土壤微生物群落脂肪酸生物标记分析方法的软件设计与应用.doc

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土壤微生物群落脂肪酸生物标记分析方法的软件设计与应用基金项目: 福建省财政专项-福建省农业科学院科技创新团队建设基金(STIF-Y03)，福建省自然科学基金资助项目(B0410024)；福建省烟草专卖局科技计划项目（闽烟科[2006]18号）；福建省农科院预试课题(A2006YYS09)
作者简介：张秋芳，女，硕士，副研究员，主要从事土壤学及生化物质分析等方面研究。E-mail: qfzhang@。
*通讯作者：刘波，男，博士，研究员，主要从事生物技术和生物防治研究，E-mail：fzliubo@。

刘 波*，林营志，张秋芳
（1福建省农科院农业生物资源研究所，福建 福州 350003）

摘要：磷脂脂肪酸（PLFAs）法是一种可用于定性和定量分析土壤微生物群落多样性的方法。本研究应用PLFAs法分析烟草土壤微生物磷脂脂肪酸特征，并结合Shannon-Wiener（H1）、Brillouin（H2）、 Mcintosh多样性指数（H3）、丰富度指数(S)和Pielou均匀度（J）、Simpson优势度指数（D）等多样性指数测度方法，对烟草土壤微生物群落多样性、丰富度和均匀度进行分析研究。初步研究结果表明，不同生长阶段供试烤烟土壤微生物群落中,先后出现的PFLAs有43种，其多样性指数、丰富度和均匀度皆不相同；聚类分析结果表明，可把Shannon-Wienner指数与土壤微生物PFLAs含量分类相似的结果相结合，将烟草土壤中的PFLAs分成四大类：Ⅰ类为高含量高多样性，Ⅱ类高含量中多样性（过渡型），Ⅲ类中含量高多样性（过渡型），Ⅳ类低含量低多样性。
关键词:烟草土壤；微生物群落；磷脂脂肪酸（PLFAs）；多样性
The characteristics of phospholipid fatty acids（PLFAs）and its diversity of microbial community in the tobacco soils
（ZHANG Qiu-fang 1, TANG Li-na 2, SHI Huai1, Yang Shu-sheng1, ZHOU Xian-zi1, Lin Ying-zhi1 and LIU Bo 1*
(1 Agricultural Bioresource Institute，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou，Fujian 350003，China ;
2 Fujian Tobacco Company，Fuzhou，Fujian 350003 China）

Abstract：Phospholipid fatty acids（PLFAs）is one of the methods to analysis the microbial community diversity qualitatively and quantitatively. The characteristics of phospholipid fatty acids of tobacco soils was analyst, combining with Shannon-Wiener（H1）,Brillouin（H2） and Mcintosh（H3） diversity index，the abundance(S)，Pielou evenness（J）and Simpson index（D）.The total 43 kinds of PFLAs in soils which were tested in different growing periods of tobacco were all not similar at the microbial community diversity, the abundance and evenness.But there was some similarity at the result of cluster analysis between Shannon-Wiener（H1）diversity index and the relevant content of PLFAs,and then the 43 kinds of PFLAs were divided to 4 classifications as follows：NO.1 High quantity and high diversity；NO.2 High quantity and moderate diversity（transition type）; NO.3 Moderate quantity and high diversity（transition type）; NO.4 Low quantity and low diversity。
Key words：Tobacco soil; Microbial community; Phospholipid fatty acids（PLFAs）; Diversity

前言
土壤微生物以其丰富的生物多样性使它们成为生态系统中最活跃和最具影响力的组分之一。土壤微生物多样性，又称微生物群落结构，是指生命体在遗传、种类和生态系统层次的变化,为土壤微生物的丰富度和均匀度，通常以土壤生物区系的变化和生物化学过程间的相互贡献来反映。它代表着微生物群落的稳

