油棕乙酰基酰基载体蛋白硫酯酶EgFATA基因的克隆与功能分析.pdf

文章编号：1674 7054(2023)04 0357 07油棕乙酰基酰基载体蛋白硫酯酶EgFATA基因的克隆与功能分析金柳1，李萌晗1，郑育声2，李东栋1,2（1.海南大学 热带作物学院，海口，570228;2.海南大学 三亚南繁研究院，三亚，572024）摘要：为了探索油棕（Elaeis guineensis Jacq.）EgFATA 基因的生物学功能，解析 EgFATA 基因在油棕中与脂肪酸积累的对应关系，为进一步研究 EgFATA 作用机制奠定基础，从油棕果 cDNA 中克隆得到了 EgFATA 基因的全长序列，经生物信息学分析发现，EgFATA 编码区由 1 155 个碱基组成，可编码 385 个氨基酸，相对分子量为 91.89 kDa，与海藻 PdFATA 亲缘关系最近。在此基础上，构建 EgFATA 的病毒沉默载体并侵染油棕胚状体，RT-qPCR 结果表明，EgFATA 的表达量被下调 85%90%。同时，对基因沉默胚状体进行脂肪酸气相色谱法分析，硬脂酸（C18：0）、油酸（C18：1）、亚油酸（C18：2）的含量均显著性降低。以上结果表明在油棕胚状体中，EgFATA 对 C18：0-ACP、C18：1-ACP、C18：2-ACP 的水解具有催化作用，且对 C18：1-ACP 的催化活性最强。关键词：油棕；乙酰基酰基载体蛋白硫酯酶；油脂代谢调控中图分类号：Q 786 文献标志码：A引用格式：金柳，李萌晗，郑育声，等.油棕乙酰基酰基载体蛋白硫酯酶 EgFATA 基因的克隆与功能分析 J.热带生物学报，2023,14（4）：357363.DOI：10.15886/ki.rdswxb.2023.04.002 油棕（Elaeis guineensis Jacq.）又名油椰子，为原产于热带非洲的棕榈科多年生单子叶木本植物1，在中国主要分布于海南省南部、云南省西双版纳等地区，寿命长、经济价值高，年均单位面积产油量（CPO）高达 3.7 thm22，是世界油料的重要来源之一。油棕果实的中果皮是重要的油脂积累组织，主要产物为棕榈油，棕榈油的用途广泛，在食品加工、轻工业、机械和生物清洁能源等领域均有应用3 6。棕榈油中饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例约为 11。新鲜油棕果肉含有约38%45%的棕榈酸（C16:0），38%44%的油酸（C18:1），10%12%的亚油酸（C18:2）和 3%5%硬脂酸（C18:0），总饱和度约为 50%。提高食用油中油酸（C18：1）等不饱和脂肪酸含量，降低饱和脂肪酸在总油脂中的比例，一直是油棕遗传改良的重要目标之一。乙酰基酰基载体蛋白硫酯酶（fatty acyl-ACPthioesterase,FAT）是一种由核基因编码的可溶性酶，主要作用于酰基和 ACP 间的硫酯键，水解硫酯键、释放 ACP 和游离的脂肪酸，从而停止碳链的延长7 8。目前研究的高等植物中酰基-ACP 硫酯酶根据其分解底物的特异性可分为两类9：一类是FATA（酰基载体蛋白硫酯酶 A），在油棕中主要作用于十八碳链脂肪酸链（C18:X-ACP），但在不同的物种中具体对应关系有较大差异；另一类则是 FATB（酰基载体蛋白硫酯酶 B），主要作用饱和脂酰基-ACP10，对 C16:0-ACP 的催化活性最高11。病毒诱导的基因沉默（virus induced genesilencing,VIGS）利用插入了植物靶基因 cDNA 片段的病毒载体侵染植物，进入植株的病毒在复制 收稿日期：2022 06 03修回日期：2022 09 13基金项目：海南省重点研发项目（ZDYF2022XDNY148）；海南省自然科学基金创新团队项目(2019CXTD397)第一作者：金柳（1995），女，海南大学热带作物学院 2019 级硕士研究生.E-mail：通信作者：李东栋（1975），男，博士，教授.研究方向：热带棕榈作物.E-mail： 第 14 卷 第 4 期热 带 生 物 学 报Vol.14 No.42023 年 7 月JOURNALOFTROPICALBIOLOGYJul.2023和转录过程中能够特异性识别与插入片段序列同源的 mRNA，使其降解从而抑制靶基因的表达12。常规遗传转化验证基因功能时，常需要植物生长至 F2 代甚至 F3 代时才能展开研究，而 VIGS体系的应用，可在较短时间内通过观察植株的表型或生理指标的变化，应用 VIGS 技术对基因的功能进行验证。VIGS 体系的应用特别适合于多年生木本植物中基因的功能鉴定13。