油茶授粉蜜蜂的培育与应用.pdf

2023，45（4）DOI：10.13836/j.jjau.2023087Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensishttp:/江西农业大学学报 油茶授粉蜜蜂的培育与应用李震1，2，黄强1，2，彭成涛3，张永1，2，钟史清1，2，颜伟玉1，2，曾志将1，2*（1.江西农业大学 蜜蜂研究所，江西 南昌 330045；2.江西省蜜蜂生物学与饲养重点实验室，江西 南昌 330045；3.江西省养蜂研究所，江西 南昌 330052）摘要：【目的】油茶（Camellia oleifera）是我国南方主要食用油料树种，但油茶花授粉效率很低，存在“花多果少”现象，严重影响了油茶果产量，油茶花授粉技术已成为油茶产业中“卡脖子”难题。蜜蜂是最常见授粉昆虫，但由于油茶花中的花蜜和花粉，会引起蜜蜂幼虫腐烂和成年蜜蜂胀肚等中毒症状，因此蜜蜂不愿采集油茶花的蜜粉。本研究拟在育王期间添加油茶蜂蜜来培育对油茶蜜粉具有抗性的蜂王及工蜂后代，旨在提高蜜蜂为油茶授粉效率。【方法】以西方蜜蜂（Apis mellifera）为试验材料，在油茶花期饲养20群蜜蜂，从中选择1群烂子率低的蜂群作为试验群。在第2年春季油菜花期结束后，利用以上烂子率低试验群中蜂王产卵进行育王。育王哺育群分为试验组和对照组，试验组在放入育王框前7 d摇净蜂群中蜂蜜，同时饲喂足油茶蜂蜜；而对照组饲喂足量油菜蜂蜜。然后统计育王王台封盖率，刚羽化出房蜂王初生重、胸重、胸宽、前翅长、卵巢管数及卵巢中卵黄原蛋白（Vg）和储存蛋白110 b（Hex110b）基因相对表达量。另外利用高效液相色谱法（HPLC）测定试验组和对照组王台内剩余蜂王浆中的糖类成分及绝对含量。试验组和对照组蜂王自然交尾成功后，供油茶花期开展授粉试验使用，分别统计试验组和对照组蜂群烂子率。【结果】与对照组相比，试验组王台的封盖率和蜂王出房率显著降低（P0.05）；与对照组相比，试验组王台内剩余蜂王浆中含有甘露三糖、棉籽糖和水苏糖；在油茶花期，试验组蜂群的幼虫存活率和封盖率都显著高于对照组（P0.05）。【结论】在西方蜜蜂育王期间，给蜂群饲喂足量的油茶蜂蜜，所培育蜂王繁殖的蜂群在为油茶授粉期间烂子率显著降低，建议在蜜蜂为油茶授粉中推广应用。关键词：蜜蜂；油茶；蜂蜜；授粉；蜂王培育中图分类号：S892.6；S897+.3 文献标志码：A 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：文章编号：1000-2286（2023）04-0944-08Cultivation and Application of Camellia oleifera Pollination BeesLI Zhen1,2，HUANG Qiang1,2，PENG Chengtao3，ZHANG Yong1,2，ZHONG Shiqing1,2，YAN Weiyu1,2，ZENG Zhijiang1,2*（1.Institute of Honeybee，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China；2.Jiangxi Provincial Key Laboratory of Honeybee Biology and Beekeeping，Nanchang 330045，China；3.Apicultural Institute of Jiangxi Province，Nanchang 330045，China）收稿日期：20230428 修回日期：20230522基金项目：国家自然科学基金项目（32172790）和国家蜂产业技术体系资助项目（CARS-44-KXJ15）Project supported by the National Natural Science Foundation of China（32172790）and the Earmarked Fund for the China Agricultural Research System（CARS-44-KXJ15）作者简介：李震，博士生，orcid.org/0000-0002-1418-9428，；*通信作者：曾志将，教授，博士，博士生导师，主要从事蜜蜂生物学研究，orcid.org/0000-0001-5778-4115，。李震，黄强，彭成涛，等.油茶授粉蜜蜂的培育与应用 J.江西农业大学学报，2023，45（4）：944-951.LI Z,HUANG Q,PENG C T,et al.Cultivation and application of Camellia oleifera pollination beesJ.Acta agriculturae universitatis Jiangxiensis,2023,45(4):944-951.