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微生物试验检测设备仪器：酶标仪、显微镜、恒温培养箱、干燥箱、冰箱、冰柜、恒温水浴锅、离心机、离心沉淀器、微量振荡器、电子天平、生物天平、高压锅、超净工作台、煤气灶、煤气罐、移液器、酒精灯、手术剪、止血钳、镊子等。实验检测项目：一、 血清学1. 红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）操做方法2凝集反应鸡白痢和鸡伤寒的诊断鸡霉形体的诊断3免疫扩散试验（AGP）操作方法鸡传染性囊病的诊断鸡淋巴白血病的诊断二、孵化厅的微生物学检测1.种蛋表面的细菌检测2.绒毛的细菌检测3.终止胚的细菌检测4.一日龄雏鸡的健康检测5.空气中细菌的检测6.设备表面细菌的检测7.水样的细菌的检测三、鸡舍的细菌检测1.空气中细菌的检测2.物体表面细菌的检测3.水样的细菌检测4.垫料的细菌检测5.饲料的细菌检测四、消毒剂及其使用效果的测定五、细菌对药物的敏感性试验检测流程一、 血清学1. 红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）操做方法1.1 红细胞凝集试验（HA） 1.1.1 在“V”型微量反应板上进行。每孔加入50微升（用微量进样器或将16号注射针头磨去斜尖，调整针头孔径使每滴恰好25微升）pH 7.2的0.01摩尔升PBS液或生理盐水，向第1孔滴加新城疫抗原50微升，吸放35次混匀，然后从第一孔吸出50微升加入第二孔，以相同方法混匀，再从第二孔吸50微升加入第三孔，如此做倍比稀释至倒数第二孔，再从倒数第二孔吸出50微升弃去，最后一孔不加病毒（抗原）作为红细胞对照。 1.1.2 吸取0.5鸡红细胞悬浮液，每孔滴加50微升，加毕后在微量振荡器上振荡1530秒，使其混合均匀，静置室温下或37温箱中作用2040分钟。 1.1.3 当对照孔红细胞全部沉入孔底中间，即可判定各孔的红细胞凝集情况。以病毒最大的稀释度孔出现100凝集现象者为这个病毒的凝集价，即一个血凝单位。1.2 血凝抑制（HI）试验 1.2.1 4单位抗原（病毒）的配制 如上述血凝试验表中病毒的血凝价为第八孔（256，即1:256倍稀释），4个单位的病毒则除以4，即64倍（64）稀释即可。但实验室一般实际使用的抗原浓度不尽相同，新城疫用810单位，禽流感病毒用4单位，支原体用24单位。 1.2.2 取洁净的96孔微量反应板，编号后按血凝试验方法给111孔各加25微升稀释液，第十二孔加50微升稀释液。 1.2.3 取被检血清或已知阳性血清25微升加入第一孔中，混合均匀，从第一孔吸出25微升加入第二孔，如此作倍比稀释到第十孔，从第十孔吸出25微升弃去，第十一孔不加血清，作为抗原对照，第十二孔不加血清和抗原作为红细胞对照。1.2.4 给111孔各加25微升4单位抗原，振荡混匀，置37温箱或室温作用2030分钟。 1.2.5 加0.5红细胞悬液，每孔加25微升，置37作用2030分钟观察结果。待第十一孔抗原对照孔的红细胞均匀铺在管壁（100凝集），检查各孔的抑制情况。 1.3 判定标准和注意事项 1.3.1 判定时首先应检查对照孔是否正确。如正确则证明各种条件及操作无误。 1.3.2 红细胞凝集时，红细胞分散在管底四周呈界限明显的扣状凝集者判为阳性“”，无凝集或凝集抑制时，红细胞集于管底呈点状为阴性“”。