在本研究中，油棕胚状体实验材料的选择可以克服油棕遗传转化周期长的困难，加快基因功能的鉴定与研究，同时保持了油棕的物种特性。油棕是热带重要油料作物，产油量较高且用途广泛。然而，作为食用油来说，棕榈油脂肪酸比例的改善一直是油棕的重要育种目标之一14 15。其中，油棕乙酰基-ACP 硫酯酶决定了脂肪酸链的长度和饱和度，被认为对脂肪酸组分的改善有重要的价值。目前，油棕中油棕乙酰基-ACP 硫酯酶的具体功能尚不明确，沉默 EgFATA 基因的表达并测定基因沉默前后脂肪酸种类的变化，能够解析 EgFATA 的具体功能及其在脂肪酸调控中的作用。1材料与方法 1.1材料 试验使用的油棕胚状体由笔者所在的实验室提供、诱导并保存。保存方式：温度28，相对湿度 65%，光照强度 400 molm2s1，28 d 继代培养 1 次，光照 16 h，黑暗 8 h 交替培养。pTRV1、pTRV2 载体由山东农业大学李媛媛老师惠赠；pEASY-T1-Simple-Cloning Kit 试剂盒购自北京全式金公司；大肠杆菌 DH5 感受态细胞、农杆菌 EHA105 感受态细胞购自上海唯地生物公司。1.2EgFATA 的克隆和生物信息学分析 参照NCBI 公布的基因序列（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/XM_029265988.1?report=fasta），使 用Primer Premier 5 软件设计带接头的 FATA 引物(F:atgaattcATGCTGAAGGGGTACCACGTG；R：at-gagctcTCATCGAACCAACTTCCTCCA），酶切位点 为 Ecor1 和 Spe1，以 实 验 室 保 存 的 油 棕 果cDNA 为克隆模板，使用诺唯赞的 Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase 试剂盒进行扩增，按照说明书进行操作，其中，退火温度为 57，延伸时间为 2 min。使用 Cycle-Pure Kit 试剂盒纯化PCR 产物，将目的片段37、30 min 构建到pEASY-T1 Simple Cloning Kit 中间载体上，用热激法转化至 大 肠 杆 菌 感 受 态 DH5，挑 取 单 菌 落 进 行PCR 验证，重组载体酶切鉴定、测序均验证无误后，保藏菌种。对 EgFATA(XP_010927699.1)的蛋白序列使用 ProtParam 软件分析理化性质，使用 ProtScale对 EgFATA 蛋白序列的疏水性进行预测；对FATA 使用 TMHMM 蛋白跨膜结构区分析；使用MEGA 7.0 对 NCBI 数据库对检索出的 EgFATA的同源蛋白聚类分析，构建系统发育进化树。1.3 EgFATA 的 VIGS 载体构建 以测序正确的 EgFATA-pEASY-Blunt 质粒为模板，于 NCBI在线选取 EgFATA 200500 bp 的特异性片段，使用 Primer Premier 5 软件设计 EgFATA 特异性片段的引物(F:atgaattcTTGGATGGGTCCTCGAAAGC;R:atgagctcGTGCGGCCCCGATTTATT)，使用Cycle-Pure Kit 试剂盒纯化 PCR 产物后，通过 Takara T4DNA Ligase 试剂盒 22、1 h 连接目的片段与线性化 pTRV2 载体，测序无误后使用冻融法转化至EHA105 农杆菌感受态中，甘油法保藏菌种。1.4VIGS 侵染油棕胚状体 于含有 Kana+、Lif+的液体培养基（LB）中，28、220 rmin1培养pTRV1-EHA105、pTRV2-EHA105、pTRV2-EgFA-TA-EHA105 农杆菌菌种，用分光光度计调节菌液OD600=0.5。混合 pTRV1-EHA105 和 pTRV2-EHA-105 菌液作为病毒空白对照，混合 pTRV1-EHA105与 pTRV2-EgFATA-EHA105 作为实验组，离心收集农杆菌菌体后，加入 MSO 液体培养基悬浮，保持菌液 OD600=0.5。使用针扎、浸泡的方式侵染油棕胚状体，浸泡 5 min 后，将胚状体放置在灭菌后的滤纸上，吸取多余菌液，之后转移至共培养固体植物培养基（WPM）中(含 20 mgL1的 AS（乙酰丁香酮）和 100 mgL1 的半胱氨酸)，19 暗培养2 d。无菌水清洗胚状体后将其转移到继代培养基中，在 28 温度下培养。期间淘汰长势不好以及死亡的胚状体，培养 12 d 后获得成功存活下来的转基因胚状体，用于后续实验（qRT-PCR 和 FAs）分析。