猿猴免疫缺陷病毒_（大猩猩）具有跨物种以及在人群中传播的能力.pdf

目的 西非大猩猩（Gorilla gorilla gorilla）是猿猴免疫缺陷病毒大猩猩（SIVgor）的天然宿主。本研究旨在确定SIVgor能否传播给人类并在人体内复制。方法 首先将25只68周的NOD/SCID IL-2Rc-/-小鼠通过尾静脉注射移植人造血干细胞入免疫缺陷小鼠中，构建有完整人造血系统的人源化小鼠。然后通过静脉（5只）、直肠（7只）和阴道（5只）三种途径将人源化小鼠暴露于9104TCIU的SIVgor，每2周检测人源化小鼠体内HIV的病毒载量和CD4+T淋巴细胞水平，评估三种暴露途径SIVgor的传播能力、体内复制能力以及对CD4+T淋巴细胞的杀伤力。结果 静脉暴露后，SIVgor在人源化小鼠中高效复制，病毒载量达到与HIV感染的人类相当。直肠和阴道接种病毒也导致人源化小鼠感染SIVgor。尽管SIVgor在人源化小鼠体内高水平复制，但外周血中人CD4+T淋巴细胞水平在三种暴露途径导致的感染中仅略有下降。而三种暴露途径导致的感染对小鼠其他组织中人CD4+T淋巴细胞的影响则略有不同：阴道暴露使阴道中的CD4+T淋巴细胞明显下降，而对其他组织中的人CD4+T淋巴细胞无影响；静脉和直肠暴露对各组织中人CD4+T淋巴细胞水平的影响不大。结论 SIVgor能通过静脉、直肠和阴道途径感染人源化小鼠并在其内高效复制。黏膜相关淋巴组织中SIVgor对CD4+T淋巴细胞的选择性细胞毒性与人类HIV-1感染相似。由于人类仍可因狩猎暴露于SIVs，新的人畜共患病可能再次发生。因此，建立能评估当前和未来人畜共患病的模型系统至关重要。【关键词】猿猴免疫缺陷病毒大猩猩；人类免疫缺陷病毒；CD4+T淋巴细胞；人源化小鼠 DOI：10.19871/ki.xfcrbzz.2023.03.001 【中图分类号】R511SIVgor has the capacity of zoonotic transmission and subsequent spread between humansZou Wei1,Wu Xiaoping1,Chen Xinping2,Liu Li1,Zou Shijie1，John Foster3,J.Victor Garcia3(1.Division of Infectious Diseases,the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Jiangxi Nanchang,330006,China,2.Obsterics and Gynecology Department,the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Jiangxi Nanchang 330006,China，3.Center for AIDS Research,University of North Carolina at Chapel Hill，North Carolina USA,27514)【Abstract】Objective Western gorillas(Gorilla gorilla gorilla)are the natural hosts of simian immunodeficiency virusgorilla(SIVgor).The primary objective of our study is to determine whether SIVgor is capable of being transmitted to and replicating in humans.Method Human hematopoietic stem cells were transplanted into immune-deficient mice via tail veil dose to make the humanized mice reconstituted with a complete human hematopoietic system.Through determining HIV viral loads and CD4+T cell levels in humanized mice,the capacity of SIVgor to be transmitted after intravenous and mucosal exposure,to replicate in vivo and to