酵母基因工程.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,二、酵母基因工程,酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征,酵母菌的宿主系统,酵母菌的载体系统,酵母菌的转化系统,酵母菌的表达系统,利用重组酵母生产乙肝疫苗,1996,完成第一个真核生物,-,酿酒酵母全基因组测序。,Clarck-Walker,和,Miklos,发现在多数酿酒酵母,中存在质粒。,1978,Hinnen,将来自一株酿酒酵母的,leu2,基因导入,另一株酿酒酵母，弥补了后者,leu2,的缺陷，,标志着酵母表达系统建立。,1981,Hitzeman,用酿酒酵母成功表达人,IFN,。,1983,我国首次用酵母菌表达,HBV HBsAg,基因。,（一）酵母菌作为外源基因表达受体菌的特征,酵母菌,(Yeast),是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核生物。,如果说,E.coli,是外源基因最成熟的原核生物表达系统，,Yeast,则是,最成熟的真核生物表达系统,。,酵母菌表达外源基因的优势：,全基因组测序，基因表达调控机理清楚，遗传操作简便。,具有真核生物蛋白翻译后加工修饰系统。,大规模发酵工艺简单、成本低廉。,不含特异性病毒、不产毒素，被美国,FDA,认定为安全的基因工程受体系统。,能将外源基因表达产物分泌至培养基中。,表达产物的糖基化位点和结构特点与高等真核生物有差距。,酵母菌表达外源基因的缺点：,（二）酵母菌的宿主系统,用作模式真核生物的酵母宿主菌,用于外源基因表达的酵母宿主菌,提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌,抑制超糖基化作用的突变宿主菌,减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌,1,、用作模式真核生物的酵母宿主菌,基因表达调控机理与高等真核类似。,酿酒酵母,(,Saccharomyces cereviasiae,),：,无性繁殖（芽殖或裂殖）、单细胞、真核生物；,繁殖方式与原核类似，易于操作；,酿酒酵母,(,Saccharomyces cerevisiae,),：,最成熟的真核细胞表达系统；,表达水平低；,产物过度糖基化。,2,、用于外源基因表达的酵母宿主菌,巴斯德毕赤酵母,(,Pichia pastoris),多形汉逊酵母,(,Hansenula polymorpha),甲醇酵母：,可利用甲醇作为唯一碳源；,表达水平高；,产物糖基化更合理。,特点：,乳酸克鲁维酵母,(,Kluyveromyces lactis,),非洲酒裂殖酵母,(,Schizosaccharomyces pombe),其它酵母：,已有,60,多种酵母菌建立了转化系统。,酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最详尽，但,巴斯德毕赤酵母,表达外源基因最理想。,3,、提高外源蛋白表达产率的突变宿主菌,能提高外源基因表达或分泌的突变类型,改善外源蛋白分泌,提高外源基因表达,提高外源基因表达,提高外源基因表达,改善外源蛋白分泌提高外源基因表达,突变类型 生物效应 作用位点,ssc,1,ssc,2,rgr,1,ose,1,ssc,11,rho,钙离子依赖型,ATP,酶,转录后加工,转录水平,转录水平,羧肽酶,Y,转录水平,如,：,rho,突变株,中人溶菌酶表达量提高,10,倍。,4,、抑制超糖基化的突变宿主菌,措施：,构建超糖基化缺陷突变株。,酵母菌普遍拥有蛋白质糖基化系统，但野生型酵母菌对外源蛋白的糖基化反应很难控制，呈,超糖基化,倾向。,抑制超糖基化的突变类型,mnn,甘露糖生物合成缺陷,alg,Asn,侧链糖基化缺陷,och,外侧糖链添加缺陷,突变类型 生物效应,如：,人,1-,抗胰蛋白酶、人,tPA,在酿酒酵母,mnn9,和,och1,突变株中高活性表达。