淫羊藿苷对人根尖牙乳头干细胞增殖及其骨向分化的影响.pdf

天津中医药大学学报 第42卷第4期23年8月424Aug223摘要：目的分析经淫羊藿苷（ICA）刺激后，人根尖牙乳头干细胞（hSCAPs）增殖及骨向分化的作用机制。方法 hSCAPs体外培养至第3代后与不同浓度的ICA进行温育。2 d后，采用qRT-PCR和Western Blotting技术在mRNA和蛋白水平上分别检测hSCAPs的骨向分化相关因子骨保护素（OPG）和核因子-B受体激活因子配体（RANKL）的表达；并通过CCK-8检测hSCAPs受不同浓度的ICA诱导不同时间的增殖情况。结果根尖乳头分离出的hSCAPs在体外培养后，流式染色技术检测表面蛋白CD31、CD90和CD146细胞表达率分别为4.03%、96.18%和95.42%。与对照组相比，ICA的体外刺激显著促进了hSCAPs中OPG的表达（P0.05），降低了RANKL的mRNA转录和翻译（P0.05），促进了hSCAPs的增殖分化（P0.05）；第3天，ICA显著促进了hSCAPs的增殖（P0.05）。当ICA浓度为0.1 mol/L时，其对hSCAPs的增殖促进作用最强，但这种促进作用并未随着ICA浓度的增加而增强。第5天，ICA仍能促进hSCAPs的增殖（P0.05）。见图4。2.5ICA调控hSCAPs中OPG和RANKL的表达体外培养的第3代hSCAPs与不同浓度ICA温育48 h后。与对照组比较，ICA促进了OPG的mRNA转录和翻译以及蛋白表达，但降低了RANKL的基因表达和蛋白表达水平（P0.05）。见图5。2.6ICA对OPG/RANKL比值的影响ICA降低了hSCAPs中的OPG/RANKL比值（图6A）。当ICA浓度为0.1mol/L时，OPG/RANKL比值最大（图6A-B）。3讨论hSCAPs是人根尖牙乳头的多潜能间充质干细胞，能够向成骨细胞、成牙本质细胞、脂肪细胞及成软骨细胞方向分化6。从顶端乳头分离的间充质细胞在体外诱导后形成显著的茜素红染色阳性矿化结节和油红O染色阳性脂滴。这些分离的细胞呈现典型的hSCAPs表型：CD31+、CD90+、CD146+6。CD90和CD146是间充质干细胞标记蛋白，而CD31则是内皮细胞的标记蛋白7。本次研究中，成功分离了hSCAPs，并在体外培养过程中保持了hSCAPs的图 2hSCAPs 成骨、成脂诱导后镜下观察（400）图 3hSCAPs 表面蛋白表达AB注：与对照组比较，*P0.05，*P0.01。图 4不同温育时间 ICA 促进 hSCAPs 的增殖情况注：A.OPG/RANKL比值统计学分析；B.hSCAPs和0.1 mol/L ICA温育48 h后OPG和RANKL蛋白表达。图 6ICA 对 OPG/RANKL 比值的影响OD450nm2.01.51.00.50.05 d3 d1 d*注：A.mRNA水平；B.蛋白水平；与对照组比较，*P0.05，*P0.01。图 5ICA 调控 hSCAPs 中 OPG 和 RANKL 的表达ABGAPDH的mRNA表达倍数蛋白表达AB488天津中医药大学学报 第42卷第4期23年8月424Aug223干细胞特性。还有研究指出，OPG/RANKL信号通路对破骨细胞分化有着重要影响2。RANKL与RANK的结合，使核因子-B（NF-B）等信号通路被激活，进一步促进了破骨细胞的形成与分化。而OPG作为RANKL的拮抗物，能竞争性地结合RANKL，通过抑制RANK-RANKL信号的传递达到影响hSCAPs骨向分化的作用。ICA是淫羊藿的主要活性成分，研究表明，在大鼠正畸牙根吸收模型中，ICA的局部使用减少了磨牙在矫治力作用下的移动，从而起到治疗的效果8。此外，ICA还可通过调控RANKL表达，抑制牙周炎牙槽骨吸收9。然而，ICA对于牙干细胞的作用尚不清楚。本研究检查了ICA对hSCAPs骨向分化的影响。qRT-PCR结果显示在转录水平上，ICA上调了hSCAPs的OPG表达，抑制了RANKL的表达10。鉴于OPG和RANKL在干细胞骨向分化中的作用，ICA可能通过调节hSCAPs细胞中OPG/RANKL比值来影响hSCAPs的分化。qRT-PCR数据还显示，ICA浓度为0.1 mol/L时，其对OPG和RANKL的mRNA调节作用最强。当ICA浓度增加到1 mol/L或10 mol/L时，这种调控作用反而下降。类似的调控模式在ICA对hSCAPs中OPG和RANKL的蛋白表达调控中也被观察到。需要指出的是，ICA对OPG和RANKL在蛋白水平的影响弱于在mRNA水平上的调控，说明OPG和RANKL在蛋白翻译过程中可能还存在其他调控机制。OPG/RANKL比值是骨吸收的决定性因素。不论是OPG低表达还是RANKL过表达，都有可能引起骨质流失11-12。本研究结果显示，ICA的刺激导致hSCAPs中OPG/RANKL比值上升，说明ICA促进了hSCAPs的骨向分化。尤其当ICA浓度为0.1 mol/L时，OPG/RANKL比值达到最高。然而，ICA浓度和hSCAPs骨化程度之间的关系需要更多的研究来解析。本研究还检测了ICA对hSCAPs增殖的影响。结果表明不同浓度ICA刺激3天后，hSCAPs呈现不同程度的增殖，且均明显高于未接受ICA刺激的hSCAPs的增殖（P0.05）。ICA刺激5天后，hSCAPs仍保持增殖能力，但增殖的速度明显慢于前3 d的速度。与其他浓度相比，当ICA浓度为0.1 mol/L时，hSCAPs的增殖能力最强，这个结果和ICA诱导后的hSCAPs中OPG/RANKL比值变化的趋势一致，说明ICA诱导hSCAPs增殖的同时，可能影响随后的骨向分化过程。综上所述，本研究证明从人根尖乳头分离的骨髓间充质的干细胞在体外培养后仍可保持其多向分化的潜能，合理诱导后，均获得成骨及成脂能力。在ICA的刺激下，hSCAPs的增殖能力提高，在mRNA和蛋白水平上促进了OPG的表达，抑制了RANKL的表达。本研究为体外调节hSCAPs的骨向分化以及hSCAPs在临床牙疾病治疗上的应用提供了理论指导和数据支持。