kill CD4+T cells were evaluated.Result After intravenous exposure,SIVgor replicated very efficiently in humanized mice reaching viral loads comparable to HIV infected humans.In addition,humanized mice were susceptible to SIVgor infection after mucosal exposure.Both rectal and vaginal inoculation led to disseminated infection.However,despite high levels of virus replication these infections resulted in only a modest reduction in the levels of human CD4+T cells in the peripheral blood of humanized mice.However,effects of SIVgor infection on human CD4+T cells in other tissues except blood via three exposure routes were slightly different:CD4+T cells in the vagina decreased significantly after vaginal exposure while those in other tissues were preserved;after venous and rectal exposure human CD4+T cells in all the studied 新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.32 tissues were rarely affected.Conclusion SIVgor was able to infect humanized mice via both intravenous and mucosal routes and then replicate efficiently in the infected animals.Selective cytotoxicity for CD4+T cells in mucosal associated lymphoid tissues recapitulated HIV-1 infection of humans.Since humans are still exposed to SIVs from bushmeat,new zoonoses are likely to occur.Therefore,it is critical to establish model systems that can evaluate present and future dangers.【Key words】Simian immunodeficiency virusgorillas;Human immunodeficiency virus;CD4+T cells;Humanized mice许多非洲灵长类动物携带猿猴免疫缺陷病毒1（simian immunodeficiency viruses，SIVs）。然而，只有黑猩猩和大猩猩可以感染与HIV-1密切相关的SIVs2。HIV-1分为M、N、O和P群四群3-4。来自中非西部的黑猩猩（Pan troglodytes troglodytes）既是导致全球艾滋病大流行的HIV-1 M群的自然宿主，也是只感染喀麦隆少数人的HIV-1 N群的自然宿主5。猿猴免疫缺陷病毒大猩猩（simian immunodeficiency virusegorilla，SIVgor）从野生中非西部大猩猩（Gorilla gorilla）中分离，与HIV-1 O群和P群有亲缘关系5。HIV-1 O群造成非洲中西部1%的HIV-1感染，而HIV-1 P群最初从1名居住在法国巴黎的喀麦隆患者中分离6-8。大猩猩分为两种：中非西部大猩猩和东非大猩猩（Gorilla beringei）2,5,9。只有西部大猩猩可以感染SIVgor9-11。