,5,、减少泛素依赖型蛋白降解的突变宿主菌,泛素介导的蛋白质降解作用,HOOC,泛素,76aa,Lys,靶蛋白,Lys,靶蛋白,泛素连接酶,E3,Lys,靶蛋白,泛素连接酶,E3,蛋白酶体,靶蛋白降解,泛素释放,酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因：,UBI,1 编码泛素-羧基延伸蛋白52,对数生长期表达 稳定期关闭,UBI,2 编码泛素-羧基延伸蛋白52,对数生长期表达 稳定期关闭,UBI,3 编码泛素-羧基延伸蛋白76,对数生长期表达 稳定期关闭,UBI,4 编码泛素五聚体 对数生长期关闭 稳定期表达,酵母菌有,4,个泛素编码基因,：,酵母菌有,7,个泛素连接酶基因,：,UBC,1、,UBC,2、,UBC,3、,UBC,4、,UBC,5、,UBC,6、,UBC,7,泛素降解途径衰减的酿酒酵母,UBI,4缺陷型：,在酿酒酵母菌中，泛素主要由,UBI,4,基因表达。,UBI,4突变株能正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株低得多，是外源基因表达的理想受体。,UBA,1缺陷型：,UBA,1编码泛素激活酶,E1，,是一种看家基因。,UBA,1突变株是致死性的，但其等位基因缺陷是非致死性的，且能削弱泛素介导的蛋白降解。,UBC4,-,UBC5,双突变型：,UBC4,-,UBC5,双突变型,能,大幅度,削弱泛素介导的蛋白降解。,7,个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。,（三）酵母菌的载体系统,酵母附加型质粒（,YEp,）,酵母复制型质粒（,YRp,）,酵母着丝粒质粒（,YCp),酵母人工染色体（,YAC,）,酵母整合型质粒（,YIp,）,2,质粒（酿酒酵母,）,人工构建质粒：,野生型质粒：,酿酒酵母中的2,环状质粒：,RAF,REP1,STB,ori,REP2,FLP,IR,IR,A,野生型，双链、环状，,6kb,，拷贝数50,-,100。,同源重组,B,IRs,:,反向重复序列，同源重组,FLP,:,编码产物驱动,IRs,同源重组,REP,:,编码产物控制质粒稳定性,STB,:REP,结合位点,含有多个单一酶切位点，便于克隆操作；,人工构建酵母质粒的共同特点：,含有,E.coli,质粒复制起点，便于克隆操作；,含有在酵母和,E.coli,中进行选择的双标记；,除,YIp,型质粒外均为穿梭载体。,YEp,质粒：,复制子：源自,2,质粒；,拷贝数：,50-100,；,不稳定：培养几代后，质粒丢失率高达50-70%，主要由于分配不均匀所致。,YRp,质粒：,不稳定：培养几代后，质粒丢失率高达50-70%，主要由分配不均匀所致。,复制子：源自酵母染色体的,ARS,；,ARS,:,a,uto,r,eplication,s,equence,拷贝数：,50-100,；,YCp,质粒：,拷贝数：,1-5,。,在,YRp,中引入,CEN,；,CEN,：着丝粒，源自酵母,3,号染色体，有丝分裂稳定，拷贝数低。,复制子：源自酵母染色体,的,ARS,；,YAC,质粒：,用于大型基因文库,构建。,在,YCp,中引入,TEL,；,TEL,：端粒，,酵母,染色体,末端序列，利于线性,DNA,末端稳定；,稳定性,随着插入,DNA,片段的增大而增加；,YIp,质粒：,拷贝数：通常为,1,只有,E.coli,的复制子；,引入酵母基因组的同源序列：以标记基因,his3,5,和,3,端作同源序列；,载体以同源重组方式，,整合,入酵母基因组；,（四）酵母菌的转化系统,转化质粒在酵母细胞中的命运,酵母菌的转化方法,用于转化子筛选的标记基因,酵母菌的转化方法,原生质体转化法,碱金属离子介导转化法,电击转化法,原生质体转化法,在,Ca,2+,和,PEG,存在下，转化子可达原生质体总数的,1-2%,。,对线型和环状,DNA,的吸收没有特异性。,1,个受体细胞可同时接纳多个质粒分子，这种,共转化,的原生质体占转化子总数的,25-33%,；,特点：,原生质体转化法的缺点：,转化率受原生质再生率的严重制约。,操作周期长；,2,）碱金属离子介导转化法,酵母菌,完整细胞,经碱金属离子,(,如,Li,+,),、,PEG、,热休克处理后，可高效吸收质粒,DNA,。