1.5胚状体 RNA 的提取和表达量分析 使用诺唯赞公司的多糖多酚植物 RNA 提取试剂盒，提取358热 带 生 物 学 报2023 年油棕胚状体 RNA，液氮研磨样品后，不可再次冻融，严格按照说明书操作。分别计算野生型、对照组（病毒组）和实验组胚状体 RNA 浓度，保证RNA 加入量相同，反转录获得 cDNA。以油棕保守基因 Eg-actin 为内参，根据EgFATA 和 Eg-actin 基因分别设计荧光定量引物(qRT-FATA-F：TATCGCCAATCTCCTCCAG；qRT-FATA-R：GTTCATCATCACCCACTTGC；qRT-actin-F：TGGAAGCTGCTGGAATCCAT；qRT-actin-R：TCCTCCACTGAGCACAACGTT)使用 TaKaRaTD600 荧光定量PCR 仪和2xQ3 SYBR qPCR MasterMix（22204）试 剂 盒 进 行 实 时 荧 光 定 量，检 测EgFATA 基因在实验组和病毒对照组胚状体中的表达量，反应体系（20 L）：上下游引物各 0.5 L，cDNA 1 L，2xQ3 SYBR qPCR Master Mix（Universal）10 L，ddH2O 8 L；PCR 反应程序为预变性 95；循环反应 95 10 s、60 30 s，40 个循环；溶解曲线采集 95 15 s、60 60 s、95 15 s，实验中每个样品设置 34 个平行，严格按照说明书操作。1.6VIGS 侵染后油棕胚状体中脂肪酸含量分析 实验用的枪头、Ep 管进行 121、20 min高压灭菌处理，无水乙醇灼烧研钵与研磨棒，冷却后于研钵中研磨等量胚状体，油脂瓶收集样品后，使用 V氯仿V甲醇=21 的提取液萃取 23 次，收集上清液经无菌水与 0.9%NaCl 溶液漂洗后，氮吹仪吹干获得油脂，加入 2.5%浓硫酸的甲醇溶液(V/V)，并加入 10 g 的 C17 烷酸标准品，80 水浴 2 h 进行甲酯化，氮吹仪吹干后，加入适量正己烷溶解，漩涡混匀后加入 2 mL 0.9%NaCl 溶液，静置、离心后取上层正己烷有机相用于高效气相色谱分析。2结果与分析 2.1 EgFATA 的克隆与生物信息学分析 以油棕果 cDNA 为模板，PCR 方法扩增获得 EgFATA基因的 CDS 区 1 155 bp，1.2%琼脂糖凝胶回收后，构建 EgFATA-pEASY-Blunt 载体，并对单菌落PCR 检测，条带大小与预期一致，测序结果与 NCBI公布的参考序列相同。使用 ProtParam 对 EgFATA进行理化性质分析，结果表明：EgFATA 的编码区由 1 155 个氨基酸的序列组成，编码 385 个氨基酸，相对分子量为 91.89 kDa。通过 NCBI 在线网站的 BLAST 功能，比对 EgFATA（XP_010927699.1）蛋 白 的 相 似 序 列，结 果 表 明：EgFATA 与 海藻 PdFATA（XP_008794588.1）、椰 子 CnFATA（AZZ09172.1）、凤梨 AcFATA（XP_020106065.1）、香蕉 MaFATA（XP_009411855.1）、野蕉 MbFATA（THU68832.1）有极高的同源性，分别为 94.28%、91.13%、92.76%、89.76%、89.42%（图 1-A）；为进一步确定油棕 EgFATA 与其他物种间的亲缘关系，于 NCBI 在线网站 BLAST 中继续筛选其他物种的 FATA 基因，使用 MEGA 7.0 构建系统进化树，结果表明，EgFATA 与海藻 PdFATA 蛋白相似度最高，亲缘关系最近（图 1-B）。2.2EgFATA 的 VIGS 载体构建 设计带接头的引物，以 EgFATA-pEASY-Blunt 质粒为模板，PCR扩增方法扩增获得 EgFATA 基因的特异性片段247 bp，1.2%琼脂糖凝胶回收后，与经 Ecor1 和Sac1 双酶切的 pTRV2 线性化载体连接并进行酶切鉴定（图 2），测序结果表明，EgFATA-pTRV2基因沉默载体构建成功，使用冻融法将其转入EHA105 农杆菌感受态中。2.3EgFATA 基因的沉默（VIGS）分别提取基因沉默实验组、空白病毒对照组的胚状体RNA，反转录为 cDNA，以 Eg-actin 为内参基因，进行实时定量 PCR 检测，结果显示，与病毒对照组相比，基因沉默实验组不同株系的 EgFATA 表达量均出现极显著性下调，说明 VIGS 体系成功将不同株系中的 EgFATA 基因的表达量下调了 85%90%（图 3）。