对猿猴免疫缺陷病毒黑猩猩（simian immunodeficiency virusechimpanzee，SIVcpz）、SIVgor和HIV-1的系统发育分析表明：SIVgor很可能起源于SIVcpz5。SIVgor与来自中非西部的黑猩猩携带的SIV（simian immunodeficiency virusechimpanzee Pan troglodytes troglodytes，SIVcpzptt）的亲缘关系比来自东非的Pan troglodytes schweinfurthii携带的SIV（simian immunodeficiency virusechimpanzee Pan troglodytes schweinfurthii，SIVcpzpts）更近7,9。尚不清楚最初SIVgor是如何从黑猩猩传播到大猩猩的6-7,9。SIVgor能在激活的人CD4+T淋巴细胞中复制7,12。然而，野外感染黑猩猩或大猩猩的SIVgor能否感染人并在人体内复制？以及如何传给人类？目前还不明确。此外，关于SIVgor能否在人群中传播以及它们的致病性问题仍有待解决。假设人类最初通过血液感染SIVgor，它们随后能否通过黏膜暴露在人群中传播？它们在体内是否有致病性？是否能诱导CD4+T淋巴细胞耗竭？这些问题的答案能使我们更好地了解艾滋病大流行的起源。由于人类仍有可能通过狩猎感染新的SIV，建立能评估当前和未来危险的模型系统至关重要。但是，直接进行SIVgor的人体感染实验是不符合伦理要求的。人源化小鼠具备功能性人类免疫系统，已被用于体内研究HIV-1发病机制、传播以及潜在的治疗干预措施13-16。本研究将探索SIVgor能否通过静脉或黏膜（直肠和阴道）暴露感染人源化小鼠以及证明SIVgor能否在人源化小鼠体内复制。1 资料与方法1.1 实验动物及分组 遵照得州大学西南医学中心（The University of Texas，Southwestern Medical Center，UTSWMC）动物管理和使用委员会批准的方案，小鼠在UTSWMC动物资源中心饲养，所有小鼠均饲养于恒温22的无特定病原体（SPF）级环境中，光照节律为12h有光，12h黑暗，相对湿度60%70%。饲养68周，体重1825g。将小鼠分为静脉组（5只）、直肠组（7只）、阴道组（5只）和对照组（8只）。1.2 人源化小鼠的构建 人源化小鼠的构建方法如文献17-19所述。本实验将30万50万个从人胎肝分离的CD34+T淋巴细胞（美国高级生物科学资源公司提供）肝内注射到已行射线照射清髓的新生NOD/SCID IL-2Rc-/-小鼠中。外周血中人源细胞的重建通过流式细胞术定期监测。1.3 人源化小鼠中SIVgor感染、复制和传播的分析 用293T细胞转染分子克隆CP2139.287制备SIVgor。用TZM-BL细胞测定病毒滴度。确认小鼠人源细胞重建良好后即通过静脉（静脉组）、直肠（直肠组）和阴道（阴道组）三种途径暴露于9104TCIU的SIVgor13,15,20。每2周通过TagMan HIV定量反转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）检测小鼠血浆病毒载量水平（美国应用生物系统公司7500 Fast型探针）。引物和探针根据SIVgor CP2139.287序列设计（基因库号FJ424866）。TagMan引物序列为：正向引物5-CCC CAA CCC CAT GCA A-3；反向引物5-CAT AGG AGA TTC CCA AAC CCT TCT-3；TagMan探针5-CAC TGC TAT GTT TGT TTC A-3。外周血和组织中人CD4+和CD8+T淋巴细胞水平通过流式细胞术测定13,15,20。SIVgor全身感染通过测定不同组织（骨髓、肝、肺、脾、淋巴结和胸腺）中病毒DNA水平确定（美国应用生物系统公司）。3 新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.3图1 SIVgor在人源化小鼠中的高效复制不会导致外周血CD4+T淋巴细胞耗竭。人源化小鼠通过静脉暴露感染SIVgor（具体操作见材料与方法）。病毒RNA通过实时定量RT-PCR在指定时间点检测血浆中的病毒载量（黑色三角形）获得。每2周采用流式细胞术检测外周血中CD4+T和CD8+T淋巴细胞水平（橙色圆圈和蓝色方块）。黑色箭头表示暴露时间点。2.2人源化小鼠直肠暴露于SIVgor导致高效的病毒传播 7只人源化小鼠直肠内暴露于SIVgor，用以明确SIVgor能否经直肠暴露后传播；结果发现7只小鼠中有4只的外周血可检测到病毒RNA，提示成功感染。