婴幼儿食品中克罗诺杆菌属的分离鉴定及耐药性分析.pdf

现代食品XIANDAISHIPIN201/分析检测AnalysisandTestingdoi:10.16736/41-1434/ts.2023.13.049婴幼儿食品中克罗诺杆菌属的分离鉴定 及耐药性分析Isolation,Identification and Drug Resistance Analysis of Cronobacter spp.in Infant Food 翟平平1，占忠旭1，范宏伟1，章洁1，刘中华2，朱应飞1（1.江西省检验检测认证总院食品检验检测研究院，江西南昌330000；2.武汉轻工大学生命科学与技术学院，湖北武汉430023）ZHAI Pingping1,ZHAN Zhongxu1,FAN Hongwei1,ZHANG Jie1,LIU Zhonghua2,ZHU Yingfei1(1.Jiangxi General Institute of Testing and Certification Food Testing Institute,Nanchang330000,China;2.School of Life Science and Technology,Wuhan Polytechnic University,Wuhan430023,China)摘要：通过传统方法对婴幼儿食品中克罗诺杆菌属进行分离鉴定，共分离得到 43 株克罗诺杆菌属。分别用 7 种抗生素对分离菌株的药物敏感性进行检测，43 株分离株除了对氨苄西林和呋喃妥因（耐药率均为 4.65%）、头孢曲松和头孢噻肟（耐药率均为 2.33%）耐药外，对氯霉素的（耐药率 51.16%）的耐药率最高。关键词：克罗诺杆菌属；分离鉴定；耐药性Abstract：Cronobacter spp.in infant food was isolated and identified by traditional methods,and 43 strains of Cronobacter spp.were isolated.Seven antibiotics were used to test the drug sensitivity of the isolated strains.Among the 43 strains,apart from being resistant to ampicillin and furantoin(with a resistance rate of 4.65%),ceftriaxone,and cefotaxime(with a resistance rate of 2.33%),the resistance rate to chloramphenicol(with a resistance rate of 51.16%)was the highest.Keywords：Cronobacter spp.;isolation and identification;resistance中图分类号：R155克罗诺杆菌属（Cronobacter spp.）由革兰氏阴性食源性病原体组成，广泛存在于婴幼儿奶粉、米粉以及肉类、饮用水、蔬菜中，婴幼儿是该菌感染的高危人群，致死率最高可达 80%1。2017 年报道了某医院检出因克罗诺杆菌感染导致婴幼儿腹泻的病例2，2018 年广东省广州市妇女儿童医疗中心报道 3 例新生儿因克罗诺杆菌感染导致化脓性脑膜炎的病例3，2022 年知名品牌雅培奶粉曝出因克罗诺杆菌污染导致3 名婴幼儿感染的病例4。虽然大多数克罗诺杆菌分离株对常用抗菌剂敏感，但食品样品中的一些分离株已报告有耐药性5。在农业中不适当和不合理使用抗菌剂增加了菌株的耐药性，特别是多重耐药6，这已成为一个公共卫生问题，耐药菌的出现可能导致常规抗生素治疗失败，从而造成更大的死亡风险。为了解婴幼儿食品中克罗诺杆菌属的耐药状况，本实验室对婴幼儿食品样品中克罗诺杆菌属进行分离鉴定，并测定其耐药性，为应对婴幼儿克罗诺杆菌属感染疾病的发生提供有效的治疗参考。基金项目：江西省市场监督管理局科技项目（GSJK202104）；江西省检验检测认证总院科研项目（ZYK202212）。作者简介：翟平平（1987），女，硕士，工程师，研究方向为微生物检验。通信作者：朱应飞（1978），男，本科，高级工程师，研究方向为卫生检验。E-mail：。现代食品XIANDAISHIPIN202/分析检测Analysis and Testing1材料与方法1.1材料与设备实验材料：婴幼儿米粉。实验试剂：缓冲蛋白胨水（Buffer Peptone Water，BPW）、改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤万古霉素（Modified Lauryl Sulfate Tryptose Vancomycin Medium，mLST-Vm）、阪崎肠杆菌显色培养基、胰蛋白胨大豆琼脂（Trypticase Soy Aga，TSA）、阪崎肠杆菌生化鉴定试剂盒（北京陆桥）。多黏菌素 B、万古霉素、环丙沙星、呋喃妥因、氨苄西林、头孢曲松、氯霉素、头孢噻肟，上海源叶；MH 肉汤培养基（Mueller-Hinton Broth）、磷酸缓冲盐溶液（Phosphate Buffer Saline，PBS），北京国药。实验仪器：电子比浊计，法国生物梅里埃公司；恒温培养箱，上海智城分析仪器制造有限公司。1.2试验方法1.2.1增菌培养无菌条件下准确称取100 g待检婴幼儿米粉样品，加到 900 mL 缓冲蛋白胨水（BPW）中，放入 36 生化培养箱培养 18 h，进行前增菌，取 1 mL 上述前增菌液，接种到mLST-Vm管中，放入44 生化培养箱，培养 24 h。1.2.2平板分离无菌条件下取 1 环 mLST-Vm 增菌液，接种阪崎肠杆菌显色平板，放入 36 生化培养箱，培养 24 h，观察结果，挑取可疑菌落接种 TSA 琼脂平板，25 培养 48 h7。