萌发小麦种子中淀粉酶的提取.doc

萌发小麦种子中淀粉酶的提取、酶活性的测定及PH、温度、激活剂、抑制剂对酶活性的影响
(东北农业大学生命科学学院, 哈尔滨:150030)

摘要：从萌发的小麦种子中通过离心方法提取淀粉酶，采用分光光度计法绘制麦芽糖标准曲线，并在此基础上测定萌发小麦种子中淀粉酶的活性。温度、PH值、激活剂、抑制剂是影响酶活性的几个重要因素。本实验结果表明，在PH=5.6，T=40℃的条件下，小麦种子中淀粉酶总活性为2325.71mg/g·5min ，而α-淀粉酶的活性为246.33mg/g·5min；40℃左右时，酶的活性最高，室温下活性较高，0℃时淀粉酶活性明显下降，100℃时淀粉酶几乎已失活；PH为5.6时，酶的活性最大，PH=3.6时和PH=8.0时淀粉酶活性降至最低； Cl-使酶的活性增强，Cu2+使酶活性减弱。

关键词：淀粉酶 酶活性 温度 PH 激活剂 抑制剂

前言： 生物体内的新陈代谢是一切生命活动的基础。新陈代谢是由许多复杂而有规律的化学反应组成，酶是生物体系中的催化剂，生物体内的各种化学反应包括物质转化和能量转化，都是在特定的酶催化下反应的，由于自然界中生物长期进化和组织功能分化的结果，酶在机体中受到严格的调控，使错综复杂的代谢过程有序进行。可以说，没有酶的参与，生命活动即告终止，所以酶学的深入研究在探讨生命现象的本质上使至关重要的[1]。
大多数酶的本质是蛋白质。酶的特性决定了其研究内容的特殊性。随着生物化学、分子生物学、基因工程、化学工程等相关学科的发展，酶学研究早已进入一个崭新的阶段。现代酶学的研究主要包括酶学理论、酶工程和酶应用3部分[2]。它们是现代生物技术的重要组成部分，应用范围包括医药，食品，化学工业，诊断分析和生物传感器，涉及的品种不少，如淀粉酶，其市场需求生产规模和产值均很乐观，并已产生巨大经济效益[3]。
生物体内的各种代谢变化都是由酶驱动的,酶有两种功能:其一，催化各种生化反应,是生物催化剂；其二，调节和控制代谢的速度、方向和途径，是新陈代谢的调节元件。酶对细胞代谢的调节主要有两种方式:一是通过激活或抑制以改变细胞内已有酶分子的催化活性；另一种是通过影响酶分子的合成和降解，以改变酶分子的含量。这种酶水平的调节机制是代谢的最关键的调节[4]。
按照淀粉酶水解淀粉的作用方式，可以分为α-淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶和麦芽糖酶四种类型。实验证明，当谷类种子萌发时，两类淀粉酶（α，β型）都存在，淀粉酶总酶活性随种子萌发将升高，有利于淀粉被降解为植物生长发育所需的葡萄糖。许多微生物包括细菌、真菌和酵母都能生产淀粉酶，这些廉价的淀粉酶来源，已广泛应用于食品、医药、饲料和环保等生产实践中[5]。在医学上测定淀粉酶活性的方法有：简易快速纸片测定法[6]；苏木杰氏快速计时法[7]；单一稳定液体试剂直接测定法[8]等。
池永焕， 黄菱红等探究了温度对淀粉酶活性的影响[9]；沈文英,胡洪国,潘雅娟研究了温度和PH值对南美白对虾(Penaeus vannmei)消化酶活性的影响[10]；司红起,马传喜,董召荣,吴大鹏,高俊进行了小麦多酚氧化酶抑制和激活效应的研究[11]。本实验仅限于酶学研究的最基本的理论和实验技能。通过此次实验研究，能够进一步加深对淀粉酶的认识和学习，学会科学合理的设计实验方案,为以后的研究打下坚实的基础。