第 4 期李震等:油茶授粉蜜蜂的培育与应用Abstract：Objective Camellia oleifera is the main consumable oil tree in southern China，However，its pollination efficiency is very low，causing more flowers and less fruit，which seriously affects the yield of C.oleifera fruit.Consequently，pollination of oil tea flowers has become a stranglehold issue in the C.oleifera industry.Bees are the most common pollinating insects.However，due to the fact that nectar and pollen in Camellia oleifera flowers will cause poisoning symptoms such as bee larvae rotting and adult belly swelling，therefore，bees are reluctant to collect nectar and pollen from Camellia oleifera flowers.In this study，camellia honey was added during the breeding period to cultivate queens and worker bee offspring resistant to camellia honey powder，aiming to improve the efficiency of bee pollination for camellia.Method Western honey bees（Apis mellifera）were used as the experimental material.Twenty colonies were reared during the blooming period of C.oleifera，from which one colony with low rotten seed was selected as the breeding colony.After the Brassica napus blooming in the following spring，the queen was reared using eggs laid by the queen in the above breeding colony.The honey was cleaned in the breeding colony 7 days before placing in the queen rearing frames.Meanwhile，the treatment group were fed with sufficient C.oleifera honey.The control group were fed with adequate B.napus honey.The capping rate，birth weight，thorax weight，thorax width，forewing length，number of ovarian tubes and relative expression levels of Vitellogenin（Vg）and Hexamerin 110 b（Hex 110 b）in the ovaries were quantified in the two groups of cultured queens.In addition，high performance liquid chromatography（HPLC）was employed to determine the saccharide composition and absolute amount of the remaining royal jelly in the experimental or control queen cells.After the natural mating of the queens in the experimental group and the control group was successful，it was used for pollination test during the flowering period of Camellia oleifera.The rotten rate of the colony in the experimental group and the control group was counted respectively.Result There was a significant decreased in the capping rate of the treatment queen cells and the emergence rate of queen