1.2.3生化鉴定挑取纯化后的可疑单菌落，制作 0.5 个麦氏浊度菌悬液，按照阪崎肠杆菌生化鉴定试剂盒操作说明进行鉴定，将菌悬液滴加到相应的生化反应孔，置于 36 培养箱培养 24 h，观察结果。1.2.4药物敏感性试验药敏试验依据美国临床与实验室标准化协会（CLSI2022 版）标准规定进行操作，所用抗生素包括氯霉素（苯丙醇类），呋喃妥因（硝基呋喃类），氨苄西林（青霉素类），多黏菌素 B（多肽类），环丙沙星（氟喹诺酮类），头孢噻肟、头孢曲松（头孢类）8。2结果与分析2.1平板分离阪崎肠杆菌显色平板上长出蓝绿色、边缘光滑、形态较小的典型菌落，TSA 琼脂平板上菌落颜色呈现黄色。平板结果见图 1。（a）阪崎肠杆菌显色平板（b）TSA 琼脂平板图 1平板分离菌落形态图2.2生化鉴定挑取阪崎肠杆菌显色平板上的典型菌落，接种TSA 琼脂平板，进行阪崎肠杆菌生化试剂盒鉴定。检验结果为产生黄色素，氧化酶实验阴性，L-赖氨酸脱羧酶阴性，L-鸟氨酸脱羧酶阳性，L-精氨酸双水解酶阳性，柠檬酸水解阳性，D-山梨醇阳性，L-鼠李糖阳性，D-蜜二糖阳性，苦杏仁苷阴性。根据食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验（GB 4789.402016）标准规定，结果判定为阳性。结果见图 2。氨基酸对照 赖氨酸 鸟氨酸 精氨酸 西蒙氏柠檬酸盐 山梨醇 鼠李糖 蜜二糖 蔗糖 苦杏仁苷图 2克罗诺杆菌属生化鉴定结果图现代食品XIANDAISHIPIN203/分析检测AnalysisandTesting2.3耐药性分析药敏试验结果显示，43 株阪崎克罗诺杆菌对氯霉素的耐药率为 51.16%，对氨苄西林和呋喃妥因的耐药率均为 4.65%，对头孢曲松和头孢噻肟的耐药率均为2.33%，对环丙沙星及多黏菌素 B 均敏感。结果见表 1。本研究中用到的抗生素 MIC 折点及 ATCC25922 质控范围见表 2。表 143 株克罗诺杆菌耐药结果表抗生素耐药率/%氯霉素51.16氨苄西林4.65环丙沙星0呋喃妥因4.65多黏菌素 B0头孢曲松2.33头孢噻肟2.33表 2抗生素判定标准表分类抗菌药物MIC 折点/（gmL-1）ATCC25922质控范围/mL敏感中介耐药酚类氯霉素 816 322 8青霉素类氨苄西林 816 322 8硝基呋喃类呋喃妥因 3264 1284 16多肽类多黏菌素 B 2 40.25 2.00喹诺酮类环丙沙星0.250.5 10.004 0.016头孢类环丙沙星 12 40.03 0.12头孢噻肟 12 40.03 0.123结论与讨论克罗诺杆菌属感染发病率较低，但会导致较高的死亡率，国内外特别重视婴幼儿食品中克罗诺杆菌属的污染。FAO/WHO 把阪崎肠杆菌列为婴儿配方奶粉中的 A 类致病菌9。本项目药敏试验结果显示，43 株克罗诺杆菌分离菌株中有 22 株耐药，耐药率为 51.16%，早期报道克罗诺杆菌对各种抗生素敏感，但自 1987 年以来，有关该菌耐药性的报道不断增加10。本研究 43 株克罗诺杆菌对氯霉素的耐药率为 51.16%，对氨苄西林和呋喃妥因的耐药率均为 4.65%，对头孢噻肟和头孢曲松的耐药率均为2.33%。氯霉素类抗生素抗菌谱广，吸收快，体内分布广泛，因而使用广泛，但其耐药性也倍受重视。婴幼儿食用婴幼儿食品存在克罗诺杆菌属感染的潜在风险，克罗诺杆菌属的耐药性要引起重视。相关监管部门、生产企业需对婴幼儿食品生产、运输等各个环节卫生进行严格监管，防止婴幼儿食品受到致病性细菌的污染；临床上一旦发现感染克罗诺杆菌属的病例，应分析其药敏性，规范治疗，避免抗生素的滥用，防止出现超级耐药菌株。参考文献1 杨秋萍，阎彦霏，张艳，等.婴幼儿食品源阪崎克罗诺杆菌的 3 种分型方法 J.中国食品学报，2022，22（5）：358-366.2 龙奇志，何志敏，陈友群，等.一例由阪崎肠杆菌感染引起的婴儿腹泻调查 J.实用预防医学，2017，24（8）：954-956.3 王萍，周伟，贺娟，等.新生儿阪崎肠杆菌脑膜炎 3 例 J.中华实用儿科临床杂志，2018，33（22）：1747-1749.4 陈婷，丁楠.配方奶粉的“病菌风波”J.家庭用药，2022（4）：65.5FEI P，JIANG Y，GONG S，et al.Occurrence，genotyping，and antibiotic susceptibility of Cronobacter spp.in drinking water and food samples from Northeast ChinaJ.Journal of Food Protection，2018，81（3）：456.6YUANHONG L，QIMING C，JUNFENG Z，et al.Isolation，identification and antimicrobial resistance of Cronobacter spp.isolated from various foods in ChinaJ.Food Control，2014，37：109-114.7 国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属（阪崎肠杆菌）检验：GB 4789.402016S.北京：中国标准出版社，2016.8CLSI.Performance standards for antimicrobial susceptibility testingJ.Clinical and Laboratory Standards Institute，2022，39：2-15.9 徐晓可，吴清平，张淑红，等.阪崎肠杆菌LAMP、PCR 与传统检测方法的比较 J.现代预防医学，2013，40（9）：1715-1717.10 裴晓燕，刘秀梅.阪崎肠杆菌的生物学性状与健康危害 J.中国食品卫生杂志，2004，16（6）：550-555.