野生动物笼舍环境中大肠埃希氏菌对抗生素和消毒剂的抗性分析.pdf

Chinese Journal of Wildlife 2023，44（3）：688-694Chinese Journal of Wildlifehttp：/野生动物笼舍环境中大肠埃希氏菌对抗生素和消毒剂的抗性分析刘青1，郭玲1，仉伟1，赵国策1，朱云芸2，尹占龙1，谢绪昌1*（1.济南市公园发展服务中心（动物园工作部），济南，250031；2.北京动物园管理处，北京，100044）摘 要为评价圈养野生动物笼舍环境中细菌对抗生素和消毒剂的抗性，从大象馆、猛兽馆、鸣禽馆和猿猴馆舍中分离40株大肠埃希氏菌（Escherichia coli）作为指示菌，检测分离菌株对7种抗生素的敏感性和4种消毒剂的最低抑菌浓度（MIC），并对携带的抗性基因进行筛选。结果显示：分离株对复方新诺明和氨苄西林的耐药率较高，分别为 50.0%和 40.0%，其次为头孢噻肟 7.5%，诺氟沙星和庆大霉素耐药率均为5.0%，对美罗培南敏感，主要耐药谱型为氨苄西林加复方新诺明。分离菌株对过氧乙酸消毒剂较敏感，MIC值1 1 600，低于推荐使用浓度。鸣禽馆菌株对消毒剂的敏感性高于其他馆舍。抗性基因共检测到mdfA、tet（A）、qnrS、dfrA、blaTEM、sugE、emrE、qacE 和 qacH 等 29 种。研究结果可为探索野生动物耐药性的产生提供思考方向，为消毒剂的合理使用提供参考，对改善笼舍环境卫生、保障动物健康等具有重要意义。Analysis of Escherichia coli Resistance to Antibiotics and Disinfectants in Wild Animal CagesLIU Qing1，GUO Ling1，ZHANG Wei1，ZHAO Guoce1，ZHU Yunyun2，YIN Zhanlong1，XIE Xuchang1*（1.Jinan Park Development Service Center（Zoo Department），Jinan，250031，China；2.Beijing Zoo，Beijing，100044，China）稿件运行过程收稿日期：2022-11-18修回日期：2022-12-04关键词：野生动物；笼舍环境；大肠埃希氏菌；抗性基因Key words：Wild animals；Cage environment；Escherichia coli；Resistance gene中图分类号：S852.6文献标识码：A文章编号：2310-1490（2023）-03-0688-07DOI：10.12375/ysdwxb.20230325基金项目：北京动物园圈养野生动物技术北京市重点实验室开放课题（ZDK202203）第一作者简介：刘青，女，39岁，高级兽医师；主要从事野生动物疾病防治工作。E-mail：*通信作者：谢绪昌，E-mail：刘青等：野生动物笼舍环境中大肠埃希氏菌对抗生素和消毒剂的抗性分析第3期Abstract：In order to evaluate the resistance of bacteria to antibiotics and disinfectants in captive wild animals，40 strains of Escherichia coli were isolated from beast，elephant，ape and bird cages，the sensitivity of the isolated strains to seven kinds of antibiotics and the minimum inhibitory concentration of four kinds of disinfectants were tested，and the resistance genes carried were screened.The results showed that the isolates had high resistance rates to compound sulfamethoxazole and ampicillin of 50.0%and 40.0%，respectively，followed by cefotaxime of 7.5%，norfloxacin and gentamicin of 5.0%，and were sensitive to meropenem.The sensitivity of strains in bird cages of disinfectants is highter than that of others.A total of 29 kinds of resistance genes were detected，including mdfA，tet（A），qnrS，dfrA，blaTEM，sugE，emrE，qacE，and qacH，which were mostly distributed in the beast and elephant cages.This study provides a direction for exploring the development of drug resistance of wild animals and a reference for the rational use of disinfectants，and is of great significance for improving the environmental health of cages and protecting animal health.