有些实验人员建议判定时倾斜血凝板，观察如有“泪滴痕”现象或管底流动现象者判定为阴性。 1.3.3 判定时结果与温度和时间有关。温度高时，结果出现快，需要的时间短，温度低时，结果出现晚，一般需30分钟。 1.4 HA和HI试验在禽病诊断中的应用 1.4.1 用于禽流感、新城疫等病毒的鉴定 根据抗原与相应抗体的特异性中和反应原理，给未知病毒悬液中加入已知的抗禽流感病毒阳性血清或已知的抗新城疫病毒阳性血清，相应病毒便丧失了其凝集红细胞的能力。因此，可利用从发病的鸡、鸭、鹅体内分离的病毒作HA和HI试验。病毒悬液能凝集红细胞，并且能被已知的抗血清（阳性血清）所抑制，那么该病毒即是已知阳性血清相对应的病毒。如用新城疫阳性血清完全抑制了未知病毒培养物的血凝性，那么，这个未知病毒培养物就是新城疫病毒；（如果病毒悬液虽然能凝集鸡红细胞，但不能被鸡新城疫血清所抑制，说明不是鸡新城疫病毒，可能是其他有血凝性的病毒。 1.4.2 HI试验可用于发病禽群的诊断 鸡、鸭、鹅规模化养殖中虽进行相关疫病疫苗的免疫，但往往有部分家禽由于各种原因免疫力水平达不到要求，因而造成某些传染病的流行。由于免疫禽群发病时临床症状和病变不典型，给确诊带来困难。采用HI试验对食群中禽流感、新城疫等抗体进行测定，依据抗体滴度的高低和离散性有助于诊断。2凝集反应2.1鸡白痢和鸡伤寒的诊断2.1.1 材料准备 抗原：鸡白痢禽伤寒多价平板抗原。 标准阳性血清、弱阳性血清、阴性血清。诊断液均由指定单位提供。 白瓷板 移液器 采血针头、酒精棉（75%、95%）2.1.2 操作程序： 洁净玻璃板打好格，在检测开始前，先作阳性血清和抗原对照试验，用移液器吸取鸡白痢禽伤寒多价抗原液，加入玻璃板三个方格里每格0.05ml,分别加入标准强、弱阳性血清及阴性血清0.05ml，混合均匀，在23分钟内，强阳性血清出现100%凝集（+ + + +）；弱阳性血清出现50%（+ +）；阴性血清不凝集（），方可进行检测工作。 在玻璃板上滴加抗原（0.05ml）用针头刺破鸡肱静脉，待血流出后，用移液器取出（0.05ml）把血液放入抗原液中，以该取血移液器吸头混合均匀，并摊开约2厘米宽度，轻轻摇动反应板，观察结果。 2.1.3 结果判定： 抗原与全血混合后23分钟，判定结果，有50%（+ +）以上凝集为阳性，不发生凝集为阴性。 2.1.4全血平板凝集反应判定标准： 、出现大块凝集、液体清亮为100%（+）凝集； 、出现明显凝集块、但是液体稍有混浊为75%（+）凝集； 、出现凝集颗粒，液体混浊为50%（+）凝集； 、出现液体均匀一致混浊无凝集现象为阴性。 2.1.5鸡白痢全血凝集试验注意事项： 抗原在使用前必须充分摇均匀，有沉淀的不能用，过期失效的不能用； 做本试验前必须做阴、阳血清对照； 做本试验室温要求在20左右进行； 采血针头只能使用一次，移液器吸头每次一换，不能重复使用；白瓷板要光滑、干净。2.2 鸡霉形体的诊断2.2.1 操作方法在洁净的白瓷板上滴加未知血清25微升，然后加霉形体抗原25微升于血清中，混合均匀，轻轻摇动平板数秒钟，一分钟后再摇动平板数秒种。2.2.2 判定结果在2分钟内出现明显的凝集，背景清亮，即可判定为阳性。3免疫扩散试验（AGP）操作方法3.1 鸡传染性囊病的诊断3.1.1 琼脂板的制备、0.01摩尔/升PH6.4磷酸盐缓冲液配制 甲液：Na2HPO4 412H2O 3.58克，蒸馏水1000ML。 