3只没有感染的小鼠中1只被再次暴露于SIVgor，第二次直肠暴露后成功感染。尽管病毒复制水平很高，但外周血人CD4+T淋巴细胞的水平未明显下降（图2）。2.3 阴道暴露后人源化小鼠被SIVgor感染 本研究将5只人源化小鼠阴道内接种SIVgor。对这5只小鼠血浆病毒RNA的纵向分析提示：5只暴露的动物都没有显示感染的证据。为确定这种传播缺陷是SIVgor的内在特性，还是需要更高剂量的病毒接种，这些小鼠在第一次阴道暴露76d后，再次暴露于比初始接种量高5倍剂量（4.5105TCIU）的病毒。暴露于高剂量病毒导致4/5的雌性小鼠被感染。这些小鼠血浆中的病毒RNA提示感染。如同静脉和直肠内暴露，SIVgor阴道内暴露导致高血浆病毒载量。此外，如其他两种感染途径，尽管病毒载量较高，阴道内暴露并没有导致外周血中CD4+T淋巴细胞的显著丢失。这些结果表明了SIVgor能通过阴道暴露传播。SIVgor在人源化小鼠中阴道传播的效率低于直肠传播（图3）（P=0.02）。2.4 SIVgor系统性感染人源化小鼠不会导致人CD4+T淋巴细胞耗竭 三种感染途径的人源化小鼠所有组织中都发现了病毒DNA，说明SIVgor可在人源化小鼠体内建立全身感染（图4）。未暴露于SIVgor的小鼠组织细胞中没有发现病毒DNA。采用流式细胞术检测从感染小鼠中分离的单个核细胞。无论感染途径如何，图2 SIVgor通过直肠感染人源化小鼠导致全身高水平病毒复制。a：感染的小鼠显示外周血高水平的病毒复制，但没有明显的CD4+T淋巴细胞消耗。b：直肠感染的小鼠在暴露13周后外周血CD4+T淋巴细胞水平短暂下降。值得注意的是，这是唯一一只人CD4+/CD8+T淋巴细胞水平反转的小鼠。c：小鼠在第二次直肠暴露后被感染。箭头表示的是每次暴露的时间点。每2周分别采用实时荧光定量RT-PCR和流式细胞术检测外周血中的病毒载量（黑三角）和人CD4+T和CD8+T淋巴细胞水平（橙圆圈和蓝方块）。2 结果2.1 SIVgor能在人源化小鼠中高效复制 使用人造血细胞系统重建的人源化小鼠（人源化小鼠包含HIV-1复制所需的所有细胞）研究SIVgor在体内复制和维持感染的能力。将SIVgor静脉注射至5只人源化小鼠中。所有小鼠仅一次暴露于病毒后均被感染。对这些小鼠血浆病毒载量的时间纵向分析显示：病毒复制十分活跃（106拷贝病毒RNA/ml血浆）。5只小鼠中有3只感染超过4个月，它们的外周血CD4+T、CD8+T淋巴细胞和病毒RNA水平如图1所示。在实验期间（多达感染后18周）外周血病毒RNA水平都很高。但是，高水平的病毒复制并没有伴随外周血中CD4+T淋巴细胞的显著下降，表明SIVgor在人源化小鼠中致病力并不强（图1）。abc新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.34 在分析的任何组织中都未发现CD4+T淋巴细胞耗竭。这些结果与外周血纵向分析获得的结果一致，表明人源化小鼠系统性感染SIVgor不会导致人CD4+T淋巴细胞耗竭。最后，本研究分析了被感染的雌性人源化小鼠阴道中CD4+T细胞的水平。与在外周血和其他组织中观察到的结果相反，雌性人源化小鼠阴道中CD4+T淋巴细胞显著减少（P=0.004）（图5）。3 讨论HIV的多样性是其在20世纪80年代感染人类后逐渐进化而来21-22。既往研究发现，HIV-1 N群和P群病毒分别起源于黑猩猩和大猩猩2,5,23-24；而HIV-1 O群图4 对感染小鼠组织中提取的病毒DNA拷贝数（106）的分析提示系统感染SIVgor。总DNA从感染动物所显示的组织细胞中提取，之后进行SIVgor DNA的定量PCR分析。结果显示为病毒DNA拷贝数/106个单个核细胞。虚线表示该方法的检测下限。对照组骨髓、肝、肺、脾和淋巴结（n=3）。静脉组骨髓、肝脏、肺和脾脏（n=3）。静脉注射组淋巴结（n=1）。直肠组骨髓、肝、肺、脾和淋巴结（n=3）。阴道组骨髓、肝脏、肺和脾脏（n=4）。阴道组淋巴结（n=3）。图3 SIVgor可通过人源化小鼠的阴道传播。5只人源化小鼠通过阴道暴露于9104TCIU的SIVgor。这些小鼠暴露后75d都未被感染，图为血浆中未检测到病毒RNA（黑三角）。5只小鼠在第一次阴道暴露后76d，再次暴露于比原剂量高5倍的病毒（45万TCIU）。5只小鼠中有4只再次暴露于病毒后被感染，血浆病毒载量呈现高水平（ac，e）。第5只小鼠（d）连续监测了另外90d后依旧没有感染的证据。