,吸收线型,DNA,的能力明显大于环状,DNA，,二者相差80倍。,共转化现象极为罕见；,特点：,3,）电击转化法,适用范围广。,酵母菌,完整细胞,或,原生质体,可在电击下吸收质粒,DNA,。,特性：,转化率高；,操作方便；,转化质粒在酵母细胞中的命运,1,）单、双链,DNA,均可转化酵母菌，单链的转化率是双链的10-30倍。,2,）,含复制子,的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制。,3,）,不含复制子,的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体，这对体内定点突变酵母基因组极有利。,4,）克隆在整合型质粒,YIp,上的外源基因，若含受体细胞染色体,DNA,的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子的,50-80%,。,用于转化子筛选的标记基因,营养缺陷型互补基因,显性基因,宿主菌：,氨基酸或核苷酸生物合成缺陷型突变,如：,LEU,-,、TRP,-,、HIS,-,、URA,-,营养缺陷型互补基因,载体：,携带相应的合成基因,如：,leu1/leu2,、,trp1,、,his3/his4,、,ura3,选择压力：,不完全培养基,如：,YNB,、无机盐培养基,显性标记基因编码产物主要是毒性物质的抗性蛋白。,显性标记基因,氨基糖苷转移酶,抗,G418,氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素,二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋呤和磺胺,铜离子螯合物 耐受铜离子,蔗糖转化酶 耐受高浓度蔗糖,乙酰乳糖合成酶 抗硫酰脲除草剂,标记基因 编码产物 遗传表型,aph,cat,dhfr,c,up1,suc2,ilv2,（五）酵母菌的表达系统,酿酒酵母表达系统,甲醇酵母表达系统,1,、酿酒酵母表达系统,酿酒酵母系统启动子,酿酒酵母密码子的偏爱性,酿酒酵母分泌系统,酿酒酵母糖基化系统,酿酒酵母表达系统存在的问题,1,）酿酒酵母系统启动子,UAS,：上游激活序列,TATA,盒,：富含,AT,URS,：上游阻遏序列,DAS,：下游激活序列,UAS,URS,TATA,起始位点,编码序列,mRNA,40-120bp,20-40bp,100-1400bp,DAS,甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因,(,GAPDH,),磷酸甘油激酶基因,(,PKG,),乙醇脱氢酶基因,(,ADH,),酿酒酵母表达系统常用启动子：,糖酵解途径中关键酶的强启动子，受,葡萄糖诱导：,半乳糖激酶启动子,(,GAL1),野生型,GAL4,表达水平低，产物活性可被,GLAL80,产物完全抑制，半乳糖诱导效果差。,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,GAL1,、,GAL7,和,GAL10,基因连锁在一起，独立转录，共同调控；,GAL4,产物与,UAS,结合，促进转录；,GAL80,产物抑制,GAL4,产物的活性，阻遏转录；,半乳糖诱导,GAL4,高表达，不受,GAL80,产物抑制，激活,GAL1,、,GAL7,、,GAL10,等高效转录。,P,GAL10,GAL1,GAL7,GAL10,UAS,GAL4,GAL80,将,GAL4,的启动子换成,GAL10,的诱导型强启动子；,PHO5,启动子在培养基磷酸盐耗尽时，启动转录；,pho4,TS,温度敏感，35时失活，,PHO5,关闭；,pho4,TS,-PHO5,启动子通过,降温,(23,),诱导,表达。