compared with the control group（P0.05）.Compared with the control group，mannose，raffinose and stachyose were found in the residual royal jelly of the experimental group.During the flowering period of C.oleifera，the survival rate and coverage rate of larvae in the experimental group were significantly higher than those in the control group（P0.05）.ConclusionDuring the queen rearing period，feeding the colony with ample amount of C.oleifera honey，the rotten rate was significantly reduced in the colony bred by the queen during pollination of C.oleifera.It is worthwhile to promote the application of honey bees in pollinating C.oleifera.Keywords：honey bee；Camellia.oleifera；honey；pollination；queen rearing【研究意义】油茶（Camellia oleifera）属于亚热带常绿灌木，其果实（种子）经过炒制、压榨及过滤后可得到茶油，茶油已被国际粮农组织列为健康型高级食用植物油1-3。茶油的不饱和脂肪酸含量高达90%，长期食用山茶油可降低患心血管疾病风险、增强免疫力、降低胆固醇并能够防治高血压4-7。由于油茶单一化种植、环境污染和人为破坏植被等因素，油茶林中授粉昆虫的栖息地已被大量破坏，野生授粉昆虫种类和数量越来越少8-9，另外油茶的“自交不亲和”特性进一步限制了结实率和茶油产量10-12，显然油茶花授粉技术已成为油茶产业中“卡脖子”难题。西方蜜蜂（Apis mellifera）和东方蜜蜂（Apis cerana）能采集油茶花的花蜜和花粉，但会出现蜜蜂幼虫腐烂及成年工蜂腹部肿胀，因此蜜蜂表现出为油茶花授粉不积极现象。如何科学利用蜜蜂为油茶花授粉，是油茶花授粉技术中热点，也是难点。开展蜜蜂为油茶花授粉技术研究，对破解油茶花授粉“卡脖子”技术难题具有重要意义。【前人研究进展】赵尚武等13认为油花蜜中的皂苷和生物碱致使蜜蜂中毒，并研发了“油茶蜂乐”解毒剂。给蜜蜂饲喂这一解毒剂后，中毒症状减轻，但是蜜蜂访问油茶花授粉的积极性大幅下降。康雪冬等14首次报道了油茶花蜜中含有大量的寡糖（棉籽糖和水苏糖）是蜜蜂中毒的主要原因，寡糖水解后的半乳糖造成成年蜜蜂代谢障碍，幼虫腐烂，945江 西 农 业 大 学 学 报第 45 卷进而提出分区管理结合药物解毒的防治措施。本课题组前期研究利用高效液相色谱（HPLC）和高效液相色谱四极杆飞行时间质谱（HPLC quadrupole time-of-flight mass spectrometry，HPLC/Q-TOF-MS）技术，检测了油茶花蜜、蜂蜜和花粉中的糖类和生物碱种类及绝对含量。而后基于油茶花蜂蜜、花粉中糖类和生物碱的含量开展西方蜜蜂幼虫和成年工蜂毒理试验。结果表明：油茶蜂蜜中含有高浓度的甘露三糖、棉籽糖和水苏糖是导致西方蜜蜂幼虫和成年工蜂中毒的“元凶”。进一步通过糖类代谢谱揭示3种低聚糖在幼虫和成年工蜂肠道内无法被消化，随着时间延长而逐渐积累，且严重干扰幼虫和工蜂体内葡萄糖合成海藻糖过程，最终导致蜜蜂幼虫和工蜂个体死亡15。尽管专家学者做了一系列研究，但蜜蜂为油茶授粉效率低这一难题仍未得到有效解决。【本研究切入点】虽然提高蜜蜂为油茶授粉的技术很迫切，但目前蜜蜂为油茶授粉的技术仍然存在技术瓶颈，至今仍未能实现大规模化推广应用。本研究根据蜜蜂育王营养生物学原理16-17，来培育对油茶花蜜粉具有一定耐受性蜂王，从而达到在油茶授粉期间降低蜂群烂子率目的。【拟解决的关键问题】针对油茶产业中技术难题，本研究拟通过人工干预育王营养条件，以期培育出对油茶花蜜、粉有一定耐受性蜂王，为科学利用蜜蜂为油茶授粉提供技术支撑。1 材料与方法1.1试验蜂群在油茶花期（2021年10月至12月）将20群西方蜜蜂（Apis mellifera）置于江西星火农林科技有限公司油茶种植园（江西省宜春市，2772N，114198W）内授粉，油茶种植品种为长林18号，花期筛选出一群烂子率较低的蜂群作为第2年的育王供虫群。在第2年春季油菜花期结束后（2022年4月至5月），外界无主要蜜源，试验地点在江西农业大学蜜蜂研究所。利用以上烂子率低试验群控王产卵6 h后，待卵孵化成1 d幼虫后进行移虫育王。育王哺育群分为试验组和对照组，每组3群，每群10张脾，蜂脾相称。试验组在放入育王框前7 d摇净蜂群中蜂蜜，同时饲喂足量油茶蜂蜜；而对照组饲喂足量油菜蜂蜜。