1.材料与方法
1.1材料、仪器、试剂
1.1.1材料
萌发的小麦种子(芽长约5cm)。将小麦种子用28℃～30℃的温水浸泡3～5小时，充分吸水膨胀。把湿润的细沙倒入盆中撒入浸泡的小麦种子，播种深度约3厘米，以后保持细沙湿度；7天后刨出麦种，即得芽长约5cm的小麦种子。
1.1.2仪器
分光光度计；离心机；配两支25mL离心管 ；小台秤；研钵；容量瓶100mL；具塞刻度试管；试管；移液管；恒温水箱。
1.1.3主要试剂及配制方法
    ①1％淀粉：称取1.0g淀粉定容到100mL容量瓶中。
    ②0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：A液：称取柠檬酸20.01 g，溶解后稀释至l000 mL；B液：称取柠檬酸钠29.41 g，溶解后稀释至1000 mL。取A液55 mL与B液145 mL混匀，即为pH5.6的缓冲液。
  ③DNS-试剂：精确称取3, 5–二硝基水杨酸1 g溶于20 mL 2 mol/L NaOH中，加入50 mL蒸馏水，再加入30 g酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100 mL，盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入。
④麦芽糖标准液：称取麦芽糖0.100 g溶于少量蒸馏水中，仔细移入100 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。
⑤0.4mol/L的NaOH。
1.2方法
1.2.1 麦芽糖标准曲线制作
取干净的25ml刻度试管7个，编号，分别加入麦芽糖标准液（1mg/ml）0.0、0.2、0.6、1.0、1.4、2.0、2.5ml。然后于各瓶加蒸馏水使溶液达2.5ml。再各加入3，5-二硝基水杨酸试剂2.0ml，至沸水中准确煮5min，取出冷却至室温。用蒸馏水稀释至25 ml，摇匀。用分光光度计在520nm的波长下进行比色，记录吸光值，绘制麦芽糖标准曲线。
绘出麦芽糖标准曲线如图1.

图1  麦芽糖标准曲线
1.2.2 酶液的提取 
称取2.0克萌发的小麦种子,于研钵中加2mL蒸馏水和少量硼砂，研磨成匀浆，倒入50ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度线处，混匀后在室温下静置，每隔数分钟震荡一次，放置20分钟后，开始离心（4000r/min）10分钟，取上清液备用。
1.2.3 α-淀粉酶活性的测定
 用1.2.2中的上清液作酶液，取25mL具塞刻度试管5只，按表1处理。
表1  α-淀粉酶活性的测定
项目
空白
对照
处理
0
1
2
3
4
酶溶液/mL
0
1
1
1
1
70℃反应15min

√
√
√
√
pH=5.6柠檬酸缓冲液/mL
1
1
1
1
1
0.4mol/L NaOH/mL
4
4
4
0
0
40℃预热10min

√
√
1%淀粉/mL（预热）
0
2
2
2
2
40℃反应5min

√
√
0.4mol/L NaOH/mL
0
0
0
4
4
取反应后溶液2mL，再各加入3，5-二硝基水杨酸试剂2.0ml，至沸水中准确煮5min，取出冷却至室温。用蒸馏水稀释至25 ml，摇匀。用分光光度计在520nm的波长下进行比色，记录吸光值。
1.2.4  总酶活性的测定  
 取1.2.2中的上清液2mL用蒸馏水稀释至50mL作以后所有所需的酶液。按1.2.3继续进行（只需去掉“70℃水浴15min”一步）
1.2.5     温度对酶活性的影响   
取8只试管按表2处理。
表2  温度对淀粉酶活性的影响

试管编号
空白组
A
a
B
b
C
c
D
d
pH=5.6柠檬酸缓冲液/mL
1
1
0
1
0
1
0
1
0
酶溶液/mL
0
1
0
1
0
1
0
1
0
蒸馏水/mL
1
0
0
0
0
0
0
0
0
1%淀粉/mL
2
0
2
0
2
0
2
0
2
温度
常温
4℃
25℃
40℃
100℃
该温度下反应5min

