雨蛙素诱导大鼠急性胰腺炎高相关性肠道共生菌的变化.pdf

现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 基础研究雨蛙素诱导大鼠急性胰腺炎高相关性肠道共生菌的变化冯戎，赵志芳，王鹤松，赖春晓，张曼曼，袁芳，刘琦【摘要】目的探讨雨蛙素诱导的大鼠急性胰腺炎肠道菌群的影响，挖掘与其发生高度相关的肠道共生菌。方法将雄性 大鼠随机分为造模组（组）和对照组（组）。通过腹腔注射雨蛙素构建大鼠急性胰腺炎模型，收集血清标本检测血清淀粉酶、脂肪酶。收集胰腺组织，采用 染色法观察胰腺组织病理变化。收集大鼠粪便，借助 测序技术研究两组大鼠肠道微生物菌群的变化，并通过与大鼠生理指标表型进行关联分析进而挖掘肠道共生菌。结果雨蛙素诱导的急性胰腺炎可显著升高大鼠血清淀粉酶和脂肪酶活力（），降低胰腺干湿比（），造成胰腺组织结构弥漫性破坏；测序结果显示，两组间肠道菌群存在差异，其中急性胰腺炎组肠道菌群多样性显著降低，属水平上以埃希氏 志贺氏菌属、拟杆菌属和肠球菌属为主要优势属。结论雨蛙素诱导的大鼠急性胰腺炎引起肠道菌群的多样性、丰富度和均匀度降低及物种组成发生显著改变。【关键词】急性胰腺炎；大鼠；肠道菌群；测序；雨蛙素中图分类号：文献标志码：作者单位：贵州省人民医院健康体检中心；贵州省人民医院消化内科；南方医科大学南方医院白云分院消化内科；贵州医科大学附属医院消化内科通信作者：袁芳，：；刘琦，：基金项目：贵州省科技厅基础研究计划项目（项目编号：黔科合基础 ）；贵州省科技厅基础研究计划项目（项目编号：黔科合基础 一般 ）；贵州省科技厅基础研究计划项目（项目编号：黔科合基础 一般 ）牞 牞 牞 牞 牞 牞 牞 牞 牞 牞 牞 牷 牞 牞 牞 牞 牞 牷 牞 牞 牞 牞 牞 牞 牷 牞 牞 牞 牞 牞 【】牞 牗 牘 牗 牘 牞 牞 牗 牘 牞 牗 牘 牞 牞 牞 牞 牞 牞 【】牷 牷 牷 牷 现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 急性胰腺炎（，）是多种原因导致的胰腺炎症性疾病。临床上以急性腹痛和呕吐等为特点，并伴有不同程度的血淀粉酶及脂肪酶升高，激素分泌水平骤降，间接引起胰腺外分泌功能不全（，）。胰腺作为人体必不可少的分泌器官，发生可严重影响胰腺的内分泌和外分泌功能。研究表明，发生时胰腺外分泌功能不全发生率为 ，此时胰腺内分泌功能受损，外分泌部通过有限的调节作用以缓解胰腺炎的进程，但因缺乏局部高浓度胰岛素的营养作用以及高水平的抑制激素、胰高血糖素和生长抑素，导致外分泌胰腺萎缩，致使胰腺内外分泌功能损伤进一步加重。随着人们生活水平的提高及饮食结构的改变，国内 发病率有逐年升高趋势，最新统计显示中国发病率和死亡率为 万和 万，严重威胁人类的生命安全 。另一方面，病程中会引起特定细菌分类群的相对丰度发生变化，进一步导致肠道菌群失衡 。相对稳定的肠道菌群对人体正常免疫状态具有关键作用，其充当肠道的生物屏障，与重症急性胰腺炎的严重程度及预后息息相关 。通过调控肠道菌群可有效减少感染的胰腺坏死、手术干预和器官衰竭发生率，缩短营养治疗时间 。尽管围绕肠道微生物组可能是治疗 的潜在靶标，使用复合益生菌、益生元和合生元等微生态制剂调节肠道菌群进行了广泛研究，但通过调控肠道菌群来改善 症状和预后的效果仍存争议 。