NAA浓度对蝴蝶兰生根的影响 - 副本.doc

专业：现代设施农业 班级：2010设施农业（1）班 编号： 201000297

新疆农业职业技术学院生物科技学院毕业论文

NAA浓度对蝴蝶兰生根的影响

学 院：生物科技学院
专 业：现代设施农业
姓 名：王泰山
班 级：2010设施农业（1）班
指导教师：朱妍梅

二О一二年五月二十四日

目 录
1 前言 3
1.1 蝴蝶兰简介 3
1.2 国内外的研究现状与发展趋势 3
1.3 研究的思路、目的及意义 6
2 材料与方法 7
2.1 实验器材 7
2.2 实验材料 7
2.3 实验过程与步骤 7
3 结果与分析 9
3.1 观察与记录的结果 9
3.2 数据分析 12
4 讨论 13
参考文献 14
致谢 15

NAA浓度对蝴蝶兰生根的影响

[摘要] 以蝴蝶兰品系TR1001、TR1002，组织培养增殖的不定芽为材料，研究NAA浓度对蝴蝶兰试管苗生根的影响。结果表明，在2/3MS培养基中加入1mg/L NAA时生根效果较好，生根率达到100％，且生根数多于其他处理。其中TR1002生根率高于TR1001。 蝴蝶兰生根的最佳蔗糖质量浓度为30g/L。香蕉泥对试管苗生根及生长有明显促进作用。最佳生根配方为1／2MS+0.4mg／L IBA+1mg／LNAA+30g／L蔗糖+50mL／L椰汁+50g／L香蕉泥+0.5g／L活性炭。
[关键词] NAA(a-萘乙酸)；蝴蝶兰；生根

