多糖的提取工艺.doc

多糖的提取工艺摘要：目的利用响应表面实验设计优化茯苓皮中茯苓多糖的提取方法和工艺条件。方法利用单因素实验优化茯苓皮中茯苓多糖的提取方法，在单因素实验的基础上利用响应表面实验设计考察碱法提取过程中碱浓度、提取时间、料液比对多糖提取量的影响。结果茯苓皮中多糖的最佳提取方法为碱法提取,其提取条件可用回归方程 Y=7.8915.249X135.4X128.375X20.885 X227.333X1X2 描述。结论 最佳提取方法为碱法，最佳提取工艺条件为：NaOH浓度0.84 mol/L,时间8.89 h,料液比1150。关键词：茯苓皮； 茯苓多糖； 提取； 响应表面实验设计茯苓皮为多孔菌科真菌茯苓Ponia cocos (Schw) Wolf菌核的外皮，茯苓皮在临床上用量很少，绝大部分被当作废料弃去。茯苓皮中含有一定量的茯苓多糖，茯苓多糖具有保肝降谷丙转氨酶、增强免疫、镇静、降血糖及抗肿瘤等作用，被广泛应用于中成药、保健食品、美容药膳,具有较好的开发前景15。潘琦、段启等4，5曾分别进行过水提、碱提单因素实验研究和有机溶剂提取工艺的研究，本研究在水提、碱提和超声波提取单因素实验研究的基础上利用响应表面实验设计优化最佳提取工艺条件，为茯苓皮的开发利用奠定基础。1 器材1.1 主要仪器UV752型可见紫外分光光度计；JJ系列电子天平；赛多利斯BS系列电子天平；HHS型电热恒温水浴锅；HS10260D超声波提取器；XYJ802离心沉淀机。1.2 茯苓皮云南思茅地区加工茯苓白块所切削的茯苓皮干品，粉碎备用。1.3 主要试剂浓硫酸、氢氧化钠、苯酚、无水葡萄糖均为国产分析纯。苯酚溶液： 称取苯酚6 g，加水至100 ml即得。葡萄糖标准液：精密称取105下干燥恒重的葡萄糖100.3 mg加蒸馏水溶解并定容至100 ml。2 方法与结果2.1 茯苓多糖测定采用硫酸苯酚法按文献6中的方法测定。2.2 水提法称取一定量茯苓皮,在料液比一定的条件下，考察提取次数、提取时间和提取温度与茯苓多糖提取量的关系。2.3 超声波提取法称取一定量茯苓皮, 在料液比一定的条件下,考察超声提取时间和提取温度与多糖提取量的关系。2.4 碱法提取多糖称取一定量茯苓皮,在料液比一定的条件下，室温提取30 min，考察碱浓度与多糖提取量的关系。2.5 水提法2.5.1 提取次数的考察称取一定量茯苓皮，在料液比140，提取温度95，提取30 min/次的条件下，考察提取次数与茯苓多糖提取量的关系。（结果见图1）由图1可知，茯苓皮提取的多糖量随累积提取次数的增加而增加，但从第2次开始提取的多糖量并迅速减小，综合考虑提取过程中的能耗、水耗等因素，宜采用一次提取。2.5.2 提取时间的考察称取一定量茯苓皮，在料液比140，提取温度95， 提取一次的条件下,考察不同提取时间与多糖提取量的关系。（结果见图2）由图2可知, 在1020 min之间，茯苓皮多糖的提取量随提取时间的增加快速增加,20 min之后则变化缓和,故提取时间以2030 min为宜。next 2.5.3 提取温度的考察 称取一定量茯苓皮，在料液比140，提取时间30 min，浸提一次的条件下,考察提取温度与多糖提取量的关系。（结果图3）由图3可知,茯苓皮中多糖提取量在2040之间随提取温度的增加而增加，温度高于40后则呈下降趋势，6080之间变化不大,在沸腾状况(95)下原料处于不断运动状态，其多糖提取量有所上升，提示搅拌使茯苓皮不断运动有利于多糖的提取，故宜选用40搅拌提取。图1 茯苓皮水提取次数与多糖提取量的关系（略）图2 茯苓皮水提取时间与多糖提取量的关系（略）图3 茯苓皮水提取温度与多糖提取量的关系（略）2.6 超声波提取法2.6.1 超声提取时间的考察称取一定量茯苓皮, 在料液比140，超声频率40kHz，超声提取一次的条件下,考察超声提取时间与多糖提取量的关系。（结果见图4）由图4可知,茯苓皮多糖提取量随超声时间的增加而增大,当提取时间达到30 min后,提取时间对提取量的影响减小,曲线变得较平缓。