动物笼舍环境中存在多种来自外界入侵或者内环境繁殖的细菌，不仅污染动物的生活环境，对动物健康产生潜在的威胁，还可能释放到笼舍外部，通过传播对周围环境产生影响，这一过程也成为耐药菌株在不同动物及不同生态系统间传递的重要途径。因此，做好动物饲养环境卫生、消毒等生物安全措施至关重要。消毒剂作为控制微生物感染和传播的重要方式被广泛应用1，然而消毒剂的长期不合理使用，也会使细菌产生耐药性从而降低杀菌效果2，抗生素和消毒剂之间的交叉耐药性也成为一个被广泛关注的问题3。大肠埃希氏菌（Escherichia coli）广泛存在于动物笼舍的地面、墙面及栖架等处，是流行病学调查和研究的重要指示菌。本研究从4种野生动物笼舍（猛兽馆、大象馆、猿猴馆和鸣禽馆）环境中分离大肠埃希氏菌作为受试菌，测定受试菌对常用7种抗生素的敏感性和 4 种消毒剂的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），并对菌株携带的抗性基因进行筛选，以期为圈养野生动物抗生素、消毒剂的使用提供数据支持，为野生动物耐药性来源的探析提供参考，对改善笼舍环境卫生、保障动物健康及维护公共卫生安全具有重要意义。1材料与方法1.1细菌的分离鉴定2022 年 47 月，对济南动物园大象馆、猛兽馆、鸣禽馆和猿猴馆4个馆舍内的环境样本进行采样，用无菌棉签擦拭笼舍墙壁、栖架和水槽等处，放入含 PBS的 1.5 mL EP管中带回实验室，调整浓度涂布在大肠杆菌显色培养基（ECC）上，37 恒温培养1824 h，挑取蓝绿色单菌落纯化，提取细菌基因组DNA送至北京赛默百合生物科技有限公司测序分析。1.2抗生素药敏试验根据美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐的纸片扩散法检测分离菌株对临床常用7种抗生素的敏感性，结果按照CLSI的标准判定（表1）。1.3消毒剂最低抑菌浓度测定参照CLSI 2017和Zou等4推荐的微量肉汤稀释法，测定过硫酸氢钾复合粉、二氯异氰尿酸钠粉、过氧乙酸溶液和戊二醛癸甲溴铵溶液4种消毒剂对分离菌株的MIC。将筛选出的菌株制备成菌悬液加入到96孔板中，并将消毒剂进行梯度稀释，最高浓度为 1 50，最低浓度为 1 25 600，每个样本重复测定 3次，以抑制细菌生长的最高稀释度作为测试消毒剂的MIC。1.4抗性基因筛选利用Illumina测序平台完成样品的基因组二代建库及测序，将服务器里的数据上传至集群并运行序列拼接，获得菌株抗性基因等信息。2结果2.1大肠埃希氏菌的分离鉴定大肠埃希氏菌在ECC培养基中形成边缘整齐、蓝绿色的光滑菌落，直径 12 mm。将通过特异性 689野 生 动 物 学 报第44卷培养基筛选出的菌株纯化后提取细菌基因组DNA，经 16S rRNA 通用引物进行 PCR 扩增，结果显示，在1 400 bp处有明亮的目的条带（图1）。PCR产物测序后与GenBank中的大肠埃希氏菌序列进行比对分析，若同源性达到 99%以上，则判定菌株为大肠 埃希氏菌。通过鉴定，每个馆舍分别筛选出 10 株 大肠埃希氏菌，共计40株进行后续检测，其中空气中分离3株（7.5%），墙壁隔离网8株（20.0%）、栖架卧床 11 株（27.5）、地面 15 株（37.5%）和水槽食盆 3株（7.5%）。2.2药敏试验结果40株大肠埃希氏菌的耐药表型见表2。分离菌株对复方新诺明和氨苄西林的耐药率较高，分别为50.0%和 40.0%，其次为头孢噻肟 7.5%，诺氟沙星和庆大霉素的耐药率均为5.0%，对美罗培南敏感。菌株的主要耐药谱型为氨苄西林加复方新诺明。大象馆环境中菌株耐药范围最广，对4种药物表现出耐药性，其次是猛兽馆和猿猴馆，鸣禽馆仅对2种药物表现出耐药性。猛兽馆菌株对氨苄西林、复方新诺明和头孢噻肟的耐药率均最高，分别为70%、70%和30%。表1大肠埃希氏菌抑菌圈直径折点Tab.1 Diameter break point of inhibition zone of Escherichia coli药物名称Drug name氨苄西林Ampicillin头孢噻肟Cefotaxime美罗培南 Meropenem庆大霉素Gentamicin阿米卡星Amikacin诺氟沙星Norfloxacin复方新诺明Compound sulfamethoxazole剂量/（g 片-1）Dose10301010301023.75/1.25抑菌圈直径/mm Inhibition zone敏感（S）Sensitive17262315171716中介（I）Intermediate1416232520221314151615161115耐药（R）Resistance13221912141410图1大肠埃希氏菌16S rRNA PCR鉴定结果Fig.1 PCR identification result of 16S rRNA of Escherichia coli注：M.DL2000 DNA Marker；16.