致谢
NAA浓度对蝴蝶兰生根的影响
1 前言
1.1 蝴蝶兰简介
蝴蝶兰(Phalaenopsis hybrid)为兰科蝴蝶兰属多年生草本植物，其花型奇特，花姿优美，花色艳丽，花期长久，为热带兰中的珍品，素有“兰中皇后”之美誉[1, 2]。蝴蝶兰不仅可以做高档盆花，又是非常好的切花品种，特别是进行组合盆栽，典雅靓丽，是目前花卉市场上较为流行的一种高档花卉。具有很高的观赏价值和经济价值，是兰科植物中栽培最为广泛、深得人们喜爱的种类之一[3]。蝴蝶兰属于单茎性气生兰，植株极少发育侧枝，形成种子少且自然萌发率很低，且易带病毒，不易进行常规繁殖，因而组织培养成为其快速繁殖的有效手段。有关蝴蝶兰组织培养快繁的报道很多，大多集中在种子、花梗腋芽、茎尖、叶片、花梗节间等不同外植体的试管建成，丛生芽及圆球茎增殖的影响因素，外部因素对外植体褐化的影响等方面，而关于蝴蝶兰组织培养快繁中生根壮苗的研究则报道较少[4]。生根培养的成功与否不仅直接决定蝴蝶兰瓶苗生产的成败，组织培养苗生根状态对蝴蝶兰幼苗移栽的成活率及生长状况也有至关重要的影响。因此，进行组织培养生根条件优化的探索具有重要意义。本试验就影响蝴蝶兰瓶苗生根的NAA进行了研究，以期得到最为适合蝴蝶兰生长的NAA浓度，为蝴蝶兰的高效繁殖及规模化生产提供理论依据。
1.2 国内外的研究现状与发展趋势
由于蝴蝶兰越来越受到世人的喜爱，其需求量因此也逐年上升。长期以来， 世界各地不断尝试各种手段进行蝴蝶兰快速繁殖，以满足人们日益增长的市场需求。兰花的传统繁殖方式为分株繁殖，但蝴蝶兰是单茎气生兰，植株上极少发育侧枝，比其他种类的兰花更难进行常规无性繁殖，无法大量生产。蝴蝶兰亦可用种子繁殖，但发芽率低，也难以满足大量繁殖的需要。 而组培有缩短繁育周期，进行周年生产的优点，是蝴蝶兰进行快速繁殖的重要手段。一般采用组织培养的方式有两种：一是利用种子无菌发芽；二是从离体器官诱导产生原球茎,通过原球茎增殖，得到大量蝴蝶兰幼苗。ROTOR[5]于1949年利用无菌培养技术成功地促使蝴蝶兰花梗上的休眠芽发育成完整的植株，此法经进一步改进后，曾一度成为蝴蝶兰的主要无性繁殖方式。1974年，INTU-WONG和SAGAWA[6]利用蝴蝶兰茎尖诱导产生了原球茎，再由原球茎分化幼苗，形成了完整的植株[7]，从而成为蝴蝶兰生产最有效的方式之一。此后，研究者再原球茎诱导和增殖方面开展了大量研究，取得了可喜的进展。
1.2.1 外植体的选择
蝴蝶兰组织培养诱导原球茎的外植体有茎尖、茎段、叶片、根尖、根段、花梗腋芽、花梗节间切段、幼胚、种子等。茎尖是较容易诱导培养、成功率较高的部位，它是最早用于兰花快速繁殖的外植体。早在1974 年，Intuwong等[6]就利用蝴蝶兰茎尖诱导产生了原球茎状体，再由原球茎分化成植株，为实现蝴蝶兰工厂化生产奠定了基础。吴汉珠等[8]用蝴蝶兰的茎尖诱导出了原球茎。但蝴蝶兰是单茎气生性兰，采用茎尖作为外植体会散失母株，因此在蝴蝶兰组培中用茎尖诱导原球茎不太合适。叶片作为外植体既可减少对母株的伤害,且取材不受季节限制。叶片诱导原球茎的因素很多，除了培养基、激素、天然复合物等，还与叶龄、叶片接种方式和接种部位等有关。张秀清等[9]指出幼叶比成熟叶片诱导率高，且以整片直接插入培养基中较好，成熟叶片则叶基部诱导率较高。总之，叶片成功诱导出原球茎的报道较少。根尖、根段培养成功的报道都很少。
1.2.2 培养基的选择