故一次超声提取的时间以30 min为宜。图4 茯苓皮超声提取时间与多糖提取量的关系（略）2.6.2 超声提取次数的考察称取一定量茯苓皮, 在料液比140，超声频率40kHz，超声提取30 min/次的条件下,考察超声提取次数与多糖提取量的关系。结果见图5。2.7 碱法提取称取一定量茯苓皮，在料液比1200,室温浸提30 min条件下,考察碱浓度与多糖提取量的关系。结果见图6。结果表明茯苓皮多糖提取量在NaOH浓度0.250.5 mol/L之间呈上升趋势,当浓度大于0.5 mol/L以后呈下降趋势,故宜选NaOH浓度为0.5 mol/L为中心点进行二次旋转正交组合实验。图5 超声提取次数与多糖提取量的关系（略）图6 碱提取时碱浓度与多糖提取量的关系（略）图7 不同提取方法的结果比较（略）从图7可知，碱法提取多糖得率最高，故选择碱法进行进一步的优化工艺研究。2.8 二次旋转正交组合实验为了全面分析碱提过程中各因素交互作用对茯苓皮提取过程的影响,在料液比1150条件下，本研究采用23旋转响应表面实验设计进行,影响因子为NaOH浓度、浸提时间,结果指标为茯苓皮的多糖提取量。实验结果采用二次回归分析和方差分析，根据回归方程得出适宜的碱提工艺条件。实验设计及其测定结果见表12。表1 茯苓皮碱提因素水平（略）表2 32二次旋转正交组合实验结果（略）用两因子二次旋转正交组合实验统计程序对表2结果进行回归分析和方差分析，得到以多糖提取量为指标，以NaOH浓度X1(mol/L)和提取时间X2为变量的二次回归方程及其方差分析结果（见表3），结果表明茯苓皮多糖碱浸提中,在0.05水平上对多糖提取量影响显著的因素是X1 、X2的一次作用,X2的二次作用及X1X2的交互作用(P0.05)。表3 影响茯苓皮多糖提取量的回归分析及方差分析结果（略）由表3可知, 茯苓皮多糖碱浸提过程中, NaOH浓度X1、浸提时间提X2的一次作用、二次作用、交互作用对多糖提取量影响的数学模型为:Y=7.889 915.248 8X135.399 6X128.372 6X20.884 7 X227.333 3X1X2。该数学模型的相关系数0.967 7, 标准误差3.792 1,方差分析结果显著(Pd(越大越优)，D或d(双向远离均优)，模板会将数据x择下述公式之一变换：(x-d);(d-x)或(x-d)2。显然经此变换后，内部的分析程序就可统一按以大为优原则处理数据。模板的10版本上共设有4列试验结果列，允许用户输入并同时自动处理4套结果数据。若无4套结果，可以空置。程序读到空白列时即自动跳过此列，并在提示栏公布信息。22 试验结果的直观分析直观分析的原理在此不赘述，读者可参阅相应的统计书籍。直观分析图对EXCEL来说是易如反掌。但程序试用后，有用户反映图似多余，现10版本中予以删除。当然，直观分析图所展现的优选趋势，程序中已作相关的运算：除提示“可能好配合”外，凡是优选水平为中间值的，模板会提示“似在附近”；而优选水平为高低限的，则会提示“似为更高”或“似为更低”。此种处理，经部分药研工作者试用，反映较好。23 试验结果的方差分析方差分析的原理亦不赘述，读者亦可参阅书籍。方差分析是调用EXCEL自身集成的方差分析模块，并在本模板中巧妙组合。方差分析结果可提示因素的显著性和重要性，用以结合直观分析结果而共同确定最优水平。24 试验结果的最终优选综合程序确定的原则是：对于由方差分析提示的重要因素，其水平就取直观分析建议的优选水平，按其取优或建议补做进一步试验。对于方差分析提示为不显著或最不重要的因素，优选水平的确定由用户根据节约、高效、方便的原则自行确定。当然，程序仍给出“可能好配合”的建议。25 试验结果的交互作用分析交互作用的分析原理仍不赘述。在可分析交互作用的模板内，程序按通用规则进行处理，并兼顾直观和方差分析的结果，对所有的交互作用作显著性判断，最终对各交互作用的重要性排序并予提示性输出，并将交互作用考虑进最终的优选方向推荐中。