试验组和对照组每群在继箱群中插1个育王框，上面36个王台都移有1日龄幼虫。然后统计育王王台封盖率，并取样刚羽化出房蜂王供形态指标和分子试验使用。同时取王台内剩余蜂王浆供成分测定使用。试验组和对照组各取6只刚羽化出房蜂王分别介入12群交尾群中，等到处女蜂王交尾成功后，每组取3只产卵蜂王组成新蜂群。在油茶花期（2022年11月至12月），把准备好的 6群西方蜜蜂（试验组和对照组各3群，每群6张脾，蜂脾相称）运到江西星火农林科技有限公司油茶种植园内进行授粉试验。1.2试剂与耗材色谱级乙腈（美国天地生物试剂公司，AH3801-001），超纯水（北京金克隆生物科技有限公司），16种糖类标准品西格玛奥德里奇（上海）有限公司，纯度99%，NaOH、乙醇和二甲苯（西陇科学股份有限公司），塑料王台及自制育王框，移虫针，刮浆笔，100，1 000 L枪头和10 mL离心管（安徽白鲨生物科技有限公司），总RNA提取试剂盒（北京全式金生物技术有限公司），RNA反转录试剂盒（北京全式金生物科技有限公司），荧光定量试剂盒（北京宝日生生物科技有限公司）。油茶蜂蜜（Camellia oleifera honey，简称COH）购自湖南省常宁市丽水蓝天林业合作社，油菜蜂蜜（Brassica napus honey，简称BNH）取自江西农业大学蜜蜂研究所。1.3试验仪器设备电子分析天平（AUW120D，日本岛津仪器有限公司），低温冷冻离心机、移液枪艾本德（上海）国际贸易有限公司，Thermo ICS 5000液相色谱仪，徕卡切片机、冷冻机和包埋机（赛默飞世尔科技有限公司），微小物体形态测量与数据分析系统软件（青岛中科徕科技有限公司）。1.4王台封盖率，蜂王出房率，刚羽化出房蜂王初生重、胸重、胸宽和前翅长测定记录并统计育王王台的封盖率和蜂王出房率，余下蜂王用液氮处死，解剖蜂王卵巢，并称量或测量蜂王胸重、胸宽和前翅长，每组设置10个生物学重复。封盖率=封盖王台数量人工移虫的数量 100%946第 4 期李震等:油茶授粉蜜蜂的培育与应用蜂王出房率=蜂王出房数量封盖王台数量 100%1.5刚羽化出房蜂王卵巢管数及卵巢中Vg和Hex 110 b基因相对表达量蜂王左卵巢用来制作蜂王卵巢切片，蜂王卵巢切片制作及统计方法参照易瑶的方法18，对照组和试验组各设置 8个生物学重复。蜂王的右卵巢用来提取总 RNA并检测蜂王卵巢中卵黄原蛋白（Vitellogenin，Vg）和储存蛋白110 b（Hexamerin110b，Hex110b）生殖相关基因相对表达量，参照虞龙涛19的方法并做了相应改进。对照组和试验组各设置8个生物学重复。所有的引物均是由上海生工合成。实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）扩增系统包括5 L SYBR Premix ExTaqTM II，0.2 L ROX，0.4 L正向引物（10 mol），0.4 L反向引物（10 mol），3 L RNAse-free水，1 L稀释的模板 cDNA（400 ng/L）。循环条件是 95 45 s，60 1 min，50 升至 90 的 40 个循环（每 6 s 增加1）。在反应结束时，根据每个目的基因和内部参考基因（GAPDH）的CT值，以2-CT方法计算目的基因的相对表达量20。内参基因及目的基因如表1所示。1.6王台内剩余蜂王浆中的糖类成分分析准取称取50 mg王台中剩余蜂王浆（对照组和试验组各设置3个生物学重复）于2 mL离心管中，然后加入700 L的体积分数80%乙醇溶液。在50 下超声提取2 h，然后加入700 L的超纯水，以10 000 r/min转速离心3 min。然后将上清液转移到1.5 mL进样瓶中，采用配备有电化学检测器的Thermo ICS 5000液相色谱仪来分析花蜜样品中的糖类成分。色谱柱：CarboPac PA20（150 mm3.0 mm，4 m）。流动相A：H2O，流动相B：100 mmol NaOH；进样量：5 L，流速为0.5 mL/min，柱温：30。洗脱梯度：09 min，5%流动相B；920 min，5%100%流动相B；2030 min，100%流动相B；3030.1 min，100%5%流动相B；30.160 min，5%流动相B。糖类标准工作曲线见表2。1.7蜂群烂子统计每群蜂选取1张卵脾，用立式隔王栅隔离蜂王后，选取适宜大小区域，分别统计卵个数，然后第6天和第11天统计并记录每群蜜蜂幼虫烂子情况，并计算每群蜜蜂的幼虫存活率和封盖率。幼虫存活率=第6天时统计的幼虫数量首次统计卵的数量 100%（3）幼虫封盖率=第11天时统计的幼虫数量首次统计卵的数量 100%（4）1.8数据统计方法数据的分析均采用SPSS 25.0软件。数据用平均值标准误差（MeanSE）表示。使用单因素方差分析（one way-ANOVA）或独立样本t检验来检验各组之间的差异。组间差异有显著意义的概率水平是P0.05。2 结果与分析2.1不同培育方式对王台封盖率、刚羽化出房蜂王初生重、胸重、胸宽和前翅长影响从表 3 可知，试验组使用油茶蜂蜜培育蜂王，会导致王台封盖率和蜂王出房率显著低于对照组（P0.05）。