定性，也反映土壤生态机制和土壤胁迫对群落的影响。由于它能较早地预测土壤养分及环境质量的变化过程，被认为是最有潜力的敏感性生物指标之一。生物多样性作为指标在监测土壤变化和对胁迫的反映方面是重要的，同时对进一步了解土壤微生物群落状态也十分有用。此外，微生物的均衡性、丰富性和多样性，是微生物群落研究中的常用指标。
磷脂类化合物只存在于生物细胞膜中，一旦生物细胞死亡，其中的磷脂化合物马上消失。生物中的磷脂类化合物能显示出快速转换率，而且生物可以把相对稳定的磷脂类化合物与它们的生物量相联系。由于存在于活体微生物细胞膜的磷脂脂肪酸(PLFAs：phospholipids fatty acids)，分布广泛、含量相对恒定、周转迅速，而且对环境因素的变化敏感、分析方法较简单，因此该技术已广泛应用于土壤微生物学研究。磷脂类化合物的这些特性和磷脂类化合物与生物的密切关系，也可用作土壤中微生物群落结构指纹分析，但不同菌群的PLFAs特征谱图不同，在高度专一性基础上具有多样性，可以作为微生物群落中不同群体的标记物。因为各种菌群的微生物生物量和群落组成很难与其他样品相同，所以每种样品具有独特的PLFA 谱图(包括PLFA 总量、组成)，即具有专一性；不同样品的谱图之间差别很大，即具有多样性。并且，有人认为微生物功能多样性同观察到的结构多样性是相对应的，PLFA图谱丰富显示了生化功能的多样性和微生物种类的多样性。因此，PLFA可以作为生物多样性的指示性标记，磷脂构成的变化能够说明环境样品中微生物群落结构的变化，可以对微生物群落进行识别和定量描述，并为进一步的研究提供相关信息。Priha等用PLFA法对某森林中松树、云杉、桦树下土壤进行研究，发现不同树种下的土壤微生物群落结构明显不同，桦树土壤中革兰氏阴性菌(如假单胞菌)数量很多，松树和云杉土壤中革兰氏阳性菌数量则较多。本研究拟以烟草根际土壤为例，应用磷脂脂肪酸（PLFAs）法分析烟草土壤微生物群落的磷脂脂肪酸特征及其PLFAs多样性，为了解烤烟土壤微生物群落多样性提供部分参考依据。

1 材料与方法
1.1 脂肪酸数据来源与结构
PLFAs的鉴定采用美国MIDI公司(MIDI,Newark,Delaware,USA)开发的基于细菌细胞脂肪酸成分鉴定的SherlockMIS4.5系统(Sherlock Microbial Identification System)。使用的例子为：供试土壤取自福建省烟草农业研究所试验基地。烟草栽培试验自2007年3月进行，共设不施肥（CK）、施用纯化肥、25%饼肥、25%鸡粪4个处理，每处理重复3次。供试烤烟品种为K326，田间管理按烟草生产标准进行。取烤烟定植后0d（基础土样）、30d、60d和90d耕作层烟草根际土壤新鲜土样，混匀，进行磷脂脂肪酸的提取和测试分析。
1.2 计算机硬件要求和软件环境

1.3 数据处理模型
（1）生态学参数：对土壤微生物群落PFLAs多样性、丰富度与均匀度分析。本研究微生物PFLAs多样性测度选用Shannon-Wiener（H）、Brillouin、 Mcintosh多样性指数（R）、丰富度指数(S)和Pielou均匀度（J）、Simpson优势度指数（D）等方法。
其中，Shannon-Wiener多样性指数（H1）的计算公式为：
H =-∑PilnPi
式中，Pi=Ni/N，Ni为处理i的特征脂肪酸个数，N为该试验中总特征脂肪酸个数。
S为特征脂肪酸i在供测土样中出现的次数，即丰富度指数。
Pielou均匀度指数（J）的计算公式为：
J=-∑PilnPi/lnS
式中S为群落中的脂肪酸的总种类数。

Simpson优势度指数（D），其计算公式为：D=1-∑Pi2 式中，Pi种特征脂肪酸占该试验中总的特征脂肪酸个数比例。
Brillouin多样性指数（H2）的计算公式为：
H2=

式中，n1为第1个PLFAs的个体数量，n2为第2个PLFAs的个体数量，ni为第i个PLFAs的个体数量，N为所有供试处理中PLFAs出现的个体总和。(张玉波等)
I

Mcintosh多样性指数（H3）计算公式为：H3 =
式中，N为特征脂肪酸总数；Ni为第i个处理的土样微生物特征脂肪酸个数；S为PLFAs总种类数。

（2）多元统计方法：通过对上述多样性指数值进行聚类分析，得出系统树图并进行分类，欧氏距离（Euclidian Distance）的大小表示微生物群落差异的大小，分析聚成的各类脂肪酸的特点及主要差别。

2结果与分析
2.1微生物脂肪酸图谱及其数据利用
烟草新鲜土壤样品提取后进样所获得的信息如表1、图1及表2、表3所示。
表1 供试烟草土壤样品Z-7总信息1
Table1 General sample information N0.1 of flued-tobacco soil sample Z-7
Volume: DATA File: E079065.08B Seq Counter: 9 ID Number: 5091
Type: Samp Bottle: 8 Method: TSBA50
Created: 9/6/2007 3:25:58 PM
Sample ID: Z-7

图1. 烟草土壤样品Z-7微生物群落磷脂脂肪酸气相色谱图
Fig1. Phospholipid fatty acids chromatogram of microbial community in flued-tobacco soil sample Z-7

表2.烟草土壤样品Z-7微生物群落磷脂脂肪酸信息表
Table2. Phospholipid fatty acids information of microbial community in flued-tobacco soil sample Z-7