乙液：KH2PO4 1.36克，蒸馏水1000ML。待甲乙二液充分溶解后，用脱脂棉过滤，分别保存。用时取甲液24ML，加乙液76ML，混合即可。、制板 称量0.61克琼脂粉，8克氯化钠，加入甲乙混合液100ML中，在水浴中充分煮沸溶化，加入0.01%的硫柳汞，待琼脂冷却至55度左右时，倒入直径90毫米的平皿内，每个平皿加入20ML，待琼脂凝固后，放入普通冰箱内，保存备用。、打孔将平板从冰箱中取出，在酒精灯上稍加热蒸发其表面水分，用4毫米打孔器按六角形图案打孔，中心孔与周围孔的孔距为3毫米，将孔中的琼脂用6-8号针头轻轻向上挑出即可。26345抗原13.1.2 加样中心孔加抗原，两侧相对孔加标准抗原（即图示中的1、4孔），其余（即图示中的2、3、5、6）孔加入待检血清，加至孔满为止，不要有气泡，每加一个样品更换一次滴管。最后，将平皿加盖，置37温箱中，待孔中液体吸收干后，将平皿倒置，2448h观察记录结果。3.1.3 结果判定阳性：标准阳性血清与抗原之间有明显致密的沉淀线时，受检血清与抗原之间也形成沉淀线。或阳性血清的沉淀线末端向毗邻的受检血清孔内侧偏弯者，此受检血清判为阳性。3.1.3 注意事项、被检血清要新鲜。出现沉淀、混浊和腐败者不能使用。、溶化的琼脂倒入平皿时，注意不要产生气泡，厚度应均匀一致。、琼脂板应放在4冰箱中充分冷却后再打孔为佳。、每个琼脂板均应设阳性血清对照。3.2鸡淋巴白血病的诊断3.2.1 琼脂板制备：、pH8.6硼酸缓冲液配制：四硼酸钠8.8g，硼酸4.65g，蒸馏水加至1000ml。、制板：称重优质琼脂粉1.0g，加入100ml硼酸缓冲液中，在水浴锅中加热溶化，然后以四层纱布过滤，除去杂志，加入0.01%硫柳汞，待冷却至70左右，倾入直径90mm的平皿内，每个平皿加入18mm，不要产生气泡，琼脂凝固后加盖，将平皿倒置，放4冰箱中保存备用。、打孔：取出备用琼脂板，在酒精灯上稍加热，蒸发其表面水分，然后用外径5mm，孔距2mm的打孔器进行打孔。根据被检样品的多少可打成七孔图案或边七孔图案，将孔内切下的琼脂用针头挑出，勿使琼脂与平皿底脱离，可把制好的平板在酒精灯上加热封底。3.2.2 标准抗原和抗体的稀释：标准抗原和抗体（阳性血清）按稀释的要求，每瓶中加入适量的蒸馏水或缓冲液充分溶解后备用。3.2.3 被检样品的处理：本实验的样品是鸡的羽髓，在特殊情况下也可以用肝脏或其他材料。选拔被检鸡舍羽髓丰满的翅羽或身体其他部位的大羽45根，将含有羽髓和羽根部分剪碎（23mm）放入小试管中，加缓冲液0.2mm，放入低温冰箱（普通冰箱冷冻室）中，反复冻融三次，然后，用玻璃棒将羽根压集于管底，以适当的压力转动玻璃棒，提出羽髓。洗涤玻璃棒拭干后，以同样操作提出另一样品。3.2.4 加样：中心孔加标准抗体，两侧相对孔加标准抗原（即图示中的1、4孔），其余孔加入待检血清（即图示中的2、3、5、6），加至孔满为止，不要有气泡，每加一个样品更换一次滴管。最后，将平皿加盖，置37温箱中，待孔中液体吸收干后，将平皿倒置，2448h观察记录结果。标准抗体（7）抗原（1）抗原（4）标准抗体（7）抗原（1）3.2.5 判定：阳性：标准阳性血清与抗原之间有明显致密的沉淀线时，受检血清与抗原之间也形成沉淀线。或阳性血清的沉淀线末端向毗邻的受检血清孔内侧偏弯者，此受检血清判为阳性。