大肠埃希氏菌Note：M，DL2000 DNA Marker.1-6，Escherichia coli表2不同馆舍环境中大肠埃希氏菌耐药率Tab.2 Drug resistance rate of Escherichia coli at different cages药物名称Drug氨苄西林Ampicillin头孢噻肟Cefotaxime美罗培南 Meropenem庆大霉素Gentamicin阿米卡星Amikacin诺氟沙星Norfloxacin复方新诺明Compound sulfamethoxazole耐药率（%）Drug resistance rate大象馆Elephant cage20001002030猛兽馆Beast cage7030000070鸣禽馆Bird cage200000050猿猴馆Ape cage5000100050均值Mean40.07.505.005.050.0690刘青等：野生动物笼舍环境中大肠埃希氏菌对抗生素和消毒剂的抗性分析第3期2.3消毒剂最低抑菌浓度4种消毒剂对不同馆舍大肠埃希氏菌的MIC值分布情况见表 3。分离菌株对过氧乙酸较敏感，MIC 值为 1 1 6001 6 400，低于推荐使用浓度 （1 1 000）；过硫酸氢钾复合粉 MIC 值为 1 400 1 1 600，等于或低于推荐使用浓度（1 400）；二氯异氰尿酸钠粉厂家推荐使用的浓度范围较大，35.0%的菌株MIC值达到1 800，高于推荐的最低使用浓度（1 2 000），60%的菌株MIC值为1 1 600，均低于推荐的最高使用浓度（1 200）；戊二醛癸甲溴铵溶液MIC值为1 1 6001 6 400，其中17.5%的菌株MIC值为1 1 600，接近推荐使用的最高浓度（1 2 000）。鸣禽馆菌株对消毒剂的敏感性高于其他馆舍，二氯异氰尿酸钠粉、过硫酸氢钾复合粉和戊二醛癸甲溴铵溶液的最高 MIC 值均低于大象馆、猛兽馆和猿猴馆。2.4抗性基因检测结果抗性基因筛选结果显示，40株大肠埃希氏菌共检测到29种耐药基因，其中抗生素耐药基因有-内酰胺类（blaTEM、blaCTX、blaACT、blaCMY和 blaDHA）、喹诺酮类（qnrB、qnrS）、氨基糖苷类（aadA、aph、aac）、四环素类（tet（A）、tet（D）、磺胺及其增效剂类（sul1、sul2、sul3 和 dfrA）、氯霉素类（cmlA、floR）、磷霉素（fosA）、利福平（ARR）和大环内酯类（mph（A）；消毒剂抗性基因筛选出sugE、emrE、qacE、qacE1、qacF、qacH和qacI；还有多药排外泵mdfA（图2）。所有菌株都携带至少1种抗性基因，猛兽馆分离菌株携带的抗性基因最多，有 28 种，其次是大象馆和猿猴馆，分别有19、11种抗性基因，鸣禽馆分离菌株携带的抗性基因最少，仅检测到5种。所有抗性基因中mdfA的检出率最高，为 92.5%，其次是 tet（A）（45.0%）和 sugE（42.5%）。猛兽馆分离菌株有90.0%携带消毒剂抗性基因，其他 3 个馆舍消毒剂抗性基因携带率为40.0%50.0%。3讨论圈养野生动物存在不同程度的耐药性，Zhu等5对我国13家动物园50种圈养非人灵长类动物中获得的995种大肠埃希氏菌的耐药性进行调查，结果显示83.62%的菌株对至少一种抗生素具有耐药性，多重耐药性占47.94%；陆晓健等6从动物园中分离出69株大肠埃希氏菌，发现大肠埃希氏菌对头孢唑林、四环素和复方新诺明的耐药率分别为41.42%、61.13%和 48.28%；薛原等7对东北虎（Panthera tigris altaica）源大肠埃希氏菌的耐药性进行检测，发现大肠埃希氏菌对氨苄西林、四环素和复方新诺明表3消毒剂MIC值分布情况Tab.3 MIC value distribution of disinfectant消毒剂Disinfectant二氯异氰尿酸钠粉Sodium dichloroisocyanurate过硫酸氢钾复合粉Compound potassium peroxymonosulphate powder戊二醛癸甲溴铵溶液Glutaraldehyde and deciquan sdution brode过氧乙酸溶液Peracetic acid solution厂家推荐使用浓度Recommended concentration1 2001 2 0001 4001 2 0001 4 0001 1 000最低抑菌浓度MIC1 6 4001 3 2001 1 6001 8001 1 6001 4001 6 4001 3 2001 1 6001 6 4001 3 2001 1 600菌株数量Number of strains大象馆（n=10）Elephant cage004604154091猛兽馆（n=10）Beast cage005503082082鸣禽馆（n=10）Bird cage109020550181猿猴馆（n=10）Ape cage016303451163合计（n=40）Total112414210102372317占比（%）Proportion2.52.560.035.05.025.025.057.517.55.077.517.5691野 生 动 物 学 报第44卷的耐药率高达 100.00%、85.12%和 80.24%。