RT
Response
Ar/Ht
RFact
ECL
Peak Name
Percent
Comment1
Comment2
1.698
6.298E+7
0.024
----
7.046
SOLVENT PEAK
----
< min rt

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1262
0.031
----
11.730

----

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1654
0.041
1.102
11.998
12:0
0.46
ECL deviates -0.002
Reference 0.000
5.126
868
0.040
----
12.197

----

5.199
456
0.036
----
12.260

----

5.259
305
0.029
----
12.311

----

5.321
714
0.031
----
12.363

----

5.417
1036
0.055
1.079
12.444
11:0 3OH
0.28
ECL deviates 0.006

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569
0.031
1.070
12.616
13:0 ISO
0.15
ECL deviates 0.002
Reference 0.004
5.750
3494
0.032
----
12.727

----

6.073
779
0.066
1.051
13.000
13:0
0.21
ECL deviates 0.000
Reference 0.003
6.377
2379
0.075
----
13.219

----

6.509
962
0.044
----
13.314

----

6.574
930
0.038
----
13.360

----

6.690
786
0.033
----
13.443

----

6.935
1591
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1.024
13.619
14:0 ISO
0.41
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Reference 0.002
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7151
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----
13.727

----

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2628
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----
13.794

----

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2517
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1.013
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14:1 w5c
0.64
ECL deviates -0.002

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5918
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1.009
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14:0
1.50
ECL deviates -0.002
Reference 0.000
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2157
0.059
----
14.174

----

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4001
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----
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----

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----
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----

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2290
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unknown 14.502
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4200
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14.838

----

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1605
0.051
----
14.935

----

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3981
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14.998
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----
ECL deviates -0.002

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----
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----

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----
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----

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----
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----

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----
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----

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4.20
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Reference 0.000
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----
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----

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Reference -0.001
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----
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----
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----

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TBSA 10Me18:0
1.98
ECL deviates 0.000

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1678
0.059
----
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----

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----
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----

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0.867
18.903
19:0 CYCLO w8c
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Reference 0.002
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1083
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0.864
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19:0
0.23
ECL deviates 0.002
Reference 0.003
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5581
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----
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----

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4326
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19.402
20:4 w6,9,12,15c
0.93
ECL deviates 0.007

16.818
1514
0.047
----
19.478

----

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1911
0.048
----
19.564

----

17.046
1797
0.062
----
19.609

----

17.210
6054
0.048
----
19.704

----

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929
0.041
0.846
19.771
20:1 w9c
0.20
ECL deviates 0.001

17.723
6009
0.049
0.840
20.000
20:0
1.27
ECL deviates 0.000
Reference 0.000
18.184
3350
0.053
----
20.265

----
> max rt

18.301
7851
0.085
----
20.333

----
> max rt

18.452
5935
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----
20.420

----
> max rt

----
17676
---
----
----
Summed Feature 3
4.20
16:1 w7c/15 iso 2OH
15:0 ISO 2OH/16:1w7c
----
45048
---
----
----
Summed Feature 5
10.13
18:2 w6,9c/18:0 ANTE
18:0 ANTE/18:2 w6,9c
----
2538
---
----
----
Summed Feature 7
0.55
un 18.846/19:1 w6c
19:1 w6c/.846/19cy
----
-----
---
----
----

----
19:0 CYCLO w10c/19w6

表3 供试烟草土壤样品Z-7总信息表2
Table1 General sample information N0.2 of flued-tobacco soil sample Z-7
ECL Deviation: 0.004 Reference ECL Shift: 0.003
Number Reference Peaks: 17
Total Response: 543580 Total Named: 431571
Percent Named: 79.39% Total Amount: 402186
Profile Comment: Percent named is less than 85.00.

表1和表3为烟草土壤样品Z-7的PFLAs总信息表。表2为烤烟土壤样品微生物群落磷脂脂肪酸的信息表，将图1中包含的信息量化。其中，retention time (RT)表示微生物群落磷脂脂肪酸各特征峰的滞留时间；Response表示各脂肪酸特征峰的反应区域值；area/height ratio（Ar/Ht）表示反应区域/峰高度比值；RFact表示相关因子系数；the equivalent chain length (ECL)表相对链长度；Peak Name磷脂脂肪酸各特征峰名称；Percent是指磷脂脂肪酸各特征峰占总脂肪酸的百分数，Comment1、Comment2表注解1、2。
以上参数中，通常应用标准品甲基十九烷脂肪酸(19:0)作为内标来进行定量测定，总量可以将Response值换算成各脂肪酸含量，而Peak Name磷脂脂肪酸各特征峰通过比对可以定性地确定脂肪酸名称，而Percent可以表明各PFLAs在总脂肪酸中所占的比例。
另有研究表明，不同的提取方法，出现的特征峰数量，即PFLAs种类可能不同。在本试验条件下，所获得的土壤微生物的PLFAs最多的处理有43个特征峰，即可能出现有43种不同的PFLAs。

