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HLA分型技术回顾（1）
主要组织相容性复合物（MHC）是脊椎动物体内最复杂且具有高度多态性的基因群。1984年George Snell 首次发现小鼠MHC即H－2，1958年Dausset 发现了人的MHC即HLA基因。MHC的表达产物称为主要组织相容性抗原，MHC抗原是有核细胞表面膜蛋白分子，对抗原递呈和免疫信号传递起关键作用。
HLA基因，位于6号染色体上短臂上，长约4000Kb。HLA是目前所知人体最复杂的遗传多态性系统，有几十个基因座位，每个基因座位又有几十个等位基因，且呈共显性表达。由于MHC基因位于同一条染色体上，其多基因座位上的基因型组合相对稳定，很少发生同源染色体间交换，这就构成了以单元型（HAPLOTYPE，即在同一条染色体上紧密连锁的一系列等位基因的特殊组合）为特征的遗传。按中国人常见的A座位基因有13个，B座位基因有30个计算，可组成的单元型约有13×30＝390种之多。理论上估计，父母各给一串单元型给子女，便会形成4.3万种HLA－AB血型。事实上，HLA 各基因并非完全随机地组成单元型，而是呈现出连锁不平衡（linkage disequilibrium,LD）的特点。理论推测的HLA 分型数量巨大，但对一个具体的民族来说并非如此。世界上各个民族人群的HLA多态性和单元型都有各自的特点。总体来讲，中国北方汉族、北美白人和北美黑人人群的多态性较中国南方汉族和日本人群丰富。即使在中国，地区间也存在差异。在中国汉族群体中抗原A1、A3、B13、B44和B51频率呈北高南低分布，而抗原A24、B46、B60呈北低南高分布。在中国汉族群体中常见的A30-B13-DRB1*07，A1-B37-DRB1*10单体型频率呈北高南低分布，在江浙沪汉族人群中频率较北方汉族人群下降，而A2-B46-DRB1*09，A33-B58-DRB1*17，A33-B58-DRB1*13单体型频率呈北低南高分布。HLA多态性程度可见一斑。
HLA研究涉及免疫学、生物学、遗传学、分子生物学、医学等多个学科，并已发展成为一个独立的学科分支。迄今HLA研究已达到相当深入的水平，并在诸多方面取得显著进展，包括HLA复合体结构；HLA分子结构及其表达的调控；HLA分子功能，尤其是在抗原处理、呈递及T细胞识别中的作用；HLA的DNA分型及多态性研究；HLA与疾病的关系；HLA与移植的关系等。HLA研究不仅使器官移植成为一种极有价值的治疗手段，并给基础与临床免疫带来了突破性进展。已经证实，HLA复合体中存在控制免疫应答的基因以及HLA参与约束免疫细胞间相互作用，这表示HLA涉及生命活动的各个水平与多个方面。可以预期，对HLA的研究将继续成为免疫遗传学最活跃的部分；对HLA的应用将扩展到基础、临床、预防医学的各个领域。
纵观HLA系统的研究过程，其发展无不与技术的手段的突破与运用有密切关系。70年代到80年代末期主要是血清学研究；90年代以来，HLA进入了分子水平研究阶段，进展尤为显著。HLA分型技术同样走过了这一历程。建立于60年代并不断完善的血清学及细胞学分型技术主要侧重于分析HLA产物特异性。
血清学分型借助的是微量淋巴细胞毒试验（microlymphocytotoxicitytest）或称补体依赖的细胞毒试验（complement dependent cytotoxicity test，CDC）。取已知HLA抗血清加入待测外周血淋巴细胞，作用后加入兔补体，充分作用后加入染料，着染的细胞为死亡细胞，依据特异性抗体介导的补体系统对靶细胞溶解的原理，待检淋巴细胞表面具有已知抗血清所针对的抗原。血清学分型存在诸多缺点：①标准分型抗体亲和力较弱、效价较低、易产生交叉反应，②缺少某些单价抗血清；③某些病理过程可能导致外周血淋巴细胞表面抗原性质发生改变．干扰抗原—抗体反应；④国内供HLA—I类抗原分型的血清板来源困难、质量欠佳。上述因素均严重影响了HLA分型结果的可靠性及该技术的推广应用。
细胞学分型技术指的是通过纯合分型细胞（homozygote typing cell,HTC）及预致敏淋巴细胞试验（primed lymphocyte test,PLT）对HLA分型。二种方法的基本原理均是判断淋巴细胞在识别非己HLA抗原决定簇后发生的增殖反应。由于分型细胞来源困难以及操作手续繁琐，细胞学分型技术下正逐渐淘汰。