抗菌药物的不合理使用是细菌耐药性产生的重要原因，圈养野生动物管理单位对抗菌药物的管理和使用存在差异，这些情况未见相关统计报告。在样本采集单位抗菌药物的使用主要是针对个体动物的抗感染治疗，部分用于小群体细菌性疾病的预防，没有作为促生长剂添加使用，因此推测圈养野生动物细菌耐药菌的产生还存在其他相关因素。Mao等8对北京市环境空气中可培养细菌的细菌组成和耐药性进行研究，表明环境空气中大约1/4的细菌都是多重耐药菌，并指出这可能成为细菌间抗生素耐药性转移的潜在途径。本研究中，从圈养野生动物馆舍环境中分离的菌株对复方新诺明和氨苄西林的耐药率最高，分别为50.0%和40.0%，有研究人员从同一环境下的野生动物粪便中分离大肠埃希氏菌，并对其耐药率进行检测分析，发现耐药率最高的是磺胺类，为41.1%，其次是-内酰胺类，为31.8%9，这提示耐药细菌的环境传播与圈养野生动物细菌耐药性之间存在潜在的相关性，动物的饲养环境可能对圈养野生动物耐药性的产生和发展具有很大的影响，因此开展圈养野生动物环境菌株相关监测工作是十分必要的。细菌耐药性产生的遗传学机制分为染色体介导和质粒介导耐药性。染色体介导耐药性是基因突变产生的10，也叫作固有耐药性，可遗传且较为稳定；质粒介导耐药性即获得性耐药性，是细菌产生耐药性的主要机制。对现代环境细菌菌群的基因组学研究显示，各种环境下存在大量的抗生素耐药基因11，本研究中筛选出了29种耐药基因，携带率较高的是mdfA及四环素类、磺胺类和-内酰胺类。耐药基因mdfA属于主要协同转运蛋白超家族（MFS）成员，不会产生高水平的耐药12，但在过量表达时可能会引起多重耐药13，该基因在生物化学方面有广泛的研究，但临床相关性还缺乏佐证，与本研图2不同馆舍环境中大肠埃希氏菌抗性基因筛选结果Fig.2 Resistance gene screening of Escherichia coli at different cages692刘青等：野生动物笼舍环境中大肠埃希氏菌对抗生素和消毒剂的抗性分析第3期究结果相同的是从美国零售肉中分离的大肠埃希氏菌也有较高的携带率（96.5%）4。四环素类药物近5年在本研究园区没有使用记录，因此未做药敏试验。本研究中有19株菌株携带tet基因，并在4个馆舍均有检出，该基因在环境中广泛分布，推测与其传播方式密切相关，因为大多数tet基因都与结合或移动元素相连，可以在细菌种间或属间转移。目前发现的磺胺类耐药基因主要有sul1、sul2和sul314，dfrA是编码甲氧苄啶耐药二氢叶酸还原酶的抗性基因，在革兰氏阴性菌中已知有30多种15，是引起磺胺及其增效剂耐药的主要因素。超广谱内酰胺酶是革兰阴性细菌对-内酰胺类抗生素耐药的主要机制，可以灭活青霉素、窄谱和广谱头孢菌素等。近年来，临床分离得到的细菌主要携带blaTEM和blaCTX等，在大肠埃希氏菌和肺炎菌中发现的较多，其中blaTEM型检出率总体较高，并具有诸多亚型16，该类基因型在本研究园区环境菌株中携带率同样较高。值得注意的是，检测到 5 株头孢菌素酶耐药菌株，其中猛兽馆 4株（blaCMY2株，blaDHA2株），大象馆1株（blaACT）。头孢菌素酶是革兰氏阴性菌对头孢三代抗生素产生耐药的重要机制，应该引起重视。消毒是控制感染的一项重要环节，可有效阻断病原微生物的传播，这是做好生物安全，预防疾病的关键。但长期使用亚致死浓度的消毒剂易导致细菌对该浓度的消毒剂产生适应效应，逐渐产生染色体或质粒的变异，最终获得遗传物质编码的耐药性并稳定遗传，表现出对消毒剂的抗性。近年来，有学者发现一些菌株对消毒剂的敏感性降低17，同时还发现一些与消毒剂相关的抗性基因，如位于质粒上的QAC基因家族，可以通过结合转移传递耐药性，是消毒剂抗性基因研究中最常见的基因18，包括 qacE、qacE1、qacF、qacG、qacH、qacI和sugE（p）等19，染色体编码基因sugE（c）、emrE、ydgE和ydgF等也特异地介导对QAC的抗药性，并可在大肠埃希氏菌中垂直传播。本研究园区季铵盐类消毒剂没有在环境消毒中广泛使用，但在各馆舍的分离菌株中共检测到 7种相关耐药基因，来源有待进一步研究。消毒剂的规范使用至关重要，本研究中消毒剂的MIC检测结果可作为参考，在实际应用过程中会受有机物、温度和污染物等多种因素的影响2021，因此需要根据实际情况调整使用浓度，以达到较好的消毒效果。