新生大鼠海马神经元原代细胞培养方法改良及鉴定.pdf

论 著第 36 卷第 17 期医学信息Vol.36 No.172023 年 9 月Journal of Medical InformationSept.2023基金项目：贵州省科技厅科技计划项目（编号：黔科合支撑20192796 号）作者简介：岳宇娇（1987.8-），女，贵州遵义人，硕士，主治医师，主要从事神经康复专业临床及基础研究工作通讯作者：徐平（1963.9-），男，贵州遵义人，博士，主任医师，主要从事认知障碍方向的基础研究工作新生大鼠海马神经元原代细胞培养方法改良及鉴定岳宇娇1袁徐 平2渊遵义医科大学附属医院神经康复科1袁神经内科2袁贵州 遵义563000冤摘要院目的探索一种稳定尧经济尧实用的SD新生鼠海马神经元的原代培养方法遥方法选用出生24 h内的SD新生鼠袁分离新生大鼠双侧海马组织制备海马组织单细胞悬液袁采用DMEM/F12+2%B27培养体系维持培养袁观察海马神经元形态变化袁取培养5 d的海马神经元原代培养细胞袁采用微管相关蛋白2渊MAP2冤免疫荧光染色鉴定神经元纯度遥结果提取的海马神经元细胞存活率高袁生长状态良好曰MAP2免疫荧光鉴定神经元纯度达渊95.20依1.50冤%遥结论本培养方法在保证海马神经元细胞纯度及细胞活性的同时袁降低原代神经元培养成本袁是一种稳定尧经济尧实用的海马神经元原代培养方法遥关键词院海马曰神经元曰原代曰培养曰微管相关蛋白2中图分类号院R741文献标识码院ADOI院10.3969/j.issn.1006-1959.2023.17.021文章编号院1006-1959渊2023冤17-0111-04Improvement and Identification of Primary Cell Culture Method of Neonatal Rat Hippocampal NeuronsYUE Yu-jiao1,XU Ping2(Department of Neuro-rehabilitation1,Department of Neurological2,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi 563000,Guizhou,China)Abstract：Objective To explore a stable,economical and practical primary culture method of hippocampal neurons in SD neonatal rats.Methods SDneonatal rats within 24 hours after birth were selected.The bilateral hippocampal tissues of neonatal rats were isolated to prepare single cellsuspension of hippocampal tissues.The DMEM/F12+2%B27 culture system was used to maintain culture.The morphological changes of hippocampalneurons were observed.The primary cultured cells of hippocampal neurons cultured for 5 days were taken,and the purity of neurons was identified bymicrotubule-associated protein 2(MAP2)immunofluorescence staining.Results The extracted hippocampal neuron cells had high survival rate andgood growth state.The purity of neurons identified by MAP2 immunofluorescence was(95.20依1.50)%.Conclusion This method can not only ensurethe purity and activity of hippocampal neurons,but also reduce the cost of primary neuron culture.It is a stable,economic and practical primaryculture method of hippocampal neurons.Key words：Hippocampus;Neuron;Primary;Culture;Microtubule associated protein 2随着认知障碍疾病（cognitive disorders）发生率的增高，且目前对于认知障碍疾病尚无有效预防及治疗方法，各种病因导致的认知障碍已成为研究热点1-4。海马作为学习记忆的重要部位，在认知障碍的发病过程中发挥至关重要的作用，海马神经元体外培养已广泛用于认知障碍疾病模型构建、发病机制研究以及药物开发实验5-7。然而，海马神经元体外培养由于其培养成本高、耗时长、细胞不稳定以及细胞活性差等问题而一直是研究的难题。本研究通过改良既往海马神经元原代培养技术，旨在提供一种稳定、经济、实用的 SD 新生鼠海马神经元的原代培养方法。