1991年第11届国际HLA专题讨论上提出了HLA的DNA分型方法，这类方法近年来在研究和应用方面发展非常快，有取代其他方法的趋势。DNA分型方法主要分为两种：基于核酸序列识别的方法和基于序列分子构型的方法。下面简要的阐述各方法的原理和优缺点。
基于核酸序列识别的方法主要有：PCR-RFLP，PCR-SSO，PCR-SSP和PCR-SBT。
PCR-RFLP：CAPs(cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites) CAPs技术又称为PCR-RFLP，限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）技术。
其原理是将目的基因片段PCR扩增后，利用多种限制性内切酶对扩增产物进行酶切，不同的基因序列会产生不同的酶切产物，从而产生不同的电泳图谱。它以其简单、敏感、准确，无需同位素等优点成为目前较常用的HLA基因分型技术之一，但是无法分辨杂合子，且只能区分有限的多态性。
PCR-RFLP的基本原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。此项技术大大提高了目的DNA的含量和相对特异性，而且方法简便，分型时间短。
基本流程
1.根据基因名称查询序列，设计引物。
2.提取基因组DNA。
3.PCR扩增。
4.产物酶切，凝胶电泳。
PCR-SSO（sequence specific oligonucleotide）：也称顺序特异寡核苷酸法
原理是PCR基因片段扩增后利用序列特异性寡核苷酸探针，通过杂交的方法进行扩增片段的分析鉴定。探针与PCR产物在一定条件下杂交具有高度的特异性，严格遵循碱基互补的原则。探针可用放射性同位素标记，通过放射自显影的方法检测，也可以用非放射性标记如地高辛、生物素、过氧化物酶等进行相应的标记物检测。
用以同位素或非放射性标记的探针与PCR扩增的目标片断产物杂交，根据阳性斑点判断个体基因型。由于HLA等位基因非常多，就需要很多的探针对每个DNA样品要进行多次杂交（甚至十几次）才能完成定型分析操作也十分繁琐。于是在此基础上又发展起来一种反向杂交法（reverse hybridization）。将各种不同的探针固定于同一张膜上，再将PCR产物标记，以PCR产物（待检测基因DNA）反过来与探针杂交。这样一次杂交即可完成多个等位基因分析。此方法具有灵敏度、特异性强、需样本量少等优点，但不同探针的杂交条件的须严格统一（如温度，离子强度）, 易出现误差;不能检测新等位基因，试剂盒需不断升级; 对某些杂合子分辨率也不好;。很多HLA基因型含有相同的多态性，而仅仅由于排列方式不同，因此分辨率不及SSP和SBT（4.01＃113）。此方法适宜大量和高纯度样本，杂交条带将作为书面原始记录长期保存（三种效果比较）。
PCR-ASO探针法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特异性寡核苷酸探针法。在PCR扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探针杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。其原理是：用PCR扩增后，产物进行斑点杂交或狭缝杂交，针对每种突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针，其中一个具有正常序列，另一个则具有突变碱基。突变碱基及对应的正常碱基匀位于寡核苷酸片段的中央，严格控制杂交及洗脱条件，使只有与探针序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号，而与探针中央碱基不同的等位基因片段不显示杂交信号，如果正常和突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子，如只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子，若不能与含有突变序列的寡核苷探针杂交，但能与相应的正常的寡核苷探针杂交，则表示受检者不存在这种突变基因。若与已知的突变基因的寡核苷探针匀不能杂交，提示可能为一种新的突变类型。