参考文献：1 PUANGSEREE J，JEAMSRIPONG S，PRATHAN R，et al.Resistance to widely-used disinfectants and heavy metals and cross resistance to antibiotics in Escherichia coli isolated from pigs，pork and pig carcass J.Food Control，2021，124：107892.2 CHA H S，SHIN D H.Antibacterial capacity of cavity disinfectants against Streptococcus mutans and their effects on shear bond strength of a self-etch adhesiveJ.Dental Materials Journal，2016，35（1）：147-152.3 CAREY D E，MCNAMARA P J.The impact of triclosan on the spread of antibiotic resistance in the environment J.Frontiers in Microbiology，2015，5：780.4 ZOU L K，MENG J H，MCDERMOTT P F，et al.Presence of disinfectant resistance genes in Escherichia coli isolated from retail meats in the USAJ.Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2014，69（10）：2644-2649.5 ZHU Z Q，JIANG S Q，QI M Y，et al.Prevalence and characterization of antibiotic resistance genes and integrons in Escherichia coli isolates from captive non-human primates of 13 zoos in ChinaJ.Science of the Total Environment，2021，798：149268.6 陆晓健，金福源，彭会建，等.圈养野生动物大肠杆菌耐药性的研究 J.养殖与饲料，2018（7）：5-7.LU X J，JIN F Y，PENG H J，et al.Study on drug resistance of Escherichia coli from wild animals in captivity J.Animals Breeding and Feed，2018（7）：5-7.7 薛原，禹霭灵，张彦龙，等.圈养虎源大肠杆菌耐药性和整合子特性分析 J.中国兽医杂志，2016，52（7）：87-89.XUE Y，YU A L，ZHANG Y L，et al.Characterization of integron-mediated antimicrobial resistance among Escherichia coli strains isolated from a captive population of Amur tiger J.Chinese Journal of Veterinary Medicine，2016，52（7）：87-89.8 MAO Y X，DING P，WANG Y B，et al.Comparison of culturable antibiotic-resistant bacteria in polluted and non-polluted air in Beijing，ChinaJ.Environment International，2019，131：104936.9 刘青，雷蕾，李伟，等.圈养野生动物粪便中大肠杆菌的分离鉴 定 和 耐 药 性 分 析J.野 生 动 物 学 报，2020，41（4）：937-945.LIU Q，LEI L，LI W，et al.Isolation，identification and drug resistance analysis of Escherichia coli in feces of wild animals in captivity J.Chinese Journal of Wildlife，2020，41（4）：937-945.10 徐海花，牛钟相，秦爱建，等.细菌耐药性研究进展 J.山东农业大学学报（自然科学版），2010，41（1）：156-160.XU H H，NIU Z X，QIN A J，et al.New research progress of bacterial drug-resistanceJ.Journal of Shandong Agricultural University（Natural Science），2010，41（1）：156-160.11 李显志.