寻找调控肠道菌群以改善 的潜在关键靶点菌群，揭示与 发生和预后过程中显著相关的肠道共生菌仍需要大规模和多中心的深入研究，以更好地理解肠道微生物组与 之间的关系及其机制。因此，本研究基于雨蛙素诱导构建 大鼠模型，通过 高通量测序技术探究胰腺炎引起的肠道菌群变化规律，揭示与疾病相关的关键肠道共生菌，进一步明确不同肠道共生菌在 继发感染和预后的重要作用，为从微生态角度防治 提供新思路。材料与方法 动物处理及取样 只 周龄雄性 大鼠购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号 （京）。适应 周后分为 组，分别为对照组（）和急性胰腺炎模型组（）。各组大鼠自由进食饮水，于实验处理前禁食 。对于 组，按照 剂量腹腔注射溶于 生理盐水的雨蛙素 ，每小时 次，连续注射 次。对于 组，腹腔注射为 生理盐水 ，其余处理与 组相同。实验中各组小鼠均正常饮食饮水。所有动物均饲养在温度保持在 和 光 暗环境中。所有动物实验均按照南方医科大学南方医院白云分院动物伦理委员会（）进行。于末次注射后 ，随机选取各组 只大鼠。使用抗凝毛细管刺入大鼠内眦静脉，轻旋以采集 血液于离心管中。采用颈椎脱臼法处死所有大鼠，剖取收集胰腺组织，各组选中有 只大鼠胰腺用于胰腺干湿重检测，其余未选中的大鼠胰腺收集后立刻置于 多聚甲醛溶液中固定，用于病理组织学研究。按压大鼠腹部，收集新鲜排出的粪便进行后续 基因测序。血清淀粉酶和脂肪酶检测血液静置 后，于 离心 ，取上清液用于后续指标检测。按照大鼠淀粉酶活检测试剂盒说明书进行测定，同时按照标准品测定标准曲线，根据样品的 值由标准曲线计算出酶活，单位为（）。血清脂肪酶活测定方法与淀粉酶相同。胰腺干湿重和 染色剖取采集的胰腺组织置于天平上称重后，转移至 恒温烘箱中干燥 后称重。按照同一份胰腺组织干燥前重量与干燥后重量的比值来计算胰腺干湿重比值。胰腺组织经 多聚甲醛固定 后，再进行洗涤和升梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡和包埋、切片和烤干，完成切片制备。将切片以苏木精染色 ，依次洗涤、分化后，再以 伊红染色 ，然后进行脱水、透明，用中性树胶密封，置于电子显微镜下观察胰腺组织的病理变化。基因测序与分析按照 粪便 试剂盒（，）提取粪便总基因组 。使用 分光光度计（，）和琼脂糖凝胶电泳分别检测提取 的浓度和质量。使用带有 样本特异性条形码的正向引物 （）和 反 向 引 物 （）对细菌 序列 区进行 扩增。反应体系包括 （），高保真 聚合酶（），（），（）上下游引物，模板 ，。扩增程序为 预变性 ，随后 个循环，包括 变性 ，退火 ，延伸 ，循环结束后再 延伸 。扩增使用 （，南京，中国），并使用 双链 检测试剂盒（，）进行定量。扩增结束后将扩增产物送往上海派森诺生物科技有限公司进行 平台进行 的双端测序。使用 软件根据官方教程（：）对于测序数据的生物信息学分析 。简而言之，原始序列数据使用 插件进行解码，使用 插件进行引物切割。接着使用 插件对序列进行质量过滤、降噪并去除嵌合体，之后按照 的相似度对序列进行聚类形成扩增子测序变体（）。按照 频数 ，且至少在两个样本中出现的标准滤除 ，以去除偶然误差。将最终获得的 序列与 比对，并使用 构建系统发育树。