√
√
√
√
0.4mol/L NaOH/mL
4
4
4
4
4

取反应后溶液2mL，再各加入3，5-二硝基水杨酸试剂2.0ml，至沸水中准确煮5min，取出冷却至室温。用蒸馏水稀释至25 ml，摇匀。用分光光度计在520nm的波长下进行比色，记录吸光值。
1.2.6    pH值对酶活性的影响   
按表3配不同pH的柠檬酸缓冲液。

表3不同pH的柠檬酸缓冲液
pH
0.2mol/LNa2HPO4/mL
0.1mol/L柠檬酸/mL
2.6
2.18
17.82
3.6
6.44
13.56
4.6
9.38
10.65
5.6
11.60
8.40
6.6
14.55
5.45
7.6
18.73
1.27
8.0
19.45
0.55
取8只试管按表4处理。
表4 pH值对酶活性的影响
试管编号
空白组
1
2
3
4
5
6
7
1mL缓冲液的pH

2.6
3.6
4.6
5.6
6.6
7.6
8
酶溶液/mL
0
1
1
1
1
1
1
1
蒸馏水/mL
2
0
0
0
0
0
0
0
40℃水浴15min
√
√
√
√
√
√
√
√
已预热的1%淀粉/mL
2
2
2
2
2
2
2
2
40℃反应5min

√
√
√
√
√
√
√
0.4mol/L NaOH/mL
4
4
4
4
4
4
4
4
取反应后溶液2mL，再各加入3，5-二硝基水杨酸试剂2.0ml，至沸水中准确煮5min，取出冷却至室温。用蒸馏水稀释至25 ml，摇匀。用分光光度计在520nm的波长下进行比色，记录吸光值。
1.2.7    激活剂与抑制剂对酶活性的影响  
 取5只试管按表5处理。
表5激活剂与抑制剂对酶活性的影响
组别
0
1
2
3
4
0.3%NaCl溶液/ml
0
1
0
0
0
0.3%CuSO4溶液/ml
0
0
1
0
0
0.3%Na2SO4溶液/ml
0
0
0
1
0
蒸馏水/mL
3
0
0
0
1
pH=5.6柠檬酸缓冲液/mL
1
1
1
1
1
酶溶液/mL
0
1
1
1
1
取反应后溶液2mL，再各加入3，5-二硝基水杨酸试剂2.0ml，至沸水中准确煮5min，取出冷却至室温。用蒸馏水稀释至25 ml，摇匀。用分光光度计在520nm的波长下进行比色，记录吸光值。
2            结果与分析
2.1      萌发小麦种子中α-淀粉酶活性为246.3mg/g·5min ，总酶活性为2325.7mg/g·5min。
萌发的小麦种子中有α–淀粉酶和β–淀粉酶，其活性因植物的生长发育时期不同而有所变化。α–淀粉酶和β–淀粉酶，各有其一定的特性，如β–淀粉酶不耐热，在高温下易钝化，而α–淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下则发生钝化。通常提取液中同时有两种淀粉酶存在，测定时，将提取液加热到70℃维持15 min以钝化β–淀粉酶，便可测定α–淀粉酶的活性。当然也可以将提取液用pH3.6之醋酸在0℃加以处理，钝化α–淀粉酶，以求出β–淀粉酶的活性，但相对前者，比较困难。淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖，可用3，5–二硝基水杨酸试剂测定。由于麦芽糖能将后者还原生成3–氨基–5–硝基水杨酸的显色基团，在一定范围内其颜色的深浅与糖的浓度成正比，故可求出麦芽糖的含量。以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。3, 5-二硝基水杨酸法(简称DNS法)是目前农业科研中应用最为普遍的一种方法,该法灵敏、准确,但测定步骤较繁,特别是分析大量样品较为不便。凝胶扩散法是近几年在国内外特别在鉴定小麦穗发芽中常用的一种方法(Masojc法)[12]。该法简便易行,但灵敏度与准确度较低,只能作为鉴定小麦穗发芽的参考。但随着该方法的不断改进[13],灵敏度和重复性都有了很大的提高,已成为测定α-淀粉酶活性的一种简便有效方法[14]。本实验由于实验要求的精度和灵敏度较高，所以采用了DNS法。
1.2.3的实验数据见表6
表6 α-淀粉酶活性的测定实验数据
α-淀粉酶
空白
对照
处理
A520nm比色
0
0.492
0.495
1.151
1.153