2.4沉默胚状体中油脂含量变化 分别提取实验组、空白病毒对照组和野生型的胚状体总油脂，经甲酯化处理后、进行高效气相色谱分析。结果表明，与野生型和空载病毒对照相比，沉默EgFATA 基因的油棕胚状体脂肪酸含量发生变化，C18：0 和 C18：1 极显著性下降，与 C18：0 相比，C18：1 下调的程度极显著；除此之外，C18：2 显著性下降，其他种类的脂肪酸未呈现显著性变化（图 4）。该结果说明，下调 EgFATA 基因的表达，抑制了油棕胚状体中十八烷基脂肪酸的合成代谢，从而使 C18：0、C18：1、C18:2 的含量下降，即油棕胚状体中 EgFATA 的催化底物为 C18：0-ACP、C18：1-ACP、C18:2-ACP，其中对 C18：1-ACP的偏好性更强。第 4 期金 柳等:油棕乙酰基酰基载体蛋白硫酯酶 EgFATA 基因的克隆与功能分析359 EgFATA/1-362PdFATA/1-365CnFATA/1-360AcFATA/1-290MaFATA/1-365MbFATA/1-171111116265616560EgFATA/1-362PdFATA/1-365CnFATA/1-360AcFATA/1-290MaFATA/1-365MbFATA/1-1716363621666112813112655131126EgFATA/1-362PdFATA/1-365CnFATA/1-360AcFATA/1-290MaFATA/1-365MbFATA/1-17112913212756132127194197192121197171EgFATA/1-362PdFATA/1-365CnFATA/1-360AcFATA/1-290MaFATA/1-365MbFATA/1-171195198193122198260263258187263EgFATA/1-362PdFATA/1-365CnFATA/1-360AcFATA/1-290MaFATA/1-365MbFATA/1-171261264259188264326329324253329EgFATA/1-362PdFATA/1-365CnFATA/1-360AcFATA/1-290MaFATA/1-365MbFATA/1-171327330325254330362365360290365Phalaenopsis equestris99845231868932568099100945994991000.020Dendrobium catenatumApostasia shenzhenicDioscorea cayenensis subsp.rotundataDioscorea alataAsparagus officinalisIris tectorumMusa acuminataAnanas comosusElaeis guineensisPhoenix dactyliferaPunica granatumMorus notabilisCinnamomum micranthum f.kanehiraePapaver somniferumMacleaya cordataZingiber officinalePanicum virgatumOryza sativa Japonica GroupAB 图 1 EgFATA 蛋白的生物信息学分析A：EgFATA 蛋白的多重序列比对分析 B：EgFATA 系统发育进化树。360热 带 生 物 学 报2023 年3讨论研究结果表明，EgFATA 氨基酸序列与海藻、椰子、凤梨、香蕉、野蕉同源性极高，在 89%以上，说明 FATA 蛋白在不同物种中具有高度的保守性。系统进化树分析发现，EgFATA 与 PdFATA亲缘关系最近，二者在功能上可能存在相似性。对沉默 EgFATA 油棕胚状体进行 RT-qPCR 实验、油脂的提取与脂肪酸分析，与野生型和空载病毒对照组胚状体比较发现，沉默油棕胚状体中脂肪酸的种类未发生改变，但含量发生了显著性变化，如 C18：0、C18：1 和 C18：2 均显著性降低，说明EgFATA 表达量的下调影响了十八碳链脂肪酸（C18：X）的积累。EgFATA 是 影 响 油 脂 积 累 的 重 要 基 因，Kaczmarzyk16和 Tan 等17认为，多数植物 FATA基因功能上具有相似性，即对 C18：X-ACP 具有催化活性，且对 C18:1-ACP 的偏好性更高，这与笔者的研究对象 EgFATA 功能相似，下调油棕胚状体中 EgFATA 基因的表达量后，C18：0 和 C18：1 分别下降 75%、90%，C18：1 下调程度更大，与先前报道相符。