将 序列与 数据库中的参考序列比对，以获取每个 对应的生物分类学信息。使用 软件，获取各样本在门、科和属三个分类水平上的组成和丰度分布表（各水平仅展示相对丰度 的分类，其现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 余计入“”），并通过柱状图呈现分析结果。采用线性判别分析效应大小（）方法，检测组之间差异丰富的分类菌群（）。按照以最低样本的序列量的 对 丰度表进行随机抽平，使用 软件分别对每个样本计算以下 种多样性指数，包括 多样性指数、指数和 指数，并绘制箱线图比较不同样品之间 的丰富度和均匀度。通过 软件和 软件，使用 距离度量进行 多样性分析以调查样本间的微生物群落结构变化，并通过主坐标分析（）可视化。采用 相关分析计算由物种注释分析得到属水平微生物与血清酶活之间的关系，并绘制热图进行可视化（至少一个指标 ；相关性值 的菌属标记为红色）。统计分析对于血清淀粉酶、血清脂肪酶和胰腺干湿重采用 和 进行统计学分析。采用 正态检验评估正态分布。若数据不符合正态分布，经对数转换后再次进行正态检验。未达到正态分布的数据采用 检验，随后两两比较采用 秩和检验；呈正态分布的数据，采用单因素方差分析，多重比较采用 检验。有统计学差异。结果 雨蛙素诱导大鼠急性胰腺炎雨蛙素诱导的大鼠急性胰腺炎可见胰腺组织和细胞严重损伤。组和 组胰腺组织的苏木精 伊红染色病理切片所见如图 。组大鼠胰腺组织结构清晰，轮廓完整，腺泡细胞排列紧密，未见区域性水肿、出血灶、坏死细胞和炎性细胞浸润。组大鼠胰腺组织结构弥漫性破坏，轮廓缺失，腺泡细胞分散脱落，可见部分点、片状坏死细胞和细胞间质内中性粒细胞浸润。急性胰腺炎引起诸多酶活性显著改变。如图 ，所示，诱导大鼠产生急性胰腺炎表型后极显著的升高了大鼠血清淀粉酶和脂肪酶的活力（）。此外，图 表明诱导大鼠发生急性胰腺炎后，极显著降低了胰腺干湿重比（）。图 胰腺组织病理切片观察和血清酶活水平：组及 组胰腺组织经 染色后放大 倍的镜检图。：分别为两组血清淀粉酶、脂肪酶和胰腺干湿比的结果。急性胰腺炎引起肠道菌群多样性和物种组成变化从 组和 组共 个粪便样本中获得，条 ，平均每个样本 ，条 ，平均读长为 。经过质量过滤、去噪和去除嵌合体后，共得到 ，个高质量的扩增序列，聚类最终得到 个 ，平均每个样品 个 。诱导大鼠发生急性胰腺炎，显著降低了肠道菌群的多样性。如图 所示，与 组相比，组 、和 指数极显著降低（）。表明急性胰腺炎发生后，大鼠肠道菌群结构发生显著变化，其微生物 多样性、丰富度和均匀度降低。基于 算法的 多样性 分析表明，两组样本组内聚集形成一族，表明同一 现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 组内样本的菌群组成相似。两组聚类形成的两族互相远离，显著不同，表明两组样本的菌群组成不同。见图 。对 组和 组的 进行物种注释分析表明，大鼠发生急性胰腺炎改变了肠道菌群的物种组成。所有 共被注释到 个门和 个属分类中。如图 所示，在门水 平 上，组 以 厚 壁 菌 门（平 均 相 对 丰 度 为 ，样本相对丰度分布为 ，下同）、变形菌门（，）和拟杆菌门（，）为主要优势菌门。组主要优势菌门组成与此相似，但诱导急性胰腺炎后，组变形菌门（，）相对丰度显著升高（），而厚壁菌门（，）和 拟 杆 菌门（，）相对丰度显著降低（）。