1材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物 采用出生 24 澡 内 SD 乳鼠 120 只，每只体重 710 g，由长沙市天勤生物技术有限公司许可证号：SCXK（湘）2019-0014提供，所有动物实验操作均符合动物伦理规范，并经遵义医科大学附属医院伦理委员会批准。1.1.2 试剂 DMEM-F12 培养基 DMEM-F12 培养基（Sigma，美国）、B27 营养因子（Gibco，美国）、0.25%胰蛋白酶（北京索莱宝公司）、胎牛血清（中国 雅酶公司）、左旋多聚赖氨酸（PLL，北京索莱宝公司）、脱氧核糖核酸酶 I（DnaseI，北京索莱宝公司）微管相关蛋白 2（MAP2，美国 Abcam 公司）、源%多聚甲醛溶液（北京索莱宝公司）以及羊抗兔 IgG H&L（美国 Ab原cam 公司）、Triton X-100（北京索莱宝公司）、封闭用正常山羊血清（北京索莱宝公司）、即用型 DAPI 复染液（北京索莱宝公司）。111论 著第 36 卷第 17 期医学信息Vol.36 No.172023 年 9 月Journal of Medical InformationSept.20231.1.3 主要仪器 CO2培养箱（Thermo 公司，美国）、倒置显微镜（OLYMPUS 公司，日本）、生物安全柜（苏州苏净安泰仪器有限公司，中国）、体视显微镜（OLYMPUS 公司，日本）、超纯水仪（Millipore 公司，德国）恒温水浴箱（Crystal 精骐有限公司，美国）、低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，中国）。1.1.4 实验器械 敷料镊（大号）1 把、弯手术剪 1 把、刀片、眼科剪 1 把、眼科镊 2 把（直镊、弯镊各 1 把）、显微镊 2 把（直镊、弯镊各 1 把）、离心管若干。0.22 滋m 过滤器、70 滋m 细胞筛。1.1.5 主要溶剂的配置 左旋多聚赖氨酸（PLL）溶液配置：将 10XPLL 溶液用 PBS 稀释成 1X，配制终浓度 0.1 mg/ml 的溶液，经 0.22 滋m 过滤器过滤后备用。脱氧核糖核酸酶 I（Dnase I）溶液，称取 Dnase I溶于 PBS 溶液，配制成终浓度为 1 mg/ml 的溶液，经0.22 滋m 过滤器过滤后备用。种植型培养基：DMEM-F12 培养基+10%胎牛血清；维持型培养基：DMEM-F12 培养基+2%B27。1.2 原代培养海马神经元细胞1.2.1 培养前准备 高压手术器械；24 孔板进行预处理。24 孔板预先放置细胞爬片。用 0.1 mg/L PLL 处理培养板，包被 30 min，予 PBS 溶液冲洗 3 遍后晾干备用。1.2.2 细胞培养 淤将出生 24 h 内 SD 乳鼠，放入 75%酒精中消毒 30 s，迅速断头取脑，将整个大脑放入预冷的 DMEM-F12 培养基，用显微镊沿大脑纵裂将大脑分成 2 部分，暴露海马体，完全剥离海马体上的被膜和血管膜，立即取出剥离干净的海马组织，将其放入预冷的 DMEM-F12 培养基中，然后用尖头吸管将培养基吸尽，再加入新的培养基，反复冲洗至少 3 遍；于将海马组织剪碎至约 1 mm3大小，加入 0.125%胰蛋白酶、1 mg/ml 的 Dnase I，37 益细胞培养孵箱消化20 min，每隔 5 min 摇晃 1 次培养皿，使其充分消化，加入等体积的种植培养液终止消化，过程中轻轻吹打数次，转移至离心管，静置 23 min 取上清液于 70 滋m细胞筛过滤，获得细胞悬液，离心 1000 rpm 5 min，去掉上清液，加入种植培养液制成单细胞悬液并计数；盂细胞接种，将细胞悬液种至 PLL 包被的孔板，种板密度（78）伊105个/ml。培育 3 澡 后，吸尽种植培养基，用 PBS 润洗 2 遍，加入维持型培养基（DMEM/F12+2%B27）培养，每 23 d 半量换液 1 次。1.3 海马神经元纯度鉴定 原代细胞培养至 5 d，取出培养孔板内的细胞爬片，加入 PBS，反复润洗 3次，5 min/次。将 0.2%Triton X-100 轻轻滴在爬片上，在室温环境中通透 20 min；通透完成后，再次加入PBS，反复润洗 3 次，5 min/次。将封闭用正常山羊血清稀释至 10%的浓度，封闭 30 min；一抗孵育：将MAP2 一抗稀释，在低温 4 益环境下孵育过夜；二抗孵育：一抗孵育结束后，加入 PBS，反复润洗 3 次，5 min/次；将二抗稀释至合适比例后，室温孵育 1 h，此后操作过程均需要遮光；DAPI 复染：二抗孵育结束后，加入 PBS，反复润洗 3 次，5 min/次。在爬片上滴加即用型 DAPI 复染液，此过程将细胞核进行染色，在室温条件下孵育 10 min，注意遮光；封片：DAPI 复染结束，加入 PBS，反复润洗 3 次，5 min/次。染色完成，将细胞爬片取出，吸去多余液体，在载玻片上滴少量封片剂；将爬片倒扣于载玻片，置于荧光显微镜下，采集图像。鉴定海马神经元纯度，随机选取显微镜的视野，计算 MAP2 与 DAPI 共标阳性细胞占总的有核细胞百分比，重复 6 次，取其平均值，即为海马神经元纯度。2结果2.1 原代海马神经元形态观察 如图 1A 所示，原代海马神经元种植当天可见细胞胞体饱满透亮，形状呈圆形、椭圆形、锥形，细胞周围有光晕，有一部分细胞开始形成少量突起，约 13 个；培养 1 d，海马神经元细胞胞体增大，突起增多（35 个），突起变长，细胞突起相互联系，见图 1B。