PCR-SSP：序列特异性引物分析即根据各等位基因的核苷酸序列，设计出一套针对每一等位基因特异性的（allele-specific）、或组特异性 (group-specific)的引物，此即为序列特异性引物（SSP）。SSP只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合，通过PCR特异性地扩增该基因片段，从而达到分析基因多态性的目的。
上述的PCR/RFLP、PCR/SSO等，最终均需用标记的特性探针与扩增产物进行杂交，再分析结果。PCR/SSP方法用乃设计出一整套等位基因组特异性引物（sequence specific primer,SSP），借助PCR技术获得HLA型别特异的扩增产物，可通过电泳直接分析带型决定HLA型别，从而大大简化了实验步骤。优点是简单易行, 分辨率可从低到高, 成本低 。缺点是不易自动化;不能检测新的等位基因，试剂盒需不断升级。此方法适宜零散和纯度低样本，重复实验时要重提DNA和必须使用紫外凝胶成象仪保留原始资料，增加实验成本（三种效果比较）。PCR-SSP和PCR-SSO均需大量试剂（引物）,且不能识别非经典的HLA基因和假基因（绿）。针对HLA外显子和内含子序列精心设计引物可避免这些问题。
PCR-SBT: 以PCR扩增所要分析的基因片断，然后对DNA序列进行分析，可以直接得到基因型。分辨率高，可大规模进行，精确度高，能直接发现新的等位基因。但是由于杂合子的存在，无法分辨单元型。
以上各个方法都存在无法克服的缺陷，如能配合使用，则能大大提高分型能力。国外有学者对60个样本进行研究，发现单用SBT，只有18％的样本能将A，B位点同时分型成功，如结合SSO，则能将所有样本成功分型。
基于核酸序列识别的分型方法始终无法越过杂合子的难关。HSE(Haplotype-specific extention)技术完美地解决了这一问题。它是利用磁珠与其中一条同源染色体的特异位点结合，达到分离同源染色体的目的，杂合子问题不攻自破。因此，HSE无论与SSO还是SBT结合使用，都有极好的效果（1.01＃12，4.01＃94）。
近年来，测序新技术发展层出不穷，纷纷运用到HLA分型中。如MSNE(multiplex single nucleaotide extention),应用链中止法原理，根据等位基因SNP位点设计特异性引物和生物素荧光标记的ddNTP进行分型，有重复性好，可分辨杂合子等优点，已应用到A位点的分型中。（4.01＃93）又如pyrosequencing 法分型，分辨率好，可分辨杂合子，自动化程度也高。DNA芯片技术，作为一项检测SNP的成熟技术，也已应用到HLA 分型中.
基于序列分子构型的分型方法在理论上就避开了杂合子这个难题。SSCP(PCR单链构象多态性分析，PCR-single strand conformational polymorphism)是最常用的根据构型的分型方法。扩增的目标产物变形后形成单链，不同的序列，甚至仅有一个碱基的差异，就会形成不同的茎环结构，从而电泳速率不同。但此方法仅限于分辨仅限于200－300bp（绿16），且即使是同一单链DNA在相同情况下也会形成不同的构型，使得电泳条带很难分析;也有可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小的情况,使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。
HA(异源二聚体电泳多态性，Heteroduplex Analysis)是另一种基于序列分子构型的分型方法，根据异源二聚体未配对区域的长度和分布而显示出电泳条带不同（绿18）。但与单链DNA相比，异源二聚体电泳条带过于复杂，难以分析。
新发展的RSCA（Reference Strand Mediated Conformation Analysis）技术根据HA的原理，设计了位点特异性荧光标记的参照DNA片段，与样本DNA分子的正反链形成异源二聚体.带有荧光标记的电泳条带易于分析，能够克服HA的不足。
另外，提取基因组模板的技术也在不断发展。用于分型的DNA来源也已不局限于血液，口腔涂片、唾液中提取的DNA也有相似的效果（7.01＃261）。针对微量基因组模板的情况，现已开发出基于滚环复制的全基因组扩增技术，可以将1ng的模板扩大至100ng，足以应付PCR-RFLP、PCR-SBT等分型技术的要求。
相信随着分子生物学技术的发展，未来HLA分型技术会向着更便捷，准确的方向前进。
HLA分型技术回顾（2）