参考文献：1SANZ J L，FORNER L，ALMUD魪VER A，et al.Viabilityand stimulation of human stem cells from the apical papilla(hSCAPs)induced by silicate鄄based materials for theirpotential use in regenerative endodontics：a systematicreviewJ.Materials，2020，13(4)：974.2LIU Y，XU Z J，WANG Q Q，et al.Selective regulation ofRANKL/RANK/OPG pathway by heparan sulfate throughthe binding with estrogen receptor in MC3T3鄄E1 cellsJ.International Journal of Biological Macromolecules，2020，161(6)：1526-1534.3王德欣，许战武，裴国献.骨髓间充质干细胞在淫羊藿苷/羟基磷灰石/聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架上的成骨J.中国组织工程研究，2020，24(25)：3974-3980.WANG D X，XU Z W，PEI G X.Osteogenesis of bone mar鄄row mesenchymal stem cells on hydroxyapatite/icariin/poly(lactic鄄co鄄glycolic acid)scaffoldsJ.Chinese Journal of Tis鄄sue Engineering Research，2020，24(25)：3974-3980.4章晓云，李华南，陈跃平.淫羊藿苷防治股骨头坏死分子机制研究进展J.中国骨质疏松杂志，2020，26(11)：1694-1699.ZHANG X Y，LI H N，CHEN Y P.Research progress ofmolecular mechanism of icariin in the prevention and treat鄄ment of femoral head necrosisJ.Chinese Journal of Osteo鄄porosis，2020，26(11)：1694-1699.5ZHOU C C，ZHANG D M，ZOU J，et al.Substrate compli鄄ance directs the osteogenic lineages of stem cells from thehuman apical papilla via the processes of mechanosensingand mechanotransductionJ.ACS Applied Materials&In鄄terfaces，2019，11(29)：26448-26459.6闫丽萍，钱长鑫，马骋，等.电针对神经病理性痛大鼠脊髓环磷酸腺苷、蛋白激酶A以及环磷酸腺苷反应元件结合蛋白通路的影响J.针刺研究，2018，43(12)：788-792.YAN L P，QIAN C X，MA C，et al.Effect of electroacupunc鄄tureof“Weizhong”(BL40)and“Huantiao”(GB 30)on cAMP鄄PKA鄄CREB signaling of spinal cord in rats with neuropathicpainJ.Acupuncture Research，2018，43(12)：788-792.489天津中医药大学学报 第42卷第4期23年8月424Aug223Investigate the effect of icariin on proliferation and osteogenic differentiation of human apicalpapillary stem cellsXIE Erting1，HUANG Bailan2，LI Wenlong3，LI Xiaoyu3（1.Department of Orthodontics，Shenzhen Longhua District Peoples Hospital，Shenzhen 518109，China；2.Department of Periodontology，Shenzhen Longhua District Peoples Hospital，Shenzhen 518109，China；3.Department of Oral and Maxillofacial Surgery，Shenzhen Longhua District Peoples Hospital，Shenzhen518109，China）Abstract：Objective To analyze the mechanism of human apical dental papilla stem cells（hscaps）proliferationand osteo differentiation after stimulation by Icariin（ICA）.Methods The hSCAPs were incubated with differentconcentrations of ICA after cultured in vitro to the third passage for 2 d，and the osteo differentiation related factorosteoprotegerin of hSCAPs was detected at the mRNA and protein levels by QRT PCR and Western blotting，respectively（OPG）and nuclear factor鄄 B receptor activator