然而，文献报道显示有些植物中的FATA 基因对 C18:0-ACP 催化活性更强，如油菜中过表达山竹 GmFATA 基因会使转基因油菜中C18：0 的含量显著提升约 20%18。除此之外，其他物种中 FATA 基因还存在不同的对应关系，Moreno-Prez 等发现沉默拟南芥 AtFATA 基因后，其种子的亚麻酸（C18:3）和芥酸（C22:1）含量显著性增加19。常见的油料作物如油菜、花生、大豆、芝麻等，基因的功能研究均存在实验周期长、转化效率低、操作难度大、研究成本高的问题，因此以往的研究多在拟南芥、大肠杆菌、酵母菌20等模式物种中开展，本研究选择油棕胚状体作为实验材料，缩短了实验周期，并且保留物种特性，功能研究更为便捷。与以往研究报道不同的是，本次发现EgFATA 表达量的下调对 C18：2 的积累也产生了 M1M2M3M4M53 000 bp1 000 bp250 bp 图 2 EgFATA-pTRV2 重组质粒的酶切鉴定注：M1M4 为酶切后的 EgFATA-pTRV2 重组质粒M5：DL5000 Marker。Ptrv205*101520相对表达量FATA-1FATA-2FATA-3FATA-4 图 3 油棕胚状体中实验组及病毒对照组 EgFATA 基因表达量的检测注：*：P0.05 为显著性差异；*：P0.01 为极显著性差异。脂肪酸种类*WTPtrv2FATAC12:0010203040脂肪酸的相对含量/%C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 C20:2 C22:0 C22:1 C24:0 图 4 EgFATA 基因沉默胚状体中脂肪酸相对含量的变化WT：野生型胚状体；pTRV2：病毒对照组胚状体；FATA：实验组胚状体。*：P0.05 为显著性差异；*：P0.01 为极显著性差异。第 4 期金 柳等:油棕乙酰基酰基载体蛋白硫酯酶 EgFATA 基因的克隆与功能分析361影响。在分析沉默 EgFATA 的转基因胚状体中脂肪酸的含量发现，C18：2 约被下调 51%，脂肪酸去饱和酶（12 Fatty acid desaturase,FAD2）是合成C18：2 的重要基因，催化 C18：1 向 C18：2 的转变21。本实验中 C18：2 的下调一方面可能是由于合成底物 C18：1 的减少，影响了 C18：2 的积累；另一方面 EgFATA 可能对 C18：2-ACP 也具有催化活性，因此 C18:2 的积累可能受到 EgFATA 与 EgFAD2的共同调控。油棕 EgFATA 功能的研究探索了 EgFATA 基因的生物学功能，解析了 EgFATA 基因在油棕中与脂肪酸积累的对应关系，并为进一步研究EgFATA 调控油脂代谢的分子机制奠定了基础。参考文献：1 冯美利,曾鹏,刘立云.海南发展油棕概况与前景J.广西热带农业,2006（4）:37 38.2 NGANDOEBONGUE G F,AJAMBANG W N,KOONAP,et al.Oil palmM/Technological Innovations in Ma-jor World Oil Crops,Volume 1.New York:Springer,2012,79(2):165 200.3 SYLVIE,WECKX,DIRK,et al.Tissue Culture of OilPalm:Finding the Balance Between Mass Propagationand Somaclonal Variation.J.Frontiers in plant science,2019,10:722.4 高尚士.高产油料树油棕J.林业科技通讯,1994（11）:41.5 ITHNIN M,XU Y,MARJUNI M,et al.Multiple locusgenome-wide association studies for important economictraits of oil palm J.Tree Genetics&Genomes,2017,13（5）:103.6 陈张彬.甘蓝型油菜中 5 个脂酰-ACP 硫酯酶基因的克隆及表达分析D.长沙:湖南农业大学,2018.7 元冬娟,吴湃,江黎明.高等植物的酰基-ACP 硫酯酶研究进展J.中国油料作物学报,2009,31（1）:103-108.8 王凯.木姜子 FATB 基因的克隆和功能分析D.