g),；,产物生成量,(mol,g),。,12.2.2.2,基质消耗速率,分批培养时，基质降低是因为细胞和产物生成。依据物料衡算有,第35页,假如限制性基质是碳源，所消耗掉碳源中一部分形成细胞物质，一部分产生能量，一部分形成产物，则,式中 细胞生长得率系数,(g/mol),；,(,只用于细胞生长所消耗基质）,细胞维持系数,(mol/g.h),；,产物得率系数,(mol/mol),。,(,只用于产物生成所消耗基质）,维持系数是微生物菌株一个特征值。对于特定菌株、特定基质和特定环境原因（如温度、,Ph,值等）是一个常数，故又称,维持常数,。维持系数越低，菌体能量代谢效率越高。其定义：,单位质量干菌体在单位时间内，因维持代谢消耗基质量：,第36页,式中，以基质消耗为基准维持系数,(mol/g.h),；,细胞干重,(g),；,限制性基质浓度,(mol,g),；,发酵时间,(h),；,表示维持,(maintain),。,维持常数 定义：单位质量干菌体在单位时间内，因维持代谢消耗基质量：,第37页,和 是对基质,(,碳源,),总消耗而言，和 则分别对用于,(,只用于,),生长,和产物,生成,所,消耗,基质而言。,假如用比速率来表示基质消耗和产物生成，则,和 分别为基质比消耗速率和产物比生成速率，所以上两个式子可改写成：,第38页,若产物生成能够忽略不计，则,能够合并，得,细胞生长得率 和细胞维持系数 是极难直接测量，而 是很轻易测出,(,利用连续培养法，很轻易求出 与 关系）。只要测出细胞在不一样比生长速率下 就能够求出 和,方程组应用一个例子,第39页,DNA,重组大肠杆菌,与,，,m,关系,第40页,课程叙述方法：,一、微生物发酵过程分型二、分批培养动力学,1.,细胞生长动力学,2.,基质消耗动力学,3.,产物生成动力学,三、连续培养动力学,1.,单级连续培养动力学,2.,多级串联连续培养动力学,3.,细胞循环使用单级连续培养动力学四、连续培养实施,第41页,12.2.3,产物生成,动力学,产物生成情况比较复杂，对于三种发酵类型必须分别加以讨论。,.,产物生成与细胞相关，产物生成速率为：,式中，是以细胞为基准产物得率系数。,.,产物生成与细胞生长部分相关，,与生长关联细胞生产能力；,非生长关联比生长速率。,第42页,.,产物生成与细胞生长不相关联。,在细胞处于生长久，无产物积累，当细胞生长停顿时，产物开始大量积累，其生成速率：,若用比速率表示，则上式可写成：,式中，,k,是不稳定产物失活常数（限制性基质特征）。,第43页,以上由细胞生长、基质消耗和产物生成微分方程组成微分方程组。,小结,细胞生长：,基质消耗：,或 用基质比消耗速率和产物比生成速率表示：,第44页,产物生成,：,.,.,.,第45页,小结,上述方程反应了分批发酵过程中细胞、基质和产物浓度改变。,对各种不一样微生物分批发酵过程，经过,试验,研究这三参量改变规律，建立适合微分方程组，就能够对分批发酵过程进行模拟，进行优化控制，最终到达大大提升生产效率。,第46页,课程叙述方法：,一、微生物发酵过程分型二、分批培养动力学,1.,细胞生长动力学,2.,基质消耗动力学,3.,产物生成动力学,三、连续培养动力学,1.,单级连续培养动力学,2.,多级串联连续培养动力学,3.,细胞循环使用单级连续培养动力学四、连续培养实施,第47页,12.3,连续培养动力学,连续培养（连续发酵）是指在培养过程中，连续地向发酵罐中加入培养基，同时以相同流速从发酵罐排出含有产品培养基。,有两种方式：,罐式（或搅拌发酵罐）；,管式反应器。,第48页,12.3.1,连续培养优点,分批培养中，微生物细胞群体都经过五个阶段：延迟期、对数生长久、减速期、稳定时和衰亡期。