表1引物序列和GenBank收录号Tab.1Gene-specific primer sequences and GenBank accession number基因名称Gene nameVgHex 110 bGAPDH引物序列Primer sequenceF：CGTGTTCCAGAGGACGTTGAR：ACGCTCCTCAGGCTCAACTCF：AACGTGCCAGGCGCAGTTGTR：TTCACCAGCATGGAGGTTCTGGAF：GCTGGTTTCATCGATGGTTTR：ACGATTTCGACCACCGTAACGenBank收录号GenBank accession numberNM_001011578.1NM_001101023.1XM_026442629.1 947江 西 农 业 大 学 学 报第 45 卷2.2刚羽化蜂王卵巢管数及卵巢中Vg和Hex 110 b基因相对表达量如图 1 所示：与对照组相比，试验组蜂王的卵巢管数、Vg 和 Hex 110 b 基因相对表达量均不显著（P0.05），不同表示差异显著（P0.05），different lowercase indicated no significant difference（P0.05）.图1蜂王卵巢管数（A）、卵巢中Vg（B）和Hex 110 b（C）基因相对表达量Fig.1Number of ovarian tubes（A），relative expression of Vg（B）and Hex 110 b（C）genes in the ovaries of queens 948第 4 期李震等:油茶授粉蜜蜂的培育与应用2.3王台内剩余蜂王浆中的糖类成分分析结果与对照组相比，试验组王台剩余蜂王浆中除了含有相同的葡萄糖、果糖、蔗糖和麦芽糖之外，还含有甘露三糖、棉籽糖和水苏糖，含量分别为（0.0340.03）mg/g，（22.570.58）mg/g，（27.130.36）mg/g（图2）。此外，对照组王台中剩余蜂王浆中特有的糖类为海藻糖，含量为（0.950.03）mg/g。2.4蜂群烂子统计结果试验组使用油茶蜂蜜培育蜂王的蜂群，蜂群内幼虫成活率和幼虫封盖率都显著高于对照组（P0.05）如表4所示。3 结论与讨论蜜蜂访问油茶花后中毒原因是蜜蜂幼虫和工蜂对油茶花蜜和花粉中含有寡糖（甘露三糖、棉籽糖和水苏糖）的分解消化能力有限有关，随着摄入量增加而在体内不断积累寡糖，而不断积累寡糖还会严重限制糖类对蜜蜂能量供给15。双重危害最终导致了蜜蜂幼虫和工蜂的死亡，中毒的症状主要表现为工红框标注部分为油茶蜂王浆特有的甘露三糖、棉籽糖和水苏糖。不同上标字母表示差异显著（P0.05）。The part marked in red is mannintriose，raffinose and stachyose which are unique to C.oleifera royal jelly.Different letters on the bars indicated significant differences（P0.05）.图2王台内剩余蜂王浆中的糖类成分及绝对含量Fig.2The saccharide components and absolute concentrations in the remaining royal jelly from queen cells表4蜂群在油茶花期烂子情况Tab.4Rotten rate of honey bee colonies during the blossoming period of C.oleifera试验次数Number of experiments第1次No.1第2次No.2分组Group对照组试验组对照组试验组幼虫成活率/%Larvae survival rate57.522.67a91.171.57b54.210.64a90.643.33b幼虫封盖率/%Larvae capping rate51.403.69a88.640.89b49.911.05a88.182.67b不同上标字母表示差异显著（P0.05）。Different letters on the bars indicated significant differences（P0.05）.949江 西 农 业 大 学 学 报第 45 卷蜂腹胀和幼虫腐烂。而油茶花蜜酿造成油茶蜂蜜后，蜂蜜中寡糖含量会由于水分蒸发效应进一步上升。而要破除蜜蜂为油茶授粉后中毒“瓶颈”，选育耐受寡糖蜂群是一个突破该瓶颈的新思路。本课题组在前期授粉过程中发现不同蜂群采食油茶蜜、粉后中毒情况有差异：即有的蜂群在烂子症状严重，有的蜂群烂子症状较轻且有部分新蜂出房。这一结果和徐传球21-22观察结果一致。徐传球22以出现烂子症状较轻蜂群作为供虫母群，成功在油茶花期培育出耐受寡糖产卵蜂王。然而油茶在秋冬季节开花，这段时间气温较低，不利于蜂王培育和新王交尾。本研究在春季无蜜源时连续给蜂群饲喂油茶蜂蜜培育蜂王，蜂王所繁育的蜂群工蜂后代在为油茶授粉时烂子率显著降低。这说明育王期间给育王群连续饲喂油茶蜂蜜能增强蜂王及工蜂后代对油茶蜜、粉的耐受能力。