则吸光度A=(1.151+1.153-0.492-0.495)/2=0.659
通过标准曲线可得此吸光度对应的麦芽糖质量为2.463mg
根据公式
α-淀粉酶活性
=
对应的麦芽糖质量（mg）×稀释总体积(50×8mL)
样品鲜重(2.0g) ×反应时间（5min）×显色用酶液体积（2mL）
求得：PH=5.6 T=40℃的条件下，萌发小麦种子中α-淀粉酶活性为246.3mg/g·5min。
1.2.4的实验数据见表7
表7总酶活性的测定实验数据
α+β-淀粉酶
空白
对照
处理
A520nm比色
0
0.271
0.274
0.521
0.523

则吸光度A=(0.521+0.523-0.274-0.271)/2=0.250
通过标准曲线可得此吸光度对应的麦芽糖质量为0.930mg
根据公式
α+β-淀粉酶
=
对应的麦芽糖质量（mg）×稀释总体积(50×8×25mL)
样品鲜重(2.0g) ×反应时间（5min）×显色用酶液体积（2mL）
求得：PH=5.6 T=40℃的条件下，萌发小麦种子中淀粉酶活性为2325.7mg/g·5min。
2.2 40℃左右淀粉酶活性最大
温度能够影响化学反应的速率，酶促反应也不例外，当温度升高时，单位体积内活化分子数增多，有更多的的反应物分子能越过反应能垒，生成产物分子，使反应速率加快；酶的化学本质是蛋白质，当温度很高时酶分子的空间结构会发生变化，酶变性失活。因此酶促反应有其最适温度。本实验结果表明，温度对酶的作用有双重影响，一方面如其他的化学反应一样，升高温度反应速率会增大，另一方面，又会加速酶蛋白的变性速度。因此，在较低的温度范围内（0℃---40℃），酶反应速度随温度升高而增大，但超过一定温度（40℃）后，反应速率反而会下降。温度达到70℃后，酶活性已经很低，主要原因是β–淀粉酶不耐热，在高温下易钝化。在100℃酶已经完全失活，但因为标准曲线不过原点，导致酶活性并不为零。
1.2.5的实验数据记录见表8
表8温度对酶活性的影响实验数据 
试管编号
空白组
0℃
25℃
40℃
100℃
A520nm比色
0
0.015
0.153
0.249
0.012
做出柱形图比较，见图2。

图2温度对酶活性的影响
2.3 pH为5.6左右时淀粉酶活性最大
PH值是影响酶活的主要因素，通常各种酶只在一定的PH范围内才表现出活性，同一种酶在不同的PH下所表现的活性不同，其活性最高时的PH称为酶的最适PH。PH影响酶分子构象的稳定性,影响酶分子极性基团的解离状态,也影响底物的解离。PH值不是酶的特定常数,它可随底物的浓度和种类、酶的纯度、缓冲液的种类和浓度、温度、反应时间长短以及抑制物的作用等而改变[15]。本实验结果表明在PH2.2-8.0范围内以0.2为变化梯度测量了酶活性随ph的变化而变化大趋势，可以得出结论，淀粉酶的最适ph为5.6.但不能说明使酶失活的PH是什么范围。在一定PH范围内，酶的活性随PH的升高而升高，当达到某一PH（5.6左右）时，酶的活性达到最大，当超过这一PH时，酶的活性随PH的升高而降低，实验结果表明，下降幅度要小于上升幅度。主要原因是，α–淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下则发生钝化。
1.2.6实验数据记录，见表9
表9 pH值对酶活性的影响实验数据
pH
空白组
2.6
3.6
4.6
5.6
6.6
7.7.
8.0
A520nm比色
0
0.052
0.101
0.177
0.253
0.190
0.142
0.120
做出柱形图比较，见图3