不同品种的蝴蝶兰组培采用的培养基不同。周俊辉等[10]以红花品种为试材，添加了不同浓度的6-BA和1mg/L NAA到3种基本培养基中，发现改良KC 的效果最好，1/3 MS次之，MS 最差。李向英等[11]以日本国旗红蝴蝶兰为试材，采用改良VW培养基并加入活性炭和土豆汁，取得了较好的效果。侯大强等[12]用试管苗茎尖在附在5.0 mg/L 6-BA和0.5mg/L NAA的MS 培养基上诱导原球茎状体，诱导率可达100 %。不同外植体对最适培养基的选择也不同。何松林等[13]取杂交胚、花梗、幼叶、茎尖、根尖等不同外植体接入到添加了不同浓度的6-BA、NAA和2,4-D的几种培养基中进行培养，发现其4个月的杂交胚选用G3培养基附加0.2mg/L 6-BA和0.5mg/L NAA的最好，花梗、茎尖和根尖则在MS附加5.0～10.0mg/L的6-BA培养基上效果最好，而叶片以B5附加3.0～5.0mg/L的6-BA的效果最佳。
1.2.3 原球茎继代增殖
在蝴蝶兰继代增殖中最常用的激素仍然是IBA和NAA，偶尔使用KT和2,4-D。周俊辉等[9]的试验中随着IBA浓度增加，原球茎增殖倍数均有下降趋势，且低浓度NAA 对原球茎增殖和出苗均有促进作用。研究表明[14]，适宜浓度的6-BA配合较低浓度的NAA ，更有利于原球茎的增殖。而对蝴蝶兰原球茎分化形成幼苗之后，幼苗的再生培养条件尚无系统研究。在洋兰类组织培养种苗培养中，一般诱导原球茎形成及增殖用培养基并不适用于幼苗的培养。目前，在利用蝴蝶兰花梗诱导的营养芽及丛生芽的增殖培养中， 通常都以MS培养基为主；生根阶段通常以MS和1/2MS为主；壮苗生根培养则常用1/2MS和2/3MS。在外源激素的种类和组合方面与原球茎大致相同，只是量上的差别。
1.2.4 不同外界条件对对蝴蝶兰的影响
不管是通过原球茎途径还是通过丛生芽途径，蔗糖作为培养基的能源物质和渗透调节剂，不同浓度对组培有不同的作用，有试验表明[15] ，2%的蔗糖浓度有利于原球茎的最好生长；2%-3%蔗糖有促进芽的形成，5%的蔗糖有利于根的分化和生长；花药培养和胚培养则采用3%-15%的高浓度。
培养基的pH值，直接影响到培养物对离子的吸收，所以过酸或过碱都对植物材料生长有很大影响。此外，琼脂培养基的pH还影响到凝固情况。从试验资料来看，原球茎在pH5.0-5.4的环境中生长最好；丛生芽的诱导与增殖在pH5.6-5.8的环境中较好。
在蝴蝶兰诱导及增殖与生根阶段，常会加入有机附加物。试验证明，椰子水与香蕉汁对蝴蝶兰丛生芽的诱导与生根均有明显的促进作用。椰子与香蕉在海南不仅材料丰富，而且成本较低，这也为蝴蝶兰的工厂化生产提供了有利的条件。
蝴蝶兰在组织培养中，通常都以日光灯为光源，因此可以人为地进行控制其光照强弱。试验表明，光照强度对试管苗发根和生势均有明显的影响。据刘荣维[16]报道，在试验范围内光照3000lx 对蝴蝶兰根诱导和植株生长有利。但据陈之林[17] 等人报道，光照强度在1500～2000lx 也取得了较好的效果。在诱导蝴蝶兰丛生芽过程中，由于所取的花梗芽为花芽， 有试验证明[18]，在培养过程中，较低的温度影响(15～22)℃会使大部分花梗芽发育成花芽，在较高温度(23～26)℃下培养，花梗花芽转化为营养芽，所以在进行蝴蝶兰丛生芽诱导时的适宜温度条件为(25 ±2)℃。
1.2.5 蝴蝶兰培养过程中的褐化问题
蝴蝶兰组织培养过程中还会遇到的另一个问题就是褐变，对于此问题到现在还没有关完全解决的报道，但可以采取适当的措施加以控制。据有关资料报道[19]，在培养物加入柠檬酸0.05%-0.5%或活性炭1-4g/2或Vc等能起到一定作用；pH4.5-5.0时，培养物排出的褐变物质最多，pH5.5时就少，成活率就高；6-8月份高温季节采芽排出的褐变物质多，成活率也最低。