作为数据处理应用系统，该软件已加载于安徽医科大学实验管理系统中，本研究第一作者可免费提示该程序离线用户版。3 药研应用实例甲氨蝶呤缓释体内植入剂的体外释放方法研究31 体外释放试验及测定方法体外释放试验方法为等距浸出法/换液杯法。按此方法试验，其释放模型经理论及试验证明，与杯法完全一致(已另文发表)5。体内吸收率与体外释放度的关联按中国药典2000年版规定的“点对点相关”方法试验和检验(已另文发表)6。此前测知：甲氨喋呤稀溶液约稳定5d(变异系数CV5%)，故确定释放介质每4d更换1次。取样时间点为：2h,8h,24h,48h,72h,96h(第1次换液)，144h，192h(第2次换液)，240h,288h(第3次换液)，384h。测定方法为2000年中国药典甲氨蝶呤项下方法。32 正交试验及因素水平选择影响体外释放的因素较多，一些是不容改变的，例如温度370.5。可选择改变的重要因素有4个：释放介质(种类)、介质浓度、介质体积及搅拌转速，设计为四因素三水平的正交优选试验。根据我们的实践，该四因素间交互作用较小(仅介质种类和浓度间可能有微弱的交互作用，而选择适当时亦可使浓度因素近似成为独立变量)，故以正交表L9(34)实施，以减少试验工作量。321 介质种类及水平的选择 该制剂的辅料为可降解型聚L乳酸。针对其特点，介质种类重点考虑介质的酸碱性：选酸、中及碱性3种，即pH值分别为6、7及8的二元缓冲溶液。322 浓度因素及水平的选择 对应地，浓度因素的类型定为等渗比例(稀释)浓度，而不选摩尔浓度和一般的质量|体积浓度。因后两者的同一水平对不同的介质有相对复杂的不同效应，但等渗比例浓度不然，同一水平有相同的渗透压(当然，稀释后为非等渗液)，并不论介质如何变化。特别地，渗透压又可能是影响药物体内释放与吸收的重要因素。323 浓度水平的选择 并不选0水平即纯水。因该水平将导致因素(介质种类)差异消失，不符合正交设计的初衷。实际设计为100%(等渗液)、25%(等渗液+水=1+3)、10%(等渗液+水=1+9)的比例等渗浓度。为了不漏掉对水介质影响释放的观察，在上述正交试验后，以优选的其他因素水平，另做以纯水为介质的试验。324 介质的体积及水平选择 以确保体外释放漏槽效应为前提而确定之：每试验杯/瓶投药1包装量(甲氨蝶呤5mg)，介质体积水平分别取100、200、500mL。325 搅拌转速及水平选择 参照2000年中国药典释放度项下规定，选转速水平为0、50、100r/min。33 正交试验结果(考核指标)的优选认定缓释制剂的体外释放是比较复杂的试验，其结果的优选判断亦很不易。我们选择的是综合考虑以下3套：331 各试验结果的拟合模型及拟合优度 模型为一级或Higuichi方程，拟合优度以相关指数与残差平方和之商(记作R2/Mse)衡量之，以大为优。332 各试验结果的精密度 各试验做3份平行样，求得各时间点的精密度(相对标准偏差RSD)和所有时间点的平均RSD，以小为优。为便于文中展示，求其倒数后输入(记作1/RSD)，仍以大为优。333 各试验达75%释放度的时间 以靠近10d为优(注：若考虑减小试验工作量，当采用适当的体外释放介质，使体外释放周期明显小于其标称体内缓释期。但据此前大量试验，若两者不同，体内外相关较难。故择相近的释放周期：以约10d达到75%释放度为优选目标)。该数据可按拟合模型求算，即取所得释放曲线上对应于75%释放度的天数d。按定值d为优方式，将此天数减10后平方再取倒数值(记作1/(d-10)2)，以大为优。34 试验结果341 正交试验数据正交表头的设计见表1，正交试验的结果见表2。表1 正交表头L9(略)表2 正交试验结果（略）表3 方差分析结果（略） 关于释放介质 从试验结果看，3类结果均显示释放介质是显著性因素，可能好水平为pH8。这符合该试药的特点。因辅料是聚L乳酸，它的高分子链端基因当然与稀碱溶液相容更好，故在碱性介质中的释放也相对最理想。