蜂王浆中糖类成分主要取决于蜜源植物23，饲喂油茶蜂蜜能培育出耐受油茶蜜、粉的蜂王和工蜂后代。这可能是部分耐受寡糖幼虫被保留下来发育成新蜂王，这一点可以从试验组育王王台的封盖率和蜂王出房率体现出来。同时蜂王这种耐受寡糖能力可能遗传给下一代，但详细机理都还需进一步探索。本研究还发现饲喂油菜所产蜂王浆中含有一种独特的糖类海藻糖，而饲喂油茶所产蜂王浆中则未检测到海藻糖，可能是由于油茶蜂蜜中寡糖干扰了蜜蜂体内葡萄糖合成海藻糖过程15。本研究发现育王期间给育王哺育群添加油茶蜂蜜能够培育出耐受油茶蜜粉毒性的蜂王及工蜂后代，此种蜂王培育方法值得在蜜蜂为油茶授粉过程中推广应用。参考文献 References：1LUAN F，ZENG J，YANG Y，et al.Recent advances in Camellia oleifera Abel：a review of nutritional constituents，biofunctional properties，and potential industrial applications J.Journal of functional foods，2020，75：104242.2王振丽，廖惠宇，胡冬南，等.砧、穗品种对油茶芽苗砧嫁接体形态的影响 J.江西农业大学学报，2021，43（1）：126-135.WANG Z L，LIAO H Y，HU D N，et al.Effects of stock and scion varieties on the morphology of grafted seedlings of Camellia oleifera Abel J.Acta agriculturae universitatis Jiangxiensis，2021，43（1）：126-135.3LEE C P，SHIH P H，HSU C L，et al.Hepatoprotection of tea seed oil（Camellia oleifera Abel.）against CCl4-induced oxidative damage in rats J.Food and chemical toxicology，2007，45（6）：888-895.4LEE C P，YEN G C.Antioxidant activity and bioactive compounds of tea seed（Camellia oleifera Abel.）oil J.Journal of agricultural and food chemistry，2006，54（3）：779-784.5HUANG Q，SHAO L，HE M，et al.Inhibitory effects of sasanquasaponin on over-expression of ICAM-1 and on enhancement of capillary permeability induced by burns in rats J.Burns，2005，31（5）：637-642.6SONG G，LI X，DU J，et al.Preparative separation of conjugated linoleic acids（CLAs）from fermented Camellia oleifera Abel cake by-cyclodextrin（-CD）encapsulation using pH-zone-refining countercurrent chromatography J.Food chemistry，2014，146：437-442.7ZHONG W，SHEN J，LIAO X，et al.Camellia（Camellia oleifera Abel.）seed oil promotes milk fat 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Sinica，2018，51（22）：4387-4394.17李震，易瑶，何旭江，等.全基因组DNA甲基化揭示西方蜜蜂表观遗传印迹 J.江西农业大学学报，2022，44（4）：968-975.LI Z，YI Y，HE X J，et al.Genome-wide DNA methylation revealing epigenetic inheritance marks in honeybee（Apis mellifera）J.Acta agriculturae universitatis Jiangxiensis，2022，44（4）：968-975.18易瑶.移虫日龄对西方蜜蜂（Apis mellifera）蜂王发育的影响 D.南昌：江西农业大学，2020.YI Y.Effect of the age of brood grafted on honeybee（Apis mellifera）queen development D.Nanchang：Jiangxi Agricultural University，2020.19虞龙涛.卵虫源对蜂王及其后代培育