尽管国内外在蝴蝶兰组培方面取得了一定的进展，但仍存在繁殖系数偏低，增殖难，继代所需周期偏长等问题。并且对有些方面的研究还存在不同、甚至相反的结论，如基本培养基的选择、激素的种类与配比以及培养方式。蝴蝶兰品种繁多，现有的研究多就某些品种进行，还有许多品种未涉及，且各品种间存在着较大差异，还需进一步研究。试管苗的移栽技术是快繁的关键，应尽量提高移栽成活率。移栽苗往往生长得很慢，需要提高其生长速度，促其开花，以产生经济价值[20]。仍需加强蝴蝶兰离体培养繁殖技术的研究，探索通过组培加快育种和提高种苗的繁殖速度。诱变技术在改良蝴蝶兰品种方面起到了很重要的作用，值得作进一步的研究。
1.3 研究的思路、目的及意义
蝴蝶兰属于单茎性气生兰，植株极少发育侧枝，形成种子少且自然萌发率很低，不易进行常规繁殖，因而组织培养成为其快速繁殖的有效手段[21]。有关蝴蝶兰组织培养快繁的报道[22- 25]很多，大多集中在种子、花梗腋芽、茎尖、叶片、花梗节间等不同外植体的试管建成，丛生芽及圆球茎增殖的影响因素，外部因素对外植体褐化的影响等方面，而关于蝴蝶兰组织培养快繁中生根壮苗的研究则报道较少。生根培养的成功与否不仅直接决定蝴蝶兰瓶苗生产的成败，组织培养苗生根状态对蝴蝶兰幼苗移栽的成活率及生长状况也有至关重要的影响。因此，进行组织培养生根条件优化的探索具有重要意义。本试验就影响蝴蝶兰瓶苗生根的NAA质量浓度进行了研究，以期得到较为优化的生根壮苗培养条件，为蝴蝶兰的高效繁殖及规模化生产提供理论依据。具体研究思路如下：
（1） 培养基的配置：配置2/3MS培养基，并保证在其他营养物质一致的情况下在培养基中分别加入0.5mg/L，1.0mg/L，2.0ml/L的NAA，另外设置一组不加NAA作为对照；
（2） 培养基污染的检查：将培养基放入冷凝室放置一个星期以上，取无污染切凝固良好的各种NAA浓度培养基各7瓶以上，作为接种所用。
（3） 材料选取：取形态大小，生长状态基本一致的蝴蝶兰2个品种TR1001，TR1002，作为实验所用材料。
（4） 接种：在无菌超净作台上进行接种，每一NAA接种7瓶以上，接种过程中要将蝴蝶兰根切净但不能切除生长点。
（5） 培养：将接种好的材料放入组织培养室进行培养。
（6） 观察：每隔2个星期进行观察拍照，2个月后进行出瓶，切下长出的新根数根数，量长度，测鲜重，并列表记录。
（7） 获得实验结果：分析所得数据，得出适合蝴蝶兰生长的最适NAA质量浓度
2 材料与方法
2.1 实验器材
YXQ-LS-18SI型高压灭菌锅；SA-1600-2双人水平超净工作台；JZ-100-B接种器具杀菌器；植物光照培养室（光照强度：1600lx；光照时间：9h；培养温度：25℃）；电子分析天平；照相机；尺子；镊子*3；解剖刀*3；酒精灯；托盘。
2.2 实验材料
（1）江苏同人生物有限公司提供的两种蝴蝶兰TR1001（大叶瑞丽）和TR1002（鼎汉火焰）作为实验材料。
（2）分析纯琼脂，分析纯蔗糖。
2.2.1 实验试剂
（1）1mol/ml HCL溶液，1mol/ml NaOH 溶液，用作调节培养基pH值。
（2）大量元素溶液（NH4NO3；KNO3；CaCl2·2H2O；MgSO4·7H2O；KH2PO4）；微量元素溶液（KI；H3BO3；MnSO4·4H2O；ZnSO4·7H2O；Na2MoO4·2H2O；CuSO4·5H2O；CoCl2·6H2O）；有机物溶液（肌醇；ⅣB烟酸；盐酸吡哆醇(维生素B6)；盐酸硫胺素(维生素B1)；甘氨酸）；铁盐（FeSO4·7H2O；Na2-EDTA·2H2O）。（以上溶液所含物质浓度单位均为mg/L）
（3）1mg/ml的NAA溶液。
2.3 实验过程与步骤
2.3.1 实验过程