HLA分型并不只是一种应用性的临床检测指标，免疫遗传学研究的发展，很大程度上依赖于以分型为主要手段的HLA多态性分析。60年代建立的并不断完善的血清学及细胞学分型技术主要侧重于分析HLA产物特异性；80年代起建立的DNA分型方法则侧重于基因的分型。
一、血清学分型技术
（一）HLA-Ⅰ类抗原的检测
HLA-A、B、C抗原型别鉴定均借助微量淋巴细胞毒试验（microlymphocytotoxicitytest）或称补体依赖的细胞毒试验（complement dependent cytotoxicity test）。原理为取已知HLA抗血清加入待测外周血淋巴细胞，作用后加入免补体，充分作用后加入染料，在倒置显微镜下判断结果，着染的细胞为死亡细胞，表示待检淋巴细胞表面具有已知抗血清所针对的抗原。标准抗原清取自多次经产妇或计划免疫志愿者。
（二）HLA-DR、DQ抗原检测
该二抗原分型方法同HLA-Ⅰ类抗原，但所用抗血清须经过血小板吸收以去除针对Ⅰ类抗原的抗体。另外，待测细胞须是经纯化的B细胞。
血清学分型是一项古老的技术，虽然近年来已建立许多新的分型技术，但血清学方法目前仍是HLA分型的基础。
二、细胞学分型技术
HLA-Dw特异性与HLA-DP特异性可分别通过纯合分型细胞（homozygote typing cell,HTC）及预致敏淋巴细胞试验（primed lymphocyte test,PLT）检测。二种方法的基本原理均是判断淋巴细胞在识别非已HLA抗原决定簇后发生的增殖反应。由于分型细胞来源困难以及操作手续繁琐，细胞学分型技术下正逐渐淘汰。
三、HLA的DNA分型技术
上述传统的HLA分型方法有许多不足之处，近年来国内外已将HLA分型技术由抗原水平发展到基因水平。
（一）限制性片段长度多态性检测技术
这是首先建立的对多态性进行检测的DNA分析技术。个体间抗原特异性来自氨基酸顺序的差别，后者由编码基因的碱基顺序不同所决定。这种碱基顺序的差别造成限制性内切酶识位置及酶切位点数目的不同，从而产生数量和长度不一的DNA酶切片段。用特异性探针对整个基因组DNA酶切片段进行杂交，即可分析限制性长度片段多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）。一定的内切酶组合所得到的HLA-RFLP可以和传统方法测定的HLA特异性型别相关。80年代末发展起来的PCR（polymerase chain reaction）技术已被用于RFLP分析，即用等位特异限制酶裂解PCR扩增的片段，然后再进行分析，从而大提高了灵敏度。
（二）PCR/SSO技术
此法乃用人工合成的HLA型别特异的寡核苷酸序列作为探针，与待检细胞经PCR扩增的HLA基因片段杂交，从而确定HLA型别，PCR技术可将HLA复合体上指定基因片段特异性地扩增5～6个数量级；而专门设计的SSO（序列特异的寡核苷酸sequencedpecific oligonucleotide）探针又能探测出等位基因间1～2个核苷酸的差异，故PCR/SSO技术具有灵敏度、特异性强、需样本量少等优点。
（三）PCR/SSP技术
目前常规的HLA-DNA分型技术，包括上述的PCR/RFLP、PCR/SSO等，最终均需用标记的特性探针与扩增产物进行杂交，再分析结果。PCR/SSP方法用乃设计出一整套等位基因组特异性引物（sequence specific primer,SSP），借助PCR技术获得HLA型别特异的扩增产物，可通过电泳直接分析带型决定HLA型别，从而大大简化了实验步骤。
由于传统方法在Ⅱ类抗原分型方面困难较大，故上述几种基因分析型方法目前主要用于Ⅱ类基因座。此外，目前已建立的HLA基因分型技术还包括PCR单链构像多态性分析（PCR-single strand conformational polymorphism，PCR-SSCP）和PCR 异源二聚体电泳多态即PCR指纹图（PCr fingerprinting）分析。DNA分型技术的应用，使HLA型别分析达到了更精细的水平，并因此发现了更多的HLA多态性。HLA的DNA分型技术现已成为血清学方法的竞争者，并可能在不久的将来完全取而代之。