,pho4,基因编码产物是,PHO5,启动子的正调控因子；,pho4,TS,-PHO5,启动子,2,）酵母菌对密码子的偏爱性,甘油醛-3-磷酸脱氢酶,(,GAPDH,),磷酸甘油激酶,(,PKG,),乙醇脱氢酶,(,ADH,),在酿酒酵母中，高丰度蛋白质,96%,以上的氨基酸由,25,个密码子编码，,如：,性结合因子：,MF-,酸性磷酸酯酶：,PHO5,蔗糖酶：,SUC2,杀手毒素因子：,KIL,3,）酿酒酵母分泌系统,酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源：,酿酒酵母,信号肽特点,：,保守性低，大多异源宿主系统的信号肽,不能互用；,信号肽结构：,正电荷区,疏水区,极性区,Met,目的蛋白,信号肽剪切位点,MF-,信号肽,：,88,个残基组成。,Met,目的蛋白,-Lys-Arg-,Glu-Ala-Glu-Ala,-,KEX2,DAP,DAP,DAP,：,STE13,编码的二肽酶,分泌效率高；,在酵母系统具有通用性；,对,Thr/Ser,的羟基氧进行糖基化。,4,）酿酒酵母糖基化系统,糖基化位点：,Asn,天冬酰胺,-X-Thr/Ser,（,X,代表任何氨基酸）,对,Asn,的酰胺氮进行糖基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。,N,型糖基化,：,O,型糖基化,：,O,型糖链仅由甘露糖组成（哺乳动物细胞的还含唾液酸基团）。,酵母菌糖基化特点：,N,型或,O,型糖基的外链进一步形成庞大的、由甘露糖组成的复杂分支结构，会增加免疫原性、影响活性和药代稳定性。,过糖基化：,糖链组成：,5,）酿酒酵母表达系统的缺陷,不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵。,表达载体传代不稳定（,YEp,、,YRp,）；,所采用的强启动子调控不严谨；,表达水平普遍不高：,表达产物过糖基化。,2,、甲醇酵母表达系统,甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子,甲醇酵母表达系统的优缺点,甲醇酵母表达系统操作原理,甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策,1,）甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子,甲醇酵母,（,methylotrophic yeast),：,可利用甲醇作为单一碳源的一类酵母。,巴斯德毕赤酵母,（,Pichia pastoris,),多形汉逊酵母,（,Hansenula ploymorpha,),博伊丁假丝酵母,（,Candia boidinii),毕赤酵母,/,假丝酵母 汉逊酵母,醇氧化酶,甲醇氧化酶,alcohol oxidase,AOX,methanol oxidase,MOX,AOX1,、,AOX2 MOX,名称和拷贝数不同。,甲醇氧化酶：,甲醇代谢关键酶，占可溶蛋白的,30%,以上；,AOX1,占主导地位，负责,AOX 99%,以上活性。,AOX1,与,AOX2,：,毕赤酵母和假丝酵母基因组中存在,2,个,AOX,基因：,AOX1,、,AOX2,；,AOX1,与,AOX2,基因,97%,同源；,甲醇氧化酶启动子：,目前已发现的、最强的真核启动子；,AOX1,：葡萄糖和甘油阻遏、甲醇诱导,MOX,：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导,严谨调控型启动子：,当甘油被消耗尽时，加入甲醇，诱导重组蛋白的表达。,毕赤酵母的发酵过程：,成长期,：,诱导期,：,过渡期,：,以甘油为碳源，目的是收获一定的菌量。,不加碳源，目的是消耗掉甘油，解除其对,AOX1,启动子的阻遏。,优点：,AOX1,启动子,是目前最强、调控机理最严格的启动子之一，,甲醇,可严格调控外源基因表达；,2,）甲醇酵母表达系统的优缺点,表达水平高；,产物可,翻译后修饰：糖基化、磷酸化、脂酰化；,实验室和工业操作简单。,产物可正确折叠和高效分泌；,过糖基化程度比酿酒酵母少（,8-15,个,vs,100-150,个甘露糖）；,可利用简单无机盐培养基高密度发酵；,不能满足结构要求严格的糖基化；,缺点：,载体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。