本实验是以蝴蝶兰品系TR1001、TR1002，组织培养增殖的不定芽为材料，研究NAA质量浓度对蝴蝶兰试管苗生根的影响。实验首先要配置2/3MS培养基和加入了不同质量浓度NAA的2/3MS培养基，然后经过一个星期的冷凝方能使用。培养基冷凝期间可进行蝴蝶兰TR1001、TR1002这两种材料的选择，材料选择完成后便可进行材料的接种过程。之后将接种好的材料放入组织培养室进行培养，培养过程中每隔2个星期进行材料的拍照观察过程。培养时间达到2个月后，就可进行出瓶，将每瓶苗进行切根处理，并数出每根苗的新生根数，量出新生根根长和鲜重，进行记录。将记录好的数据绘制成表格，经分析处理得出结论。
2.3.2 实验步骤
1、培养基的配置：
（1）2/3MS培养基是以各种大量元素溶液和微量元素溶液按一定质量浓度比混合，再加入各种有机物溶液和铁盐、分析纯琼脂、分析纯蔗糖，然后经瓶装、凝固而成。配置过程中，要保证培养基为偏酸性，否则无法凝固或凝固太彻底。因此，配置过程中要经常测量其pH值，若过酸，则加入少量NaOH（1mol/ml），若过碱，则加入少量HCl（1mol/ml）。
（2）本实验所用培养基是在2/3MS培养基中分别加入0.5mg/L, 1.0mg/L, 2.0ml/L的NAA ，另设置一组不加NAA的培养基作为对照。每一NAA浓度培养基不能少于7瓶，以防止培养基污染和接种污染而导致实验材料过少。
（3）将配置好的培养基经高压灭菌锅灭菌后放入冷凝室，放置一个星期以后方能使用，以防止培养基污染而对材料造成浪费，从而影响实验结果。
2、材料选取：
（1）选取无污染且凝固良好瓶装数量相近的培养基作所为实验所用，以尽量减少实验的影响因素。
（2）选取长势良好且叶片大小相近的蝴蝶兰TR1001、TR1002，以防止材料不一致对实验结果造成影响。其中蝴蝶兰叶片要求在1.5cm以上且有两片或两片以上完整叶片。
3、接种：
本步骤需在无菌室的超净工作台上进行。将材料切好后，接入培养基中，每瓶接入5株。每个浓度接种7瓶，一共56瓶。接种完毕后，贴上标签。送入植物光照培养室培养。培养条件：光照强度：1600lx;光照时间：9h;培养温度：25℃。
接种过程中应注意的事项如下：
（1）接种进行前水平超净工作台要用75％的消毒酒精擦净；
（2）接种器具杀菌器要让其升温至280℃以上才能使用，且镊子和解剖刀需要在280℃以上的杀菌器中杀菌2min以上才能使用；
（3）托盘需要在酒精灯上灼烧消毒5min以上才能使用；
（4）培养基、蝴蝶兰材料在放入工作台上之前均需要用蘸有消毒酒精的抹布擦拭消毒，且均需要在酒精灯上烤烧片刻方能开瓶使用；
（5）接种过程中，蝴蝶兰根系必须要切净。接种时镊子、解剖刀头部均不能挨到工作台，蝴蝶兰也不能挨到培养基瓶口和掉落到工作台上，否则不能使用。
（6）蝴蝶兰接入培养基中后，培养基瓶盖必须要拧紧，以防止细菌污染。
4、培养观察与结果统计
（1）实验观察：培养期间定期观察生长状态，剔除污染死亡的植株并记录。
（2）结果统计：将蝴蝶兰从瓶中夹出，数出每株根数，最长根根长，每瓶所有根的总鲜重，每个浓度拍一张照片。
3 结果与分析
3.1 观察与记录的结果
3.1.1 生长期蝴蝶兰生根与死亡情况
表1 生根及死亡情况记录表
日期
污染及死亡情况
生根及生长状态
05.04
无污染情况
生长状态良好，无明显的根生成。
05.11
无污染情况
有部分植株出现明显根生成，长度约为0.2mm。生长状态良好。
05.17
一瓶发黄死亡（TR1001）
绝大多数植株均已生根，且生长状态大致良好，个别植株死亡。
05.21
两瓶污染
生长状态良好，拍照记录。每个浓度拍三张根部照片。
05.28
两瓶污染
出瓶，记录根数，最长根根长，根的鲜重。