HLA是目前所知人体最复杂的遗传多态性系统。HLA研究涉及免疫学、生物学、遗传学、分子生物学、医学等多个学科，并已发展成为一个独立的学科分支。迄今HLA研究已达到相当深入的水平，并在诸多方面取得显著进展，包括HLA复合体结构；HLA分子结构及其表达的调控；HLA分子功能，尤其是在抗原处理、呈递及T细胞识别中的作用；HLA的DNA分型及多态性研究；HLA与疾病的关系；HLA与移植的关系等。HLA研究不仅使器官移植成为一种极有价值的治疗手段，并给基础与临床免疫带来了突破性进展。已经证实，HLA复合体中存在控制免疫应答的基因以及HLA参与约束免疫细胞间相互作用，这表示HLA涉及生命活动的各个水平与多个方面。可以预期，对HLA的研究将继续成为免疫遗传学最活跃的部分；对HLA的应用将扩展到基础、临床、预防医学的各个领域。
HLA分型
第一节 概 述
主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)系编码主要组织相性抗原的基因群，是早期从组织器官移植实验中发现的，也是当今免疫遗传学的主要内容。已发现，在人群或同种动物不同个体间进行皮肤移植时出现的排斥反应，具有记忆性、特异性和可转移性等免疫反应的基本特征，故从廿世纪40年代起就确认移植排斥反应是一种典型的免疫现象。引起排斥反应的抗原称移植抗原(transplantation antigen)或组织相容性抗原(histocompatibility antigen)。此等抗原存在于细胞表面，无器官特异性，不同个体间其抗原特异性互不相同，但同卵双生及纯系动物不同个体之间，其抗原特异性完全一致。
组织相容性抗原包括多种复杂的抗原系统。凡能引起快而强的排斥反应者称为主要组织相容性抗原系统，引起慢而弱的排斥反应者称为次要组织相容性抗原系统。若供者、受者双方的多个次要组织相容性抗原不匹配，同样会迅速发生明显的排斥反应。现已证明，MHC不仅控制着同种移植排斥反应，更重要的是与机体免疫应答、免疫调节及某些病理状态的产生均密切相关。因此，MHC的完整概念是指脊椎动物某一染色体上编码主要组织相容性抗原、控制细胞间相互识别、调节免疫应答的一组紧密连锁基因群。
关于MHC的发现、基因组成和功能的了解，多基于小鼠实验。因此，从廿世纪30年代起已确定小鼠的MHC位于第17号染色体上，称为H2复合体。H2复合体由K区、I区、S区和D区组成，其中I区又分为IA和IE两个亚区，其基因编码产物称为I区相关抗原(I region associated antigen，Ia)，见图5.1。
图5.1 小鼠H-2复合体结构示意图
1958年Dausset等发现，多次接受输血的患者、多产妇和用同种白细胞免疫的志愿者血清中，存在不同特异性的白细胞抗体，用这些抗体鉴定出许多不同特异性的白细胞抗原，称为人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)。通过家系和人群遗传分析发现，人类MHC位于第6号染色体上，称为HLA复合体。各种脊椎动物都有自己的MHC，除了人的HLA和小鼠的H2外，恒河猴、黑猩猩、狗、兔、豚鼠、大鼠和鸡的MHC分别称为RhLA、ChLA、DLA、RLA GpLA、AgB(H1)和B。本章主要介绍人类HLA复合体及其编码产物的结构、分布和功能，及HLA抗原检测在医学上的意义等内容。
第二节 HLA复合体的基因组成
HLA复合体位于第6号染色体短臂上大约4000kb范围内，由一群密切连锁的基因组成。HLA复合体是迄今已知的人体最复杂的基因体系。从着丝点一侧起依次为Ⅱ类基因、Ⅲ类基因和Ⅰ类基因区域所在(图5.2)
图5.2 HLA复合体基因简图
Ⅰ类基因区包括HLAA、B、C位点的等位基因，编码HLAA抗原、B抗原和C抗原等经典的Ⅰ类抗原(分子)。近年来相继发现大量与Ⅰ类基因结构相似的基因，已被正式命名的有HLA-E、F、G、H、J、K、L。其中HLA-E、F、G基因可编码非多态性的Ⅰ类样抗原(或非经典Ⅰ类抗原)，但它们的确切功能尚未清楚。HLA-H、J、K、L则属于假基因。Ⅱ类基因区十分复杂，主要包括HLA-DP、DQ、DR三个亚区和新近确定的DN、DO、DM等3个亚区。该区的基因是以它们所编码的肽链(α、β)直接命名，如DRA、DRB1、DRB2等。已知该区至少存在7个编码α链和16个编码β链的基因，其中有的基因有表达功能，有的功能不明，有的属于假基因。