杨凌:西北农林科技大学,2019.9 SALAS J J,OHLROGGE J B.Characterization of sub-strate specificity of plant FatA and FatB acyl-ACP thioes-terases 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年Cloningandfunctionalanalysisofthefattyacyl-ACPthioesteraseEgFATAinoilpalmJIN Liu1,LI Menghan1,ZHENG Yusheng2,LI Dongdong1,2（1.School of Tropical Crops,Hainan University,Haikou,Hainan 570228;2.Sanya Nanfan Research Institute,Sanya,572024,China）Abstract：Oil palm(Elaeis guineensis Jacq.)is an important tropical palm with high oil production.Fatty acyl-ACP thioesterase(FAT)is the key enzyme for hydrolysis of acyl and ACP and termination of carbon chainextension.The oil palm FATA family mainly acts on eighteen-carbon chain fatty acids(18:X-ACP),but thespecific hydrolysis substrates and preferences are unknown.In this study,the full-length sequence of theEgFATA gene was first cloned from oil palm fruit.Bioinformatics analysis indicated that the EgFATA codingregion consists of 1 155 bases and can encode 385 amino acids with a molecular weight of 91.89 kDa,and ismost closely related to the alga PdFATA.A viral silencing vector for EgFATA was constructed and theninfected the embryoids of oil palm,and RT-qPCR results showed that the expression of EgFATA was downregulated by 85%-90%.At the same time,fatty acid GC analysis of the silenced embryoids showed that thecontents of stearic acid(C18:0),oleic acid(C18:1)and linoleic acid(C18:2)were significantly reduced.Theaforesaid results indicated that EgFATA had catalytic effect on the hydrolysis of C18:0-ACP,C18:1-ACP andC18:2-ACP in the oil palm embryoids,with the highest catalytic activity observed in the hydrolysis of C18:1-ACP.This study initially explored the biological functions of EgFATA genes in oil palm,providing atheoretical basis for further exploration of the molecular mechanisms of EgFATA in regulation of lipidmetabolism.Keywords：oil palm；fatty acyl-ACP thioesterase；regulation of lipid metabolism(责任编辑：叶静)第 4 期金 柳等:油棕乙酰基酰基载体蛋白硫酯酶 EgFATA 基因的克隆与功能分析363