试验中观察到：中或酸性的介质均导致释放偏慢，释放后期所取的样液浓度小，误差大，这亦是RSD变差，拟合优度下降的合理解释。 关于介质浓度 它的重要性仅在试验结果1/(d-10)2的分析中被提示，在另两类结果中均为最不重要因素。故就取被提示的可能好水平。试验中观察到：对被优选的碱性介质而言，浓度与释放速度成增函数关系，当介质浓度是100%时达75%释放度的时间是6d左右，而10%时达75%释放度的时间是13d左右，以25%(约10d)最符合我们的期望。 关于介质体积 3类结果均提示介质体积在200以下，其中试验结果R2/Mse提示为影响较显著，可能好配合为200。考虑到此体积并不算太大，试验中所取样液的浓度也较合适，就取此值为释放介质的体积。 关于搅拌转速 无须赘言，就取试验结果1/RSD的分析所提示的可能好水平50r/min，这也恰是3个水平中的中值。 正交实验数据处理我们知道如果有很多的因素变化制约着一个事件的变化，那么为了弄明白哪些因素重要，哪些不重要，什么样的因素搭配会产生极值，必须通过做实验验证(仿真也可以说是试验，只不过试验设备是计算机)，如果因素很多，而且每种因素又有多种变化(专业称法是：水平)，那么试验量会非常的大，显然是不可能每一个试验都做的。那我们这个试验来讲，影响主轴温升的因素很多，比如转速、预紧力、油气压力、喷油间隙时间、油品等等；每种因素的水平也很多，比如转速从8Krpm到20Krpm，等等，坤哥算了一下，所有因素都做，大概一共要900次试验，按一天3次试验计，要不停歇的做10个月，显然是不可能的。 能够大幅度减少试验次数而且并不会降低试验可行度的方法就是使用正交试验法。首先需要选择一张和你的试验因素水平相对应的正交表，已经有数学家制好了很多相应的表，你只需找到对应你需要的就可以了。所谓正交表，也就是一套经过周密计算得出的现成的试验方案，他告诉你每次试验时，用那几个水平互相匹配进行试验，这套方案的总试验次数是远小于每种情况都考虑后的试验次数的。比如3水平4因素表就只有9行，远小于遍历试验的81次；我们同理可推算出如果因素水平越多，试验的精简程度会越高。 建立好试验表后，根据表格做试验，然后就是数据处理了。由于试验次数大大减少，使得试验数据处理非常重要。首先可以从所有的试验数据中找到最优的一个数据，当然，这个数据肯定不是最佳匹配数据，但是肯定是最接近最佳的了。这是你能得到一组因素，这是最直观的一组最佳因素。接下来将各个因素当中同水平的试验值加和(注:正交表的一个特点就是每个水平在整个试验中出现的次数是相同的)，就得到了各个水平的试验结果表，从这个表当中又可以得到一组最优的因素，通过比较前一个因素，可以获得因素变化的趋势，指导更进一步的试验。各个因素中不同水平试验值之间也可以进行如极差、方差等计算，可以获知这个因素的敏感度。等等等等.还有很多处理数据的方法。然后再根据统计数据，确定下一步的试验，这次试验的范围就很小了，目的就是确定最终的最优值。当然，如果因素水平很多，这种寻优过程可能不止一次。 讲了这么多，你也许会问，你说那个表很准，能代表大趋势，为什么呢？这个问题是有证明的，不过我们不必去看那个证明(很复杂，看不懂:P)，我的考虑是这样的，如果我们将所有的试验情况排列成一条正交表所取得那些试验点，就肯定正好为于这条线的一组均分点上，由此就可以大致估算出整个试验的大致走向了，不过均分为多少个点倒是问题，取多了失去正交试验的意义，少了无法代表趋势，这点我还没考虑清楚。我师弟的考虑到是有道理，他认为取的这些点是所有试验点的一组最小正交基，也就是说所有试验点都可以由这几个基本点衍生表示，故而考虑基的性质就能推断所有的点的性质了，我觉得这个是个最好的解释了，呵呵。正交试验法（正交设计）这是目前最流行，效果相当好的方法。统计学家将正交设计通过一系列表格来实现，这些表叫做正交表。例如表2就是一个正交表，并记为，这里“L”表示正交表“9”表示总共要作9次试验，“3”表示每个因素都有3个水平，“4”表示这个表有4列，最多可以安排4个因素。 