现在证明，在Ⅱ类基因区内存在与内源性抗原处理和递呈相关的基因，即LMP和TAP。LMP又称蛋白酶体相关基因(proteasomerelated gene)，由LMP2和LMP7两个基因组成，其编码产物LMP(low molecular mass polypeptide or large multifunctional protease)与内源性抗原的处理有关。TAP为多肽转运体基因，包括TAP1和TAP2两个基因，其编码产物TAP(transporter of antigenic peptides)与抗原肽的转运有关。HLA复合体Ⅰ类和Ⅱ类区基因名称见表5.1。
Ⅲ类基因区内已定位的至少有36个基因，其中与免疫系统有关的基因有C4B、C4A、C2、Bf、肿瘤坏死因子(TNFA、TNFB)和热休克蛋白70(HSP70)，分别编码C4、C2、B因子、TNF-α、TNFβ和HSP70分子。在C4B两侧，还有与免疫系统无明显关系的CYP21B和CYP21A两个基因，编码21羟化酶。大多数Ⅲ类基因产物合成后分泌到体液中去。具体内容见有关章节。HSP70主要在胞浆内，与其他蛋白质肽链的折叠、转位有关，亦可见于MΦ细胞和B细胞的内体(endosome)和膜表面，其作用为阻止内体中抗原的降解，并使之与Ⅱ类分子联合(详见第八章)。
表5.1HLA复合体Ⅰ类和Ⅱ类基因区内的基因名称
I类基因区
II类基因区
HLA-A
HLA-DRA
HLA-DQA1
HLA-DRB
HLA-B
HLA-DRB1
HLA-DQB1
HLA-DRB
HLA-C
HLA-DRB2
HLA-DQA2
HLA-DRB
HLA-E
HLA-DRB3
HLA-DQB2
HLA-DRB
HLA-F
HLA-DRB4
HLA-DQB3
HLA-G
HLA-DRB5
TAP1
HLA-H
HLA-DRB6
HLA-DPA1
TAP2
HLA-J
HLA-DRB7
HLA-DPB1
LMP2
HLA-K
HLA-DRB8
HLA-DPA2
LMP7
HLA-L
HLA-DRB9
HLA-DPB2
第三节 HLA的结构和分布
一、HLA抗原的分子结构
(一)HLAⅠ类抗原
HLA-A、B、C抗原是由第6号染色体相应Ⅰ类基因编码的α链(44kD)与第15号染色体编码的β2微球蛋白(β2 microglobulin，β2m，12kD)非共价结合的糖蛋白。α链由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区可进一步分为α1、α2和α33个功能区。跨膜区含疏水性氨基酸，排列成α螺旋，跨越脂质双分子层。胞内的氨基酸被磷酰化后有利于细胞外信息向胞内传递。β2m无同种特异性，与α3功能区连接，其功能为有助于Ⅰ类抗原的表达和稳定性，见图5.3。
图5.3 HLAⅠ类、Ⅱ类分子结构示意图
根据Ｘ线晶体衍射资料表明，Ⅰ类抗原分子顶部α1和α2区组成的抗原肽结合区呈沟槽状结构，α1和α2区各含4股β片层和1个α螺旋，呈对称排列而连接成一个沟槽，β片层组成槽底，其两侧由α螺旋组成。沟槽大小为2.5nm×1.0nm×1.1nm，可容纳8～12个氨基酸残基组成的短肽(图5.4A)。沟槽内氨基酸变化大，是Ⅰ类抗原多态性的基础。虽然抗原肽与Ⅰ类分子的结合有一定的选择性，但并不像抗原与抗体那样高度特异地结合，只要被结合的多肽有2～3个关键的氨基酸能恰当地连接到沟槽内的多肽结合基序(binding motif)的相应位置上，多肽即可与之结合，并被运送到细胞表面递呈给T细胞。所以每个Ⅰ类抗原分子能与一定广度的多肽谱结合。α3与β2m具有Ig恒定区样结构。α3为T细胞CD8分子的识别部位。
(二)HLAⅡ类抗原
HLA-DP、DQ、DR等Ⅱ类抗原是由Ⅱ类基因编码的α链(34kD)和β链(29kD)非共价连接的糖蛋白。α链和β链在内质网分别合成后，很快与第3条链—γ链(或称Ii链)结合成αβγ复合体，当复合体到达〖WTHZ〗MⅡC〖WT〗(内体/溶酶体样结构)，γ链解离、降解。γ链的存在，使α、β链不能与其他胞内蛋白结合，并协助αβ复合体转运到MⅡC，使之与抗原结合。α链和β链，均由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区各含两个功能区α1、α2和β１、β2(图5.3)。
Ｘ线晶体衍射图像显示，α1和β1区各自盘绕成一个α螺旋和β片层构成沟槽的一个侧壁和半个底面(图5.4B)。由于它的末端是开放的，故可容纳较长的多肽(约12～20个氨基酸)。该沟槽与多肽结合的特点基本上与Ⅰ类抗原相似，但被结合的多肽一般来自外源性抗原经加工处理降解的产物。α2、β2区靠近细胞膜，具有Ig样结构，β2为T细胞CD4分子的识别部位。
图5.4 Ⅰ类分子构槽(A)和Ⅱ类分子构槽(B)示意图