2.2土壤微生物脂肪酸生物标记分析的实体模型

多元统计分析

统计学参数

土壤微生物脂肪酸生物标记

生态学参数

微生物学参数

统计学参数
生态学参数
多元统计分析
微生物学参数

烟株生长过程中，所采集的新鲜土壤样品中的磷脂脂肪酸种类和各脂肪酸的特征峰反应值大小如表3所示。从表3可知，在不同处理中不同的PLFAs含量和种类随着生长时间的延长而变化。不同生长期，烟草土壤中的微生物群落的PLFAs不同，但总的变化趋势一致，即；PLFAs的种类和值，随生育期的延长呈增加趋势。基础土样中PLFAs主要有14种（4个处理中有3个或以上存在的同一种PLFAs），第30天的土样中PLFAs达到了22种，60天后达到24种，烟叶成熟采收期则稳定地达到了34种；对于整个生育期而言，总共出现有43种的PLFAs。PLFAs不但在种类上随着生育期的延长而增加，其含量也呈递增的趋势。尤其是到了烟草叶生长后期，14:0、14:0 ISO、15:0 ANTEISO、15:0 ISO、15:1 ISO G、16:0、16:0 10 methyl、16:0 ANTEISO、16:0 ISO、16:0 N alcohol、16:1 w5c、17:0、17:0 10 methyl、17:0 ANTEISO、17:0 CYCLO、17:0 ISO、17:1 w8c、18:0、18:1 w7c、18:1 w9c、18:34w6c (6,9,12)、19:0 CYCLO w8c、20:0、20:1 w9c、20:4 w6,9,12,15c和unknown 14.502等主要PLFAs，不但在总脂肪酸中占主要地位，而且各处理PLFAs含量皆为最高，尽管在整个生长过程，各PLFAs含量的变化趋势有所不同 。

16

表3.烟草土壤微生物各PLF工As的反应区域值的动态变化
Table3. Dynamic changes of the response value of the PLFAs biomarkers in soils during in the tobacco growth
编号
主要特征
脂肪酸名称
第0天采样
第30天采样
第60天采样
第90天采样
I
II
III
IV
I
II
III
IV
I
II
III
IV
I
II
III
IV
1. O7
11:0 3OH
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1036
2. O11
12:0
0
0
0
0
577
0
626
552
0
0
0
0
776
1161
0
1654
3. O18
13:0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
779
4. O22
13:0 ISO
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
312
523
0
569
5. O24
14:0
603
684
654
810
1914
734
1584
1936
519
382
426
781
4290
3681
3658
5918
6. O157
14:0 ANTEISO
0
0
0
0
1233
353
914
0
0
0
0
0
0
0
0
0
7. O26
14:0 ISO
0
0
0
0
536
0
456
666
0
0
0
0
1267
1138
982
1591
8. O29
14:1 w5c
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
663
0
0
2517
9. O31
15:0 2OH
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1754
964
1079
0
0
1216
0
10. O32
15:0 3OH
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1069
1657
3783
11. O33
15:0 ANTEISO
906
1070
1182
1210
4034
1378
3230
3920
1532
1220
1689
2911
8808
8191
8284
16581
12. O34
15:0 ISO
1184
1761
1644
1961
4898
1761
3672
5202
2022
1482
1763
2897
14109
11735
14626
17687
13. O35
15:0 ISO 3OH
0
0
0
561
0
0
0
0
1051
1816
1790
2319
1045
1205
2940
3221
14. O38
15:1 ISO G
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
454
1013
310
2290
15. O42
16:0
5506
7313
6300
9619
22809
7526
17102
25592
16229
13133
14470
21560
64434
49869
71562
73913
16. O43
16:0 10 methyl
636
767
897
1106
2730
756
1682
2301
1725
999
1358
2063
8843
6646
10022
13083
17. O46
16:0 ANTEISO
0
0
372
0
1951
749
1483
1152
1292
1272
1699
2257
2921
3097
3391
9304
18. O47
16:0 ISO
684
877
964
1315
3195
1137
2347
3705
2108
1380
1793
2980
12176
9051
10494
13762
19. O49
16:0 N alcohol
0
0
0
549
759
0
0
521
668
469
551
866
1026
914
1218
2052
20. O50
16:1 2OH
0
0
0
0
1082
0
0
0
995
713
0
889
3098
0
3244
3452
21. O53
16:1 ISO G
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1290
2964
22. O54
16:1 ISO H
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1332
1261
0
0
23. O56
16:1 w5c
785
1049
1060
1357
3519
1628
2867
3189
3156
4223
3828
5734
8908
8747
19059
15122
24. O60
17:0