,3,）甲醇酵母表达系统操作原理,宿主菌株与标记基因,甲醇酵母系统的整合事件,胞内表达与分泌表达载体,宿主菌株与标记基因,二大宿主系统主要特点,毕赤酵母 汉逊酵母,最适温度,30 37,最适,pH,值,4.5 4.5,甘油阻遏 是 否,糖基化 部分过度 较正常,高密度发酵,100g/L 100g/L,二大宿主系统主要选择标记,宿主,选择标记,毕赤酵母,his4,、,G418,、,Zeocin,、,Cu,2+,汉逊酵母,leu2,、,his3,、,ura3,、,G418,毕赤酵母系统,主要宿主菌,宿主株,特 点,Y11430,野生型、,Mut,+,GS115,his4,-,、,Mut,+,KM71,his4,-,、,aox1:ARG4(AOX1,-,),、,Mut,s,SMD1168,his4,-,、胞外蛋白酶缺陷，高分泌,MC1003,his4,-,、,AOX1,-,、,AOX2,-,，,Mut,-,Mut,表型与甲醇利用率,Mut,AOX1,基因,AOX2,基因 表型,Mut,+,存在 存在 正常型,Mut,s,缺失 存在 缓慢型,Mut,-,缺失 缺失 负型,甲醇酵母系统的整合事件,YRp,型载体：,传代不稳定，传代过程同源或非同源重组，高选择压力迫使高拷贝数整合，可达,100,拷贝。,主要为单拷贝整合，,1-10%,为多拷贝整合。,YIp,型载体：,在靶序列处线性化载体,DNA,，诱导同源重组；,有两种整合模式：,插入,、,取代,；,毕赤,酵母系统,模式,表达载体,5AOX1,启动子片段含,AOX1,启动子，在甲醇诱导下可启动外源基因表达；,MCS,为外源基因的插入位点；,信号肽,序列使外源蛋白分泌到发酵上清中，便于纯化；,TT,提供转录终止和,polyA,修饰信号；,HIS4,为营养缺陷型筛选标志，能与,酵母染色体,his4,基因同源重组；,3AOX1,基因片段能与酵母染色体,AOX1,基因同源重组；,Amp,为载体在,E.coli,中的筛选标志；,f1 ori,为丝状噬菌体的复制起点。,AOX1,位点插入,载体的,3AOX1,区与酵母基因组,AOX1,基因的末端发生整合重组。,His4,位点插入,载体的,HIS4,区与酵母基因组,HIS4,基因的末端发生整合重组。,多基因插入事件（串联整合）,基因取代（,GS115,，,AOX1,+,）,甲醇酵母系统,胞内表达,载体,表达载体类型,需带入,ATG,单位点,胞内表达与分泌表达载体,甲醇酵母系统,胞内表达,载体,表达载体类型,需带入,ATG,多位点,甲醇酵母系统,分泌表达,载体,信号肽：,PHO1,甲醇酵母系统,分泌表达,载体,信号肽：,MF-,pPIC9,载体的信号肽序列和多克隆位点,4,）甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策,载体稳定性,基因剂量,整合位点,甲醇利用表型,mRNA 5,端,AT,含量分泌信号,表达产物稳定性,载体稳定性,采用,YIp,型载体,:,更易实现整合、整合位点清楚。,同拷贝数时，整合型比自主复制型表达水平高。,YRp,型载体的稳定化：,选择,-,非选择培养交替数十代可得稳定的整合子，但费时、整合位点不确定。,基因剂量,构建高拷贝整合型表达载体。,外源基因表达存在基因剂量效应。,筛选多拷贝整合子,载体引入,G418/Zeocin,抗性标记，整合子拷贝数与抗性成正相关，采用高,G418/Zeocin,抗性转化子。,体外串联多个表达盒，直接获多拷贝整合子；,采用,YRp,型载体稳定化技术，获高拷贝整合子；,整合位点,毕赤酵母中个别情况整合于,His4,位点的比,AOX1,位点的低。,外源基因表达盒整合于,AOX/MOX,或标记基因处，均可高效表达；,甲醇利用表型,在分泌表达情况下，甲醇利用慢型（,Mut,s,）更利于表达。,mRNA 5,端,应尽量避免在,UTR,区出现,AUG,和次级结构。,mRNA 5,端非翻译区（,UTR,）的组成与长度应尽量与,AOX1/MOX,的一致；,AOX1,基因,5-UTR,长,114nt,，富含,A+U,，其编码的乙醇氧化酶表达量极高。,基因序列的,AT,含量,AT,含量越高，越容易出现类似于终止子的结构。,对,A+T,含量丰富的基因，最好重新设计序列，使其,(A+T),含量在,30-55,范围内。