常用的二水平表有三水平表有四水平表有；五水平表有等。还有一批混合水平的表在实际中也十分有用，如等。 例如表示要求做16次试验，允许最多安排三个“4”水平因素，六个“2”水平因素。表2正交表 No.1234111112122231333421235223162312731228321393321 若用正交表来安排例1的试验，其步骤十分简单，具体如下： （1）选择合适的正交表。适合于该项试验的正交表有等，我们取，因为所需试验数较少。 （2）将A，B，C三个因素放到的任意三列的表头上，例如放在前三列。 （3）将A，B，C三例的“1”，“2”，“3”变为相应因素的三个水平。 （4）9 次试验方案为：第一号试验的工艺条件为A1 (80)，B1 (90分)，C1 (5%); 第二号试验的工艺条件为A1 (80)，B2 (120分)，C2 (6%)。这样试验方案就排好了。该例的进一步讨论请参考文献25。表 3正交试验方案No.ABC18090分5%280120分6%380150分7%48590分6%585120分7%685150分5%79090分7%890120分5%990150分6% 在表3的正交试验设计中，可以看到有如下的特点： 1）每个因素的水平都重复了3次试验； 2）每两个因素的水平组成一个全面试验方案。 这两个特点使试验点在试验范围内排列规律整齐，有人称为“整齐可比”。另一方面，如果将正交设计的9个试验点点成图（图7），我们发现9个试验点在试验范围内散布均匀，这个特点被称为“均匀分散”。正交设计的优点本质上来自“均匀分散，整齐可比”这两个特点。有关正交设计的详细讨论可参看文献2426，30。 正交试验设计正交试验设计正交试验设计(Orthogonal experimental design)是研究多因素多水平的又一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是分式析因设计的主要方法。是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。日本著名的统计学家田口玄一将正交试验选择的水平组合列成表格，称为正交表。例如作一个三因素三水平的实验，按全面实验要求，须进行33=27种组合的实验，且尚未考虑每一组合的重复数。若按L9(3)3正交表安排实验，只需作9次，按L18(3)7正交表进行18次实验，显然大大减少了工作量。因而正交实验设计在很多领域的研究中已经得到广泛应用。正交表是一整套规则的设计表格，用 。L为正交表的代号，n为试验的次数，t为水平数，c为列数，也就是可能安排最多的因素个数。例如L9(34)， (表11)，它表示需作9次实验，最多可观察4个因素，每个因素均为3水平。一个正交表中也可以各列的水平数不相等，我们称它为混合型正交表，如L8(424) (表12)，此表的5列中，有1列为4水平，4列为2水平。根据正交表的数据结构看出，正交表是一个n行c列的表，其中第j列由数码1，2， Sj 组成，这些数码均各出现N/S 次，例如表11中，第二列的数码个数为3，S=3 ，即由1、2、3组成，各数码均出现 次。正交表具有以下两项性质：(1)每一列中，不同的数字出现的次数相等。例如在两水平正交表中，任何一列都有数码“1”与“2”，且任何一列中它们出现的次数是相等的；如在三水平正交表中，任何一列都有“1”、“2”、“3”，且在任一列的出现数均相等。(2)任意两列中数字的排列方式齐全而且均衡。例如在两水平正交表中，任何两列(同一横行内)有序对子共有4种：(1，1)、(1，2)、(2，1)、(2，2)。每种对数出现次数相等。在三水平情况下，任何两列(同一横行内)有序对共有9种，1.1、1.2、1.3、2.1、2.2、2.3、3.1、3.2、3.3，且每对出现数也均相等。以上两点充分的体现了正交表的两大优越性，即“均匀分散性，整齐可比”。通俗的说，每个因素的每个水平与另一个因素各水平各碰一次，这就是正交性。