其实对特定微生物发酵过程，目标产物只仅仅在某一个期间合成。如第,型发酵，产物积累出现在对数生长久；而属于第,型发酵，产物积累则在稳定时。其它几期是多出，浪费时间。同时,分批培养中辅助时间很长，所以设计了连续培养。,优点以下：,提升设备利用率和单位时间产量，只保持一个,稳定状态,。,发酵中各参数趋于稳定，便于自动控制。,易于分期控制。能够在不一样罐中控制不一样条件。,还有各种分类：（以设备分类或控制方法分类）,恒成份培养；恒浓度培养、循环式、非循环式、单级和多级连续培养等。,第49页,12.3.2,单级连续培养,在进行任何连续培养开始，都要先进行分批培养，让微生物在接种后生长繁殖到达一定细胞浓度，并进入产物合成时期，然后才开始以,恒定流量,向发酵罐加入培养液，同时以,一样流量,排放出培养液，使发酵罐内培养液,体积保持恒定,，微生物能连续生长并合成产物。假如在发酵罐中进行充分搅拌，则培养液中各处,组分均匀,，,与流出液组分相同,，即为连续流动搅拌发酵罐。,第50页,各种物质物料平衡按下式计算：,流入速率,=,流出速率,+,消耗速率,+,积累速率,因为加入培养基中不含有细胞，所以有,式中：液体流量,(m,3,/s),；发酵罐培养液体积,(m,3,),；,因细胞生长造成细胞浓度改变率；,培养液中细胞浓度改变率。,第51页,三、连续培养动力学,单级连续培养,到达稳态后，对上述微生物反应体系进行物料衡算,第52页,上式能够整理成：,式中流量与培养液体积比称为,稀释率,，用,D,表示,单位为,1/s,其含义是单位时间内加入培养基体积占发酵罐内培养基体积分率；,D,倒数,t,表示培养液在发酵罐内平均停留时间（,s,）。所以,第53页,开始连续培养一段时间，（大约为平均停留时间,35,倍）以后，过程进入稳态。培养液中细胞、基质和产物浓度保持恒定，不再随时间改变。所以连续培养亦称,恒化培养,。到达稳态时，。,第54页,单级连续培养一个主要特征，就是进入稳定状态后，细胞比生长速率与稀释率相等。,另外分批培养时，细胞比生长速率是无法人为控制；而连续培养时，稳态下细胞比生长速率能够经过改变培养基流量速率而加以改变。但稀释率大小有一定限制。即有一个临界稀释率。,第55页,前面讲分批培养中细胞动力课时，进入“减速期”,即靠近稳定态时有一个,Monod,方程,(,或米氏方程,),第56页,9.2.1.3,减速期,经过对数生长久细胞大量繁殖，培养基中营养物质快速消耗，有害物质逐步积累，细胞比生长速率逐步下降，进入减速期。,无抑制性基质时,式中,:S,限制性基质浓度,;K,m,饱和常数。,该式称,Monod,方程式，是经验公式。,当限制性基质浓度很低时，增加基质浓度能够提升细胞比生长速率；但，若限制性基质浓度靠近,K,m,时，再增加其浓度 就不能提升比生长速率。,第57页,若假设加入限制性基质浓度为,S,0,，则,临界稀释率,：,若稀释率超出临界稀释率，细胞比生长速率小于稀释率，伴随时间延续，细胞浓度不停降低，最终细胞从发酵罐中被洗清。,当 时，发酵罐中限制性基质,稳态浓度为,第58页,关于限制性基质，能够有以下物料平衡关系：,式中 因细胞消耗造成限制性基质浓度改变率；培养液中限制性基质改变率。经整理得：,第59页,三、连续培养动力学,第60页,细胞生产速率为：,稳态时 ，发酵罐中细胞浓度为：,方程组应用一个例子,（,9.35,）,此时（即稳态时），,D=,第61页,三、连续培养动力学,在连续培养过程中细胞生产速率为,得到最大细胞生产速率稀释速率为,第62页,三、连续培养动力学,在连续培养过程中所能得到最大细胞产率为,当,S,0,远大于,K,S,时,第63页,第64页,有微生物连续培养结果会与图,9-5,所表示情况发生差异。