抗生素耐药基因古老起源与现代进化及其警示 J.中国抗生素杂志，2013，38（2）：81-89.LI X Z.Ancient origin and modern evolution of antibiotic resistome and their implicationsJ.Chinese Journal of Antibiotics，2013，38（2）：81-89.693野 生 动 物 学 报第44卷12 LI X Z，PLSIAT P，NIKAIDO H.The challenge of efflux-mediated antibiotic resistance in Gram-negative bacteriaJ.Clinical Microbiology Reviews，2015，28（2）：337-418.13 EDGAR R，BIBI E.MdfA，an Escherichia coli multidrug resistance protein with an extraordinarily broad spectrum of drug recognitionJ.Journal of Bacteriology，1997，179（7）：2274-2280.14 BEAN D C，LIVERMORE D M，PAPA I，et al.Resistance among Escherichia coli to sulphonamides and other antimicrobials now little used in manJ.Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2005，56（5）：962-964.15 AMBROSE S J，HALL R M.Novel trimethoprim resistance gene，dfrA35，in IncC plasmids from AustraliaJ.Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2019，74（7）：1863-1866.16 MCMANUS M C.Mechanisms of bacterial resistance to antimicrobial agentsJ.American Journal of Health-System Pharmacy，1997，54（12）：1420-1433.17 GUO W，SHAN K，XU B，et al.Determining the resistance of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae to common disinfectants and elucidating the underlying resistance mechanisms J.Pathogens and Global Health，2015，109（4）：184-192.18 TONG C Y，HU H，CHEN G，et al.Disinfectant resistance in bacteria：mechanisms，spread，and resolution strategies J.Environmental Research，2021，195：110897.19 OGGIONI M R，FURI L，COELHO J R，et al.Recent advances in the potential interconnection between antimicrobial resistance to biocides and antibioticsJ.Expert Review of Anti-infective Therapy，2013，11（4）：363-366.20 吴蕾，沈志勇，崔雪志，等.五种不同种类消毒剂杀菌效果评估 J.家禽科学，2018（3）：16-19.WU L，SHEN Z Y，CUI X Z，et al.Evaluation of germicidal efficacy of five different disinfectantsJ.Poultry Science，2018（3）：16-19.21 孙越，张卫艺，直俊强，等.不同消毒方式对肉鸡生产性能和舍内微生物的影响 J.家畜生态学报，2019，40（11）：65-69.SUN Y，ZHANG W Y，ZHI J Q，et al.Effects of different disinfection modes on the growth performance of the broilers and microbial environment of hen houses J.Journal of Domestic Animal Ecology，2019，40（11）：65-69.694