在科水平上（图 ），组以 瘤 胃 菌 科（，）、普雷沃氏菌科（，）和毛螺菌科（，）为主要优势菌科。与 组相比，组瘤胃菌科（，）相对丰度 显 著降低（），而 肠 杆 菌 科（，）和拟杆菌科（，）相对丰度显著升高（），并以此形成 组主要优势菌科。在属水平上（图 ），组相对丰度前三菌属为罕见小 球 菌 属（，）、属（，）和 属（，）。与 组不同，组以埃希氏 志贺氏菌属（，）、拟杆菌属（，）和肠球菌属（，）为主要优势属，而罕见小球菌属（，）、属（，）和 属（，）发生显著降低（）。此外，与对照组相比，组中乳杆菌属（，）丰度显著降低（）。基于 的线性判别分析，组和 组差异富集的菌属组成不同。如图 所示，组中属水平上以罕见小球菌属、属、经黏液真杆菌属、属和 属呈优势分布，对整个菌群组成的差异结构发挥主要影响。急性胰腺炎造模后，组中以埃希氏 志贺氏菌属、拟杆菌属、肠球菌属和狭义梭菌属 为优势富集菌属（图 ）。进一步两组间差异富集的菌属进行遗传进化关系分析，如图 所示，组中差异富集的菌属在进化关系上主要属于变形菌门，而 组为厚壁菌门和拟杆菌门。此外，基于差异富集分析结果，进一步绘制了基于样本分布的埃希氏 志贺氏菌属相对丰度图（图 ）。属水平与急性胰腺炎相关的肠道共生菌在基于 相关性，在属水平上与急性胰腺炎指标进行关联分析，探究肠道共生菌组成特点（图 ）。结果显示，血清淀粉酶和脂肪酶的变化与肠球菌属、狭义梭菌属 、食烷菌属、埃希氏 志贺氏菌属、狭义梭菌属 、艰难杆菌属、拟杆菌属、海生杆菌属、芽孢杆菌属、海源菌属、苏黎世杆菌属和消化链球菌属极显著正相关（，）；与罕见小球菌属、普雷沃氏菌属 、普雷沃氏菌属 、普雷沃氏菌属 、和 属极显著负相关（，）。图 肠道菌群多样性分析：表示对两组样本中识别的 计算 多样性指数；：与 类似，基于识别的 分别计算 和 多样性指数；：为基于 算法，观测各组样本之间距离。，讨论胰腺作为人体唯一可降低血糖的重要器官，可分泌胰岛素和淀粉酶等多种激素和消化酶，对消化和糖代谢水平有着重要的调节作用。而急性胰腺炎是一种可由多种因素诱发的临床常见急腹病症，以胰腺水肿、出血及坏死等炎症反应为主要表现，继而引起胰腺分泌功能紊乱。胰腺分泌的各种消化酶减少，对食物消化吸收功能减退，引起消化系统异常的疾病。胰腺内分泌部细胞受损，导致功能失调甚至丧失，从而使得血糖等调节出现异常，引起糖尿病和糖耐量异常。随着社会经济发展和饮食结构的丰富，急性胰腺炎发病率逐年上升，严重威胁人类安全。尽管现有研究提出了多种发病机制，但尚不能完全解释多种临床表现 。研究表明，的发生和转归过程与肠道菌群失调高度相关，宿主肠道菌群的组成和变化可影响疾病的预后。健康的肠道菌群可以促进宿主的代谢、营养和免疫等生命过程，进而与其机体健康密切联系 。本研究借助 高通量测序技术，解析了诱导大鼠急性胰腺炎后，肠道菌群的多样性和物种组成变化规律。事实上不论是 患者还是小鼠，在发病早期肠道菌群表现为失调和物种多样性下降，其埃希氏 志贺氏菌、肠球菌现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 图 物种组成和差异菌群分析 ：分别为各组肠道菌群在门、科和属水平上物种分类统计（在不同分类水平上，将相对丰度 的分类计入“”）。