二、HLA抗原的分布
经典的HLAⅠ类抗原(HLAA、B、C系列)广泛分布于人体各种组织的有核细胞表面，包括血小板和网织红细胞。除某些特殊血型外，成熟红细胞一般不表达Ⅰ类抗原，神经细胞和成熟的滋养层细胞也不表达此类抗原。各种组织细胞表达HLAⅠ类抗原的数量不同，以外周血白细胞和脾、淋巴结、胸腺细胞的含量最丰富，其次为肺、肝、肾、皮肤、主动脉和肌肉。HLA-E、G、F抗原多特异地表达于组织发生时期的细胞。研究证明，滋养层细胞虽不表达经典的HLA-A、B、C抗原，却表达HLA-G抗原，后者可以保护滋养层细胞免受NK细胞的杀伤。
Ⅱ类抗原(HLADR、DP、DQ系列)的分布面较窄，主要分布于B细胞、MΦ细胞及其他的抗原递呈细胞(APC)、胸腺上皮细胞及血管内皮细胞等，被活化的T细胞及精细胞上亦有Ⅱ类抗原表达。有些组织在病理情况下(如病毒感染或ＩFＮ等细胞因子诱导时)亦可表达Ⅱ类抗原。近年研究表明，HLADM并不表达于细胞表面，而局限于胞质的MⅡC内，它能使Ⅱ类抗原的γ链与αβ链解离，从而促进外源性抗原肽与Ⅱ类分子结合。分布在细胞表面的HLAⅠ、Ⅱ类抗原，也可以可溶性形式出现在血清、尿液、唾液、精液及乳汁中。
第四节 HLA的生物学功能
HLA抗原(分子)最初是作为同种抗原诱发移植排斥反应而被发现的，但很快就认识到它在调节免疫应答和某些疾病的易感性中起重要作用。
一、对蛋白质抗原的处理与递呈
HLA最主要的功能之一是作为抗原递呈分子。已知两类HLA分子所递呈的抗原有不同的特点。细菌、蛋白质等非自身细胞产生的外源性抗原由APC吞噬或内化后，在内体中降解成肽段后移行到MⅡC，并与从内质网转运到MⅡC中的HLAⅡ类分子结合成抗原肽Ⅱ类分子复合体，运送到细胞表面供CD4＋T细胞识别(图5.5)。病毒抗原、肿瘤抗原等内源性抗原，在细胞质内首先经LMP降解成肽段，通过TAP(在内质网膜上)转运到内质网腔中，使之与新合成的HLAⅠ类分子结合成抗原肽Ⅰ类分子复合体，经高尔基体转运到细胞表面，供CD8＋T细胞识别(图5.5)。
.5 HLA分子对抗原的处理、转运示意图
最近研究发现，HLAⅠ类分子亦可与那些从吞噬小泡进入胞质中的外源性抗原(经LMP、TAP作用)结合，转运至细胞表面，引起CD8+T细胞应答。同样，在某些情况下，HLAⅡ类分子亦可与内原性抗原结合，引起CD4+T细胞应答。可见，HLA对抗原的处理与递呈是十分复杂的过程。
二、调节免疫应答
实验证明MHC分子在多方面参与免疫应答的调节。
(一)抗原肽-MHC-TCR三分子复合体启动免疫应答
抗原经APC处理成肽段后，一方面经配位或抗原限制位(agretope)与MHC的沟槽结合，一方面经表位(epitope)与相应的T细胞抗原受体(TCR)结合，组成抗原肽MHCTCR三分子复合体，启动免疫应答。
(二)MHC是协同刺激分子
当抗原肽MHC复合体与TCR结合的同时，MHCⅠ类分子或Ⅱ类分子分别与T细胞表面的CD8或CD4分子结合，以稳定抗原肽MHC分子与TCR的特异性结合，并使与CD4/CD8相关联的酪氨酸蛋白激酶P56lck活化。后者是T细胞活化的一个重要协同刺激信号，故MHC分子是协同刺激分子。
(三)MHC限制性
无论在免疫应答识别阶段T细胞与APC之间的作用，还是效应阶段T细胞与靶细胞之间的作用，都涉及到T细胞对与其作用细胞的自身MHC分子的识别，即只有当相互作用细胞双方的MHC分子一致时，免疫应答才能发生。这一现象称为MHC限制性(MHC restriction)。这是Doherty和Zinkernagel于1974年最早从动物实验证明的，两学者因此而荣获1996年诺贝尔奖。现已明确，细胞毒性T细胞(Tc)与靶细胞之间相互作用受MHCⅠ类分子限制，APC与辅助性T细胞(TH)之间、TH细胞与B细胞之间、T细胞与T细胞之间相互作用时受MHCⅡ类分子限制。关于MHC限制性的本质，目前认为，T细胞识别抗原时有两种识别，一是TCR识别与MHC结合的抗原肽，而MHC与抗原肽的结合是有一定选择性的，二是TCR尚需识别MHC分子多态部分的α螺旋。因此限制了TCR只能识别自身MHC分子递呈的抗原。TCR识别自身MHC分子的能力是T细胞在胸腺发育中获得的(详见第六章)。
(四)对免疫应答强弱的影响
不同个体所具有的不同MHC分子谱，可能控制着对特异性抗原应答的能力。如某个体的MHC分子与抗原配位的结合具有高度亲和力，则该个体对此抗原的免疫刺激呈高应答;相反，如与抗原配位呈疏松结合，则该个体对此抗原呈低应答。因此免疫应答的强弱直接决定于MHC分子与抗原配位结合的紧密性。此外，细胞表面MHC分子的密度亦影响免疫应答的强弱程度。