这种方法使人血清白蛋白,(HAS),的表达量提高,50,倍。,分泌信号,可采用酿酒酵母来源的,MF-,、,PHO,或,SUC,等的信号肽，或野生型信号肽，但要比较分析适用性。,分泌表达效率与所用信号肽密切相关；,采用,蛋白酶缺陷宿主株,：,如,P.pastoris,SMD1168,。,表达产物稳定性,分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素。,降低培养基,pH,值,：,蛋白酶在酸性条件下活性较低。,向培养基中,添加蛋白胨,或,酪蛋白水解物,：,竞争性抑制蛋白酶活性。,目前，20余种重组蛋白在,巴斯德毕赤酵母,系统中成功表达，如：人血清白蛋白,(HSA),、乙型肝炎表面抗原,(HBsAg),、肿瘤坏死因子,(TNF),、表皮生长因子,(EGF),等。,数种重组蛋白在,多形汉逊酵母,表达系统中成功表达，如,HBsAg,。,（六）利用重组酵母生产乙肝疫苗,乙肝病毒的结构与性质,产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母,产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母,由,乙肝病毒,（,HBV,）,感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重传染病，每年约,200万,病人死亡，,3亿,人成为,HBV,携带者，其中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌。,利用酵母大规模生产乙肝疫苗为其应用提供了保证。,目前对,HBV,还没有一种有效的治疗药物，,乙肝疫苗,可有效预防病毒感染。,HBV,的结构与性质,HBV,是蛋白包裹型的双链,DNA,病毒，有感染力的病毒颗粒呈球面状，直径42,nm，,基因组3.2,kb。,HBV,的结构：,病毒颗粒主要结构蛋白是病毒,表面抗原,(,HBsAg,),；颗粒内蛋白包括核心抗原,(HBcAg),、病毒,DNA,聚合酶、微量病毒蛋白。,HBsAg,：,HBV,包膜糖蛋白,，包括小分子,(S),、中分子,(M),、,大分子,(L),表面抗原三种形式。,HBsAg,编码基因：,ATG,ATG,ATG,TAA,108aa,55aa,226aa,preS1,preS2,S,S,蛋白,226aa,M,蛋白,281aa,L,蛋白,399aa,S,蛋白可刺激机体产生中和抗体，是制备乙肝疫苗的主要成分。,S,蛋白：,即,小分子,HBsAg,，是构成,HBV,包膜的主要成分，大量存在于感染者血清中，是感染,HBV,的主要标志。,HBV,在体外细胞培养基中不能繁殖，第一代乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取的。,质膜来源的疫苗有较高的免疫原性，但受原材料限制，难以产业化。,传统乙肝疫苗的制备：,产乙肝,HBsAg,的重组酿酒酵母,20世纪80年代始，选择酿酒酵母表达重组,HBsAg,。,将,S,抗原基因置于,ADH1,启动子下，获得有免疫活性的重组蛋白，以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平均直径22,nm，,结构和形态与慢性,HBV,携带者血清中的病毒颗粒相同。,以酿酒酵母生产的重组,HBsAg,颗粒作为乙肝疫苗已商品化，产量达细胞总蛋白量的1-2%。,M,和,L,抗原对,S,型疫苗有显著的增效作用，由三者,(,或两者,),构成的复合型乙肝疫苗，可诱导对,S,抗原无响应人群的免疫反应。,将,S,抗原基因置于,AOX1,强启动子下，将,工程菌在含甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入,甲醇诱导,表达，,S,抗原的产量可达细胞可溶性蛋白总量的3%。,产乙肝,HBsAg,的,重组巴斯德毕赤酵母,在大规模生产中，巴斯德毕赤酵母工程菌在240,L,的发酵罐中培养，可获得90,g,22,nm,的,HBsAg,颗粒，可制成900万份乙肝疫苗。,