ligand（RANKL）expression；and the proliferation ofhSCAPs incubated with different concentrations of ICA for different times was detected by CCK鄄8.Results Afterthe isolation of hSCAPs from apical papilla in vitro，the expression of stem cell surface markers CD31，CD90，andCD146 cell expression rate was 4.03%，96.18%，and 95.42%，respectively，as examined by flow staining.Comparedwith the control group，In vitro stimulation with ICA significantly promoted the expression of OPG（P0.05），decreasedthe mRNA transcription and translation of RANKL（P0.05），and promoted the proliferation and differentiation ofhSCAPs（P0.05）.The effect of ICA on the regulation of hSCAPs was the strongest when the concentration was0.1 mol/L.Conclusion The promoting effects of ICA on cell proliferation and bone to differentiation of hSCAPsprovide theoretical guidance for the clinical use of hSCAPs for dental disease treatment.Keywords：ICA；hSCAPs；osteolineage differentiation；cell proliferation7李雪健，王忠山，刘茜，等.釉基质衍生物改性后的牙本质表面对人牙周膜干细胞的影响J.实用口腔医学杂志，2019，35(3)：330-334.LI X J，WANG Z S，LIU Q，et al.The biological effects ofenamel matrix derivative modified dentin matrix on humanperiodontal stem cellsJ.Journal of Practical Stomatology，2019，35(3)：330-334.8ZHANG X L，HAN N N，LI G Q，et al.Local icariin appli鄄cation enhanced periodontal tissue regeneration and relievedlocal inflammation in a minipig model of periodontitisJ.In鄄ternational Journal of Oral Science，2018，10(2)：19.9王兰珠，韩博，于淑婷，等.淫羊藿苷对正畸牙齿移动及牙周组织改建的影响J.空军医学杂志，2018，34(3)：189-191，195.WANG L Z，HAN B，YU S T，et al.Effect of icariin onorthodontic tooth movement and periodontal tissue remodel鄄ingJ.Medical Journal of Air Force，2018，34(3)：189-191，195.10农冬梅，覃雅庆，周华，等.白细胞介素17通过激活p38MAPK信号通路调控人牙周膜成纤维细胞RANKL和OPG的表达J.细胞与分子免疫学杂志，2019，35(6)：545-551.NONG D M，QIN Y Q，ZHOU H，et al.IL鄄17 regulates theexpression of RANKL and OPG in human periodontal liga鄄ment fibroblasts by activating p38MAPK signaling path鄄wayJ.Chinese Journal of Cellular and Molecular Im鄄munology，2019，35(6)：545-551.11钱康，范永升.左归丸联合温和灸调节骨质疏松症模型大鼠OPG/RANKL轴的作用研究J.中华中医药杂志，2018，33(3)：881-885.QIAN K，FAN Y S.Effects of Zuogui Pills combining mild鄄warm moxibustion on OPG/RANKL of osteoporosis modelratsJ.China Journal of Traditional Chinese Medicine andPharmacy，2018，33(3)：881-885.12韩克光，申勇涛，原恺，等.钙螯合羊骨胶原多肽抑制骨质疏松发生的RANK/RANKL/OPG信号机制J.畜牧兽医学报，2018，49(5)：1047-1053.HAN K G，SHEN Y T，YUAN K，et al.Regulation ofRANK/RANKL/OPG signal pathway by calcium chelatedsheep bone collagen peptide in inhibiting the occurrence ofosteoporosisJ.Chinese Journal of Animal and VeterinarySciences，2018，49(5)：1047-1053.（收稿日期：2023-03-08）490