三、参与T细胞分化过程
胸腺上皮细胞表达的MHCⅠ、Ⅱ类分子和胸腺中APC表面的MHC自身抗原复合物，参与了胸腺细胞的阳性与阴性选择，使胸腺细胞分化发育成具有免疫功能的成熟T细胞(详见第六章)。
四、诱导同种免疫应答
在同种移植免疫应答中，HLA抗原既是激发同种免疫应答的抗原，又是同种免疫应答中效应阶段被攻击的靶抗原。在同种组织器官移植或输血中，它可在受者体内诱导产生相应的抗体和特异的Tc细胞，从而攻击移植物细胞而发生排斥反应。HLA抗原呈现很强的免疫原性，无论是Ⅰ类或Ⅱ类抗原，都能在体外直接诱导出强烈的初次T细胞免疫应答，即可导致CD4＋T细胞的活化和产生各种细胞因子，并能诱导CD8＋T细胞介导的杀伤效应或诱导部分CD4＋T细胞对表达Ⅱ类抗原的靶细胞的杀伤效应。这种情况可见于两个不同遗传背景的供者、受者淋巴细胞在体外共同培养的实验中，即混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，MLR)和特异的杀伤性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)反应。
第五节 HLA复合体的遗传特点及分型技术
一、HLA复合体的遗传特点
(一)单倍型遗传
连锁在一条染色体上的HLA各位点的基因组合称为HLA单倍型(HLA haplotype)。两个同源单倍型构成HLA的基因型(HLA genotype)。由于一条染色体上HLA各位点之间距离非常近，很少发生同源染色体间的交换。当亲代的遗传信息传给子代时，HLA单倍型作为一个单位遗传给下一代。因此，子女的HLA基因型中，一个单倍型与父亲相同，另一个与母亲相同。例如父亲的HLA单倍型为a和b，母亲的是c和d，则其子女可出现ac、bc、ad和bd 4种基因型的组合(图5.6)。这样，亲代与子代间有一个单倍型是相同的。同胞间，HLA基因型完全相同的机率为25％，完全不相同的机率亦为25％，一个单倍型相同的机率为50％。因此，从家庭内寻找器官移植的供者，其供、受者HLA抗原型别相同的机率比在无血缘关系的供、受者中高得多。
图5.6 HLA家系遗传示意图
(二)共显性遗传
HLA复合体为共显性遗传，即每对等位基因都能编码抗原，共同表达于细胞膜上，而不形成ABO血型系统中的隐性基因及免疫球蛋白基因中的等位基因排斥现象，这就大大增加了HLA抗原系统的复杂性和多态性。
(三)高度多态性
高度多态性是HLA复合体最显著的遗传特点。多态性是指在随机婚配的群体中，同一基因位点可存在两个或两个以上的基因，有的可多达几十个，甚至百余个基因。由于HLA复合体是多位点的共显性复等位基因系统，故具有高度多态性。到1996年WHO命名委员会公布的HLAⅠ类基因中，已发现HLA-A位点有61个复等位基因，B位点和C位点各有136个和37个复等位基因，HLA-E和G位点各有4个复等位基因。HLA-Ⅱ类基因多态性更为显著，HLA-DPA1、DPB1、DQA1、DQB1、DRA、DRB1位点分别有8、67、16、26、2和141个复等位基因数。因而在远交人群中，有数以百亿计的HLA单倍型和基因型。根据共显性遗传规则，在无血缘关系人群中，可检出各不相同的HLA表现型，这给同种移植时选择供体造成极大困难，但HLA复合体的高度多态性，是赋于机体具有能够适应内外环境多变的巨大潜力，因而具有重要的生物学意义。
(四)连锁不平衡
单倍型基因非随机分布的现象称为连锁不平衡(linkage disequilibrium)。如某些基因(A1与B8)经常在一起出现，其单倍型频率比理论值高，而另一些基因又较少出现。连锁不平衡产生原因尚不清楚。有人认为，连锁不平衡与某些疾病的发生有关。
二、HLA的分型技术
HLA分型不仅能应用于临床，更是免疫遗传学研究所必需。传统的血清学分型和细胞学分型技术主要侧重于HLA抗原特异性的分型，80年代建立的DNA分型技术则侧重于基因分析。
(一)血清学分型技术
1. HLAⅠ类抗原的检测
HLA-A、B、C抗原型别鉴定均使用微量补体依赖细胞毒试验(complement dependent cytotoxicity，CDC)。
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