不同颜色分别代表不同的菌群分类；：基于 方法，检测组之间差异丰富的分类菌群（）；：对 差异物种绘制物种进化分支图，由内至外辐射的圆圈代表了门至属的分类级别。：为两组样本个体水平上，属的相对丰度。图 肠道菌群与血清酶活性的 相关分析：与酶活性指标呈显著正相关的菌属（相关性排序的前 个）。相关性值大小以颜色深度表示，相关性值 的菌属被标记为红色；：与酶活指标呈显著负相关的菌属（相关性排序的前 个）。相关性值 的菌属被标记为红色。，。和肠杆菌科未识别分类的属更为丰富 。本研究发现，诱发大鼠急性胰腺炎后，其肠道菌群多样性、丰富度和均匀度均显著降低；此外，肠道菌群具有以变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门为优势菌门，以埃希氏 志贺氏菌属、拟杆菌属和肠球菌属为优势属的组成特点。的发生会显著升高埃希氏 志贺氏菌属和肠球属等致病菌丰度，降低乳杆菌属和普雷沃氏菌属等益生菌丰度，这类特定肠道菌属的变化与在 发展过程中的肠道菌群研究报道一致 ，。由 诱导形成的肠道菌群和特殊菌属的变化可能进一步加剧了疾病状态下肠道微生态失衡和功能紊乱，从而影响 的预后。对急性胰腺炎已开展了诸多与人类和动物模型肠道菌群宏基因组的研究和分析，并认为 和特殊肠道微生物之间存在强烈关联。肠道菌群中致病菌异常增多以及与共生菌的丰度不平衡，可加重 胰腺组织和肠道损伤，进而导致 恶化 ，。本研究发现，急性胰腺炎发生时，有害菌群的相对丰度显著升高，其中埃希氏 志贺氏菌属、肠球菌和狭义梭菌属 相关性最高。多项与临床指标关联分析的研究表明，埃希氏 志贺氏菌属、肠球菌属和链球菌属与 的发生和严重程度呈正相关 。肠球菌属可参与肠上皮侵袭、菌群与内毒素移位等感染相关通路的调节，这类潜在致病菌的易位可能导致脓毒症和胰腺坏死 ，。埃希氏 志贺氏菌属成员可产生脂多糖（），激活 样受体 ，引发炎症信号传导，还可激活 通路，诱导促炎细胞因子的激活，并引发炎症和氧化损伤 。同时，本研究还表明急性胰腺炎导致有益菌属下降，普雷沃氏菌属 和普雷沃氏菌属 是与 的发生最为负相关的菌属，此外如罕见小球菌属、普雷沃氏菌属 和 属等菌属与 发生呈负相关趋势。这类菌群的变化与炎症细胞因子和肠道屏障指数存在负相关 ，。研究表明，部分普雷沃氏菌可降解包括多种以植物多糖为主的食物，且对维生素 生物的合成具有重要作用，还可通过发酵碳水化合物和释放短链脂肪酸（）来保护胰腺完整性 。增加肠道菌群中这类有益共生菌的数量或通过外在因素调节肠道菌群恢复正常，有助于改善 的预后。例如，饲喂小鼠乳杆菌和双歧杆菌可调节肠道菌群 现代消化及介入诊疗 年 第 卷 第 期 牞 牞 中益生菌数量，增强肠道上皮屏障功能，降低胰腺坏死、脓肿等感染并发症的发生率 。虽然目前仍未发现使用普雷沃氏菌属可缓解 的发展和预后的绝对证据，但本实验所呈现的趋势和结果表明普雷沃氏菌可能是未来治疗 的关键菌属。参考文献 王欣然，钟丽霞，张晓雪急性胰腺炎患者胰腺外分泌功能不全识别及护理的研究进展 中华护理杂志，（）：，（）：，：（），（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：，（）：，（）：，（）：，（）：谭超超，王衡新益生菌对大鼠急性胰腺炎肠道细菌易位感染的调控作用及机制 新疆医科大学学报，（）：，：（收稿日期：）（本文编辑：任钥欣）