值得注意的是，尽管病毒外周复制水平很高，但在感染人源化小鼠中，外周血中CD4+T淋巴细胞水平没有显著下降。箭头表示每次暴露于病毒的时间点。ebdac5 新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.3图5 不同SIVgor感染途径均不会导致除阴道外的系统性CD4+T淋巴细胞耗竭。a：对照组和SIVgor感染的人源化小鼠（蓝色、黑色和红色条分别对应于静脉组、直肠组和阴道组）不同组织中的CD4+T淋巴细胞水平。将来自所示组织的单个核细胞用人特异性抗体染色，并进行流式细胞术分析。8只对照组小鼠的所示组织进行分析。静脉组和直肠组分析了3只小鼠。阴道组每个组织都显示了4只小鼠的数据。b：对照组和SIVgor感染的人源化小鼠（蓝色、黑色和红色条分别对应于静脉组、直肠组和阴道组）中的CD8+T淋巴细胞水平，方法同a。c：SIVgor感染导致雌性小鼠阴道中CD4+T淋巴细胞水平降低。结果来自8只对照小鼠、4只阴道感染小鼠和1只直肠感染小鼠。从小鼠阴道分离单个核细胞并进行流式细胞分析。d：流式细胞分析显示了1只代表性对照小鼠和1只SIVgor感染小鼠的人CD4+T或CD8+T细胞的水平。设门旁边的数字指人CD4+T或CD8+T淋巴细胞在整个T细胞群中的百分比。的起源还不明确，可能来自黑猩猩或大猩猩13,17,20。这些研究结果说明SIV存在跨物种传播。因此，寻找合适的小动物模型研究SIV及其跨物种传播十分重要。多项研究证明人源化小鼠是研究HIV传播、复制和发病机制的重要体系13-16。通过人源化小鼠，本研究探究了如下内容：一是SIVgor是否能跨物种传播至人源化小鼠、是否能在人源化小鼠中建立持续感染；二是SIVgor最初在人类中是否就具有致病性，还是其在适应人类宿主过程中获得了致病性。结果发现，SIVgor可以通过静脉和黏膜暴露感染人源化小鼠，并在小鼠中建立持续感染，从而实现跨物种传播，且病毒复制水平非常高。与阴道组织相比，SIVgor都更易感染直肠组织，并且都能杀死黏膜组织中的CD4+T淋巴细胞26。根据这些观察以及黑猩猩和大猩猩病毒与HIV-1 M、N和P群病毒的相似性，我们假设如下：第一，所有直接从黑猩猩或大猩猩传播来的免疫缺陷病毒很可能在人类中都具有致病性，因为M、N和P群病毒都有致病性5,15,24,27。第二，大猩猩体内的所有反转录病毒都有可能在人体内复制到高滴度。第三，相对于外周血以及其他淋巴组织和非淋巴组织中的CD4+T淋巴细胞，噬R5受体的病毒对黏膜组织中的CD4+T淋巴细胞毒性更强28-30。第四，所有从黑猩猩和大猩猩传播来的病毒可能都更容易通过直肠感染，而不是通过阴道感染。为提高SIVgor的复制能力，本研究中使用的分子克隆是从多个大猩猩中分离的SIVgor序列的一致性序列9。结果发现其能在人源化小鼠中高效复制。另外，感染了与SIVgor密切相关的HIV-1 P群病毒的患者也有很高的病毒载量24,31。因此，本研究得出结论：根据一致序列构建的SIVgor，引入人源化小鼠，构建了研究HIV-1人畜传播的高效模型系统。SIVgor通过三种途径暴露于人源化小鼠后，SIVgor成功传播并在人源化小鼠里建立持续感染，进一步证实了人源化小鼠可用于SIV相关研究。同时，本研究结果支持大猩猩和黑猩猩病毒可能在未来继续转移到人类的结论。在人源化小鼠中测试前病毒克隆的方法将允许新abcd新发传染病电子杂志 2023年6月第 8 卷第 3 期 Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,June 2023,Vol.8,No.36 的自然疫源性病原体的早期功能检测25,32。参考文献1 VAN HEUVERSWYN F,PEETERS M.The Origins of HIV and Implications for the Global EpidemicJ.Curr Infect Dis Rep,2007,9(4):338-346.2 NEEL C,ETIENNE L,LI Y,et al.Molecular Epidemiology of Simian Immunodeficiency Virus Infection in Wild-living GorillasJ.J Virol,2010,84(3):1464-1476.3 HO DD,BIENIASZ PD.HIV-1 at 25J.Cell,2008,133(4):561-565.4 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