①
②
③
④
⑤
⑥
⑦
⑧

图1 生长期生根情况图
注：①②③④为TR1001分别在加入NAA浓度为0, 0.5, 1.0, 2.0时培养一个月后的生根情况图，⑤⑥⑦⑧为TR1002分别在加入NAA浓度为0, 0.5, 1.0, 2.0时培养一个月后的生根情况图。
3.1.2 出瓶期蝴蝶兰生根情况

表2 出瓶期生根情况记录表

平均根数 平均根长 平均鲜重
（n） （cm） （g）
0 NAA 1.5 1.42 0.06712

0.5 NAA 2.0 1.41 0.07280

TR1001 1.0 NAA 2.1 0.91 0.04538

2.0 NAA 1.8 0.73 0.09676

0 NAA 1.5 1.37 0.08544

0.5 NAA 2.0 1.39 0.07280
TR1002
1.0 NAA 2.1 1.55 0.08848

2.0 NAA 1.8 1.43 0.08778

①
②
③
④
⑤
⑥
⑦
⑧

图2 出瓶期生根情况图
注：①②③④为TR1001分别在加入NAA浓度为0, 0.5, 1.0, 2.0时培养两个月后的生根情况图，⑤⑥⑦⑧为TR1002分别在加入NAA浓度为0, 0.5, 1.0, 2.0时培养两个月后的生根情况图。
3.2 数据分析
3.2.1 NAA浓度对蝴蝶兰TR1001生根的影响
培养2个月后，出瓶处理，其生根情况如下表：
表3 TR1001生根情况图
NAA浓度(mol)
项目
1根率
(%)
2根率
(%)
多根率
(%)
生根率
(%)
0
45
45
5
95
0.5
10
75
10
95
1.0
35
25
40
100
2.0
20
65
5
90
由表3可以看出，添加1.0mg/L NAA时，其生根率最高，达到100％，生根时间最短，且多根率也最高。由此可见，蝴蝶兰TR1001生根的最适NAA质量浓度为1.0mg/L。浓度过低或过高对蝴蝶兰的生根的促进效果都较低。
3.2.2 NAA浓度对蝴蝶兰TR1002生根的影响
其生根情况如下表：

表4 TR1002生根情况图
NAA浓度(mol)
项目
1根率
(%)
2根率
(%)
多根率
(%)
生根率
(%)
0
45
45
5
95
0.5
5
75
10
90
1.0
35
25
40
100
2.0
20
70
5
95

由表4可以看出，当NAA浓度为1.0mg/L时，其平均根数最大，生根率最高，达到100％，多根率也最高。由此可见，蝴蝶兰TR1002 生根的最适NAA浓度为1.0mg/L。浓度过高或过低对其生根的影响均价低。
4 讨论
研究表明，添加lmg/L NAA的培养基诱导生根的时间短，生根率高。本实验结果表明，诱导蝴蝶兰生根的最适NAA浓度为1.0mg/L，过高或过低，对其生根的促进效果均不明显。
NAA作为植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加坐果，防止落果，改变雌、雄花比率等。可经叶片、树枝的嫩表皮，种子进入到植株内，随营养流输导到全株，因而其能广泛的用于工业生产中。但其成本较高，对植物的促进作用也并不是特别明显。因此，怎样才能用其获得更高的经济效益，称为了生产厂加研究的问题。经过无数次的实验发现，将NAA以一定的比例与其他植物生长调节剂混合，再用于生产中，其效果更加明显，且成本较低。研究表明，诱导蝴蝶兰组织培养分生苗生根的最佳配方为：1/2 MS、0.4 mg/L IBA、1mg/L NAA、30g/L 蔗糖、50 mL/L 椰汁、50g/L 香蕉泥、0.5g/L 活性炭、6.8g/L 卡拉胶。
植物组织培养生根阶段，降低培养基中大量元素的浓度，可提高大多数植物的生根能力。无机营养元素是影响蝴蝶兰生根壮苗的重要因素，较低无机盐浓度有利于根的发生和生长。研究表明，低无机盐培养基有利于蝴蝶兰生根。基本培养基中的大量元素和部分微量元素及有机成分减半有利于根的形成，且是各试验因子中影响最大的因子。蝴蝶兰生根壮苗需要较丰富的碳水化合物，因而蔗糖质量浓度对生根有显著影响。

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致谢
本实验及论文是在我的指导老师严寒教授的亲切关怀和悉心指导下完成的。严老师严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。从课题的选择到完成，严老师始终给予了我无私的帮助，同时在思想、生活上，严老师也给了我无微不至的关怀。在此谨向严老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。
忠心感谢牟永花总经理为我提供了在她们公司的实验室进行NAA对蝴蝶兰生根的影响的研究机会，并在实验思路和方法上给了我许多帮助，对我论文的完成有重要的意义。
感谢一起做实验的同学刘威和何操在实验操作和过程分析中给我的帮助。
感谢生命科学学院的各位老师和同学。
最后，感谢一直默默支持、鼓励我的爸爸、妈妈和哥哥，你们是我强大的后盾和活力的源泉。
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