图3 pH值对酶活性的影响
2.4 Cl-使酶的活性增强，Cu2+ 使酶活性减弱。
α-淀粉酶是金属酶,很多金属离子,特别是重金属离子对其有抑制作用;另外,巯基,N-溴琥珀酸亚胺,p-羟基汞苯甲酸,碘乙酸,BSA,EDTA和EGTA等对α-淀粉酶也有抑制作用。在酶反应液中加入某些特定的物质可改变酶的活性，增大酶活性的物质为激活剂，降低酶活性的为抑制剂。激活剂有多种，如有一些金属离子能够作为辅酶，参与化学反应,有的通过形成螯合物建立起酶与底物的桥梁，还有的能够维持酶的稳定构象。抑制剂分为可逆和不可逆两类，其本质是抑制剂与酶的活性中心结合，改变了酶活性部位的结构及性质，引起酶活性下降，或是与底物、中间产物结合从而降低了反应的速率[16]。本实验结果表明，Cl-使酶的活性增强，Cu2+ 使酶活性减弱。
1.2.7的实验数据记录，见表10
表10激活剂与抑制剂对酶活性的影响实验数据
试剂
NaCl
CuSO4
Na2SO4
蒸馏水
吸光度A
0.311
0.163
0.202
0.251
做出柱形图比较，见图4

图4激活剂与抑制剂对酶活性的影响

3 结论与讨论
研究结果表明，PH=5.6，T=40℃的条件下，萌发小麦种子中淀粉酶总活性为2325.71mg/g·5min ，而α-淀粉酶的活性为246.33mg/g·5min；40℃左右时，酶的活性最高，室温下活性较高，0℃时淀粉酶活性明显下降，100℃时淀粉酶几乎已失活；PH为5.6时，酶的活性最大，PH=3.6时和PH=8.0时淀粉酶活性降至最低； Cl-使酶的活性增强，Cu2+使酶活性减弱。
然而，想要得出40℃是否是淀粉酶的最适温度，还要通过进一步的实验来探究。事实上，酶最适温度不是一个恒定的数值，它受底物的种类、浓度、缓冲溶液成分及反应条件等影响，最适温度也不是酶的特征性物理常数。酶作用时间长短影响最适温度值。酶在短时间内能耐受较高温度;当反应时间延长时,最适温度向低温方向移动例如，反应时间延长，最适温度将降低。同样,想得出PH=5.6是否是淀粉酶的最适PH，还要通过进一步的实验来验证。由于加入NaSO4 与加入蒸馏水的试管中反应淀粉酶活性相近，Na+和SO42-的激活或抑制作用有待进一步验证，也可能二者对淀粉酶的活性无影响。
目前，国内外对小麦发芽过程中酶活力变化规律的研究比较多，如对小麦发芽过程中淀粉酶活力变化规律的研究等。而大多数研究对小麦发芽前浸泡条件的选择都不固定，但小麦浸泡条件的差异对小麦的发芽情况同样有着较大的影响。刘聪，安家彦[17]对不同浸泡条件对小麦中淀粉酶活力的影响进行了研究，，浸泡温度对小麦浸泡后的α-淀粉酶活力影响高度显著。最佳的浸泡条件为浸泡温度20℃，＂浸四断十＂工艺，加碱（生石灰）量0.015%。发芽前最佳的浸泡条件对小麦发芽产生了积极的影响，能增强芽过程中α-淀粉酶活力。因此，本实验的材料制备步骤还有待改进。
已有研究表明,电场处理可使酶的活性发生改变[18],并提出酶活发生变化的机制可能是电场处理导致酶的静电性质和构象发生改变[19]。因此，对环境影响淀粉酶活性的研究还远远没有结束，应该继续对物理、化学因素影响酶活性的效果和激励做进一步的研究。

参考文献

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