比如，,当限制性基质为碳源时，消耗碳源中有一部分用于能量释放以供细胞维持生命活动之需，所以在低稀释率时，细胞浓度显著偏低（图,9-6(a),）。,以氮或硫为限制性基质时，细胞在低稀释率下可能积累多糖、脂肪或,-,羟基丁酸，细胞浓度会偏高（图,9-6(b),）。,以镁、磷或钾作为限制性基质时，与上述情况类似，只是起因不一样（图,9-6,（,c,）。,在复合培养基时，往往难以确定哪一个是限制性基质，而且伴随比生长速率改变，限制性基质可能发生改变。所以细胞浓度随稀释率增大而下降（图,9-6(d),）。,第65页,第66页,关于产物，有以下物料恒算式：,式中 由细胞合成产物引发产物浓度改变率,kg/(m,3,s);,培养液中产物浓度改变速率,kg/(m3s);,当连续培养处于稳态时,且加料中不含产物,P,0,=0,时,第67页,三、连续培养动力学,产物形成,对产物进行物料衡算,第68页,12.3.3,多级串联连续培养动力学,把多个发酵罐串联起来,第一罐情况与单罐培养相同,以后下一罐进料便是前一发酵罐出料,这么就组成了多级串联连续培养。,第69页,多级串联连续培养动力学,多级串联连续培养可提升生产能力。,二级连续培养细胞浓度,X,1,、,X,2,，限制性基质,S,1,、,S,2,，细胞生产速率,DX,1,DX,2,与稀释率,D,关系,DD,C,时，一、二级罐中细胞被洗光。,D,D,C,时，,X,2,X,1,；,S,2,S,1,。,第70页,假如各级发酵罐培养体积相同,而且第二级以后各级发酵罐中不加新培养基,那么依据各级发酵罐物料平衡,可得出稳态下个发酵罐中细胞浓度、比生长速率、限制性基质浓度和产物浓度。,当到达稳态时,:,第71页,12.3.4,细胞循环使用单级连续培养动力学,进行单级连续培养时，有细胞循环使用和不循环使用两种方法。,经连续培养后，流出培养液进行固液分离，经浓缩后细胞悬浮液再被送回发酵罐中，也称为细胞回流连续培养（图,9.8,）。,第72页,F,S,0,(1+,)F,X,F,F,cX,图,9.8,细胞回流单级连续培养示意图,第73页,图中还给出了不进行细胞回流时，,X,、,DX,与,D,关系对比。能够看出，进行回流时，临界稀释率增大，发酵罐可在高于细胞比生长速率稀释率下操作，从而提升了细胞生产速率，同时也加紧了基质消耗率。在废水处理中常被采取。,B,E,A,C,D,第74页,连续培养比分批培养有许多优越性：,效率高，易长久稳定控制，易实现自动化,等等。,注意问题：,预防杂菌污染、预防菌种变异、预防菌种衰老,等等。,9.3.5,连续培养实施,第75页,连续培养与分批培养比较,假如用单级连续培养，,细胞最大生产速率,与,一样限制性基质初浓度,S,0,下分批发酵培养时细胞生产速率相比，就能够看到连续培养优越性：,假设分批发酵指数生长久延续到限制性基质耗尽，这时到达最大细胞浓度为,X,F,，接种后细胞浓度为,X,0,，则每一个生产周期为：,t,B,-,分批培养一个生产周期所用时间,;t,L,-,延迟期所占时间,;,t,R,-,放出培养液所用时间,;t,P,-,清洗发酵罐、重新加入培养基、灭菌、冷却等辅助操作所需时间。,第76页,所以分批培养细胞生产率 为：,设连续培养细胞最大生产率,Pcc,，将式（,9.39,），即,连续培养细胞最大生产率,与式（,9.62,）相除，得,（,9.62,）,由此可见，细胞比生长速率越大，辅助操作时间越长，连续培养优势就越大。比如抗生素连续培养稀释率普通较小，但较分批培养仍含有较大生产能力。像青霉素连续发酵生产量是分批发酵,1.65,倍。,第77页,谢谢大家,第78页,
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