培养 4 d，海马神经元胞体进一步增大，突起进一步增多变长，神经元之间相互连接形成网络，见图 1C；培养 苑 d，神经元细胞胞体体积变大、饱满，细胞胞浆丰富，突起更丰富，突起连接形成的网络更加密集和复杂，见图 1D。培养14 d，海马神经元突起比较粗大，神经元成熟度高，连接形成的网络密集、复杂，部分神经元细胞开始退化，可见退化的细胞碎片、代谢产物悬浮于培养基内，见图 1E。培养 28 d 的神经元突起更粗大，连接形成的网络密集、复杂，但退化神经元细胞增多，可见部分神经元胞体皱缩，突起溶解，培养液内悬浮的退化的细胞碎片及代谢产物较 14 d 更多，见图 1F。2.2 海马神经元鉴别 通过免疫荧光染色培养 5 d 细胞爬片，其中 MAP2 标记为神经元特异抗原，标记为绿色荧光，Dapi 标记细胞核，绿色和蓝色同时标记的为海马神经元。计算海马神经元纯度为（95.20依1.50）%，见图 2。112论 著第 36 卷第 17 期医学信息Vol.36 No.172023 年 9 月Journal of Medical InformationSept.20233讨论大脑海马结构在记忆活动中起着至关重要的作用，由于它结构特殊，易于辨认及分离，其离体细胞培养是研究认知障碍类疾病的良好工具8。大鼠海马原代神经元培养方法也在不断发展与改进9-11。本研究的海马神经元原代培养方法具有以下特点：淤相对于取材胎鼠12-14，本研究取材于 24 h内新生 SD 大鼠，耗费少，新生鼠海马体积较胎鼠大，更易分离，分离海马体耗时较短，提取的神经元数量多、活性好；于分离海马时，目前研究多采用D-hanks 液，本研究采用 DMEM/F12 培养基，其高糖环境避免海马组织长时间低糖环境，更利于海马神经元存活；盂相对于目前研究中培养原代神经元多选用价格高昂的 Neurobasal 培养基15，本研究选用的 DMEM/F12 培养基，更经济；榆用机械分离及“双酶法”（胰蛋白酶+DNA 酶）制备单细胞悬液，将海马体剪碎后，增加与胰蛋白酶的接触，可适量减少消化时间，同时低浓度胰蛋白酶可防止过度消化，加用DNA 酶可防止消化过程中胶状物质聚集而反复吹打造成神经元细胞损伤，提高海马神经元细胞存活率及细胞活性，本研究在种植当天即可看到海马神经元发出突起，细胞状态好；虞既往研究多添加阿糖胞苷等抑制胶质细胞增生16，但同时也损伤神经元的活性17，18。为提高海马神经元纯度及活性，本研究图2 MAP2标记海马神经元渊放大倍数伊200冤图1倒置显微镜下原代海马神经元各时期生长形态图渊伊100冤种植当天培养 1 d培养 4 d培养 7 d培养 14 d培养 28 d113论 著第 36 卷第 17 期医学信息Vol.36 No.172023 年 9 月Journal of Medical InformationSept.2023采用时间差贴壁法及无血清培养基，海马神经元纯度可达（95.20依1.50）%。含血清的种植液可促进神经细胞贴壁，同时也会促进胶质细胞等杂细胞增生。采用时间差贴壁法，在种植 3 h 后换用无血清的DMEM/F12+B27 培养基，可去除未贴壁的杂细胞、未消化完全的海马组织及一些细胞碎片，同时无血清的 DMEM/F12+B27 培养基不利于胶质细胞生长，因 B27 中含有神经元生长所需的必要元素及生长因子如谷氨酰胺、胰岛素、黄体酮、转铁蛋白等19，可抑制胶质细胞生长、促进神经元生长；愚海马神经元鉴定选用 MAP2 免疫荧光标记法。MAP2 主要表达于神经元细胞体和树突中，轴突也有少量表达，是神经元特异性骨架蛋白20，21，因此可认为 MAP2 阳性标记的细胞即为神经元,通过计算 MAP2 免疫标记阳性细胞比例可计算海马神经元纯度。本研究结果多基于海马神经元形态观察，检测指标不够丰富，并未做海马神经元活性检测与动态比较，且培养时间相对较短，以后的研究可进一步动态检测海马神经元活性，延长培养时间至 23 个月，进一步优化原代海马神经元培养方法。通过总结和改良既往实验方法，本培养方法在保证海马神经元细胞纯度及细胞活性的同时，降低原代神经元培养成本，是一种稳定、经济、实用的海马神经元原代培养法。参考文献院1Barbiellini Amidei C,Fayosse A,Dumurgier J,et al.Associationbetween age at diabetes onset and subsequent risk of dementiaJ.JAMA,2021,325(16):1640-1649.2The Lancet N.Better care for people living with dementia inthe USAJ.Lancet Neurol,2021,20(5):327.3Hendriks S,Peetoom K,Bakker C,et al.Global prevalence ofyoung-onset dementia:A systematic review and meta-analysisJ.JAMA Neurol,2021,78(9):1080-1090.4康晨瑶,刘洲,周海红.Nlrp3炎症小体在AD发病机制中的作用J.医学信息,2021,34(12):40-43.5Roos TT,Garcia MG,Martinsson I,et al.Neuronal spreadingand plaque induction of intracellular a茁 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