二、孵化厅的微生物学检测孵化场样品采集方法一、 空气样品1、 采集部位：蛋库、出雏大厅、冲洗间、孵化室、孵化器内、出雏器内等；2、 采样方法：培养基平皿打开盖子平方，静置15分钟后封盖，用纸包裹标记后送检；3、 采样数量：根据空间大小，每个工作间（室）1-3组；4、 注意事项：平皿放置时，盖子要完全打开。 平皿放置时间要保持一致，以免时间不同影响结果。 平皿暴露静置时，尽量减少人员流动。 采集完毕后，包裹严密，防制平皿外露造成的认为污染。二、 棉拭子1、 表面 采样部位：孵化器、出雏器、蛋车、以及其他机器各部； 蛋表面（储存蛋、入孵蛋）； 采样数量：各种设备表面随机取1-3个点。 采样方法：可做一个25平方厘米(5*5厘米)的金属采样框，采样面积以框内面积为准； 打开装有棉签的试管塞，缓慢向下倒出棉签，大拇指和食指夹住棉签，在采样部位（框内）涂擦（每换一个部位采样框要消毒或更换）。 涂擦后，迅速将棉拭子放入试管并在试管边剪断上1/31/2的棉签柄（手捏部位），盖上塞子封严，做好标记包裹后送检。 注意事项：采样者在采样前应清洁双手，用酒精棉球消毒（采样框应提前消毒）。 对一些难确定面积的部位，如蛋盘、某些设备表面，可估计涂擦在25平方厘米左右采样； 采样时，在确定面积范围内的各部位都要涂擦到。2、 种蛋采样数量：经消毒后入蛋库待孵的合格种蛋，可根据种蛋的数量、批次随机抽取1-3组，每组10枚。采样方法：将种蛋置于消毒后的蛋盘上，1个棉拭子涂擦2枚蛋的上面暴露部位，面积似一枚蛋的面积。注意事项：采样者在采样前应清洁双手，有酒精棉球消毒，蛋盘应提前消毒。 一个棉拭子涂擦范围相当于一枚蛋的面积。三、 水样 采样部位：孵化场中的各个水龙头、孵化水机每个孵化器中的水槽中水样。 采样数量：每个水样采一瓶。 采样方法：先将水龙头拧开，放水35分钟后，用消毒好的采样瓶接取100-200ml水，孵化柜直接从水槽中采集。 注意事项：采样时每份样品做好标记。 操作者应洗手消毒，严格按操作规程操作，避免人为污染。四、 绒毛 采样数量：每个出雏柜采1g以上，按不同的出雏柜，分别装入不同的绒毛袋中(纸信封)。 采样方法：出雏前用消毒过的镊子打开采样袋口，夹取出雏柜中蛋盘四周的绒毛放入袋中，将绒毛袋封严，做好标记送检。 注意事项：采样着在采样前应清洁双手，用酒精棉球消毒。 绒毛袋(消毒后的采样袋)，在采样现场打开包装。采样用的镊子须提前严格消毒。采集绒毛时，同一个出雏柜中多取几个点，收取完备后的绒毛立即封严，避免人为污染。五、 雏鸡、终止胚 采样数量：每批次健雏12只，弱雏12只，终止胚12枚。 采样方法：出雏时，根据来源、批次将雏鸡分别放入鸡苗盒的不同的各自中，做好标记送检；终止胚装入消毒好的塑料袋中标记好送检。孵化厅细菌监测技术 为了提高孵化质量，减少细菌对胚胎发育及出壳后育雏期成活的影响，其监测工作是保健中的一项非常重要的任务。通过监测预先得知孵化环境卫生状况，以提高孵化率、键雏率、并保证育雏成活率。 监测的项目有 表面：孵化厅内使用的各种设备和用具表面 种蛋：消毒后待孵的合格的种蛋 空气：孵化环境（大厅、出雏柜、孵化柜、预热间、照蛋间等）中的空气 水样：用水和孵化水 绒毛：出雏柜内绒毛 终止胚和雏鸡1、种蛋表面的细菌检验1.1准备：采样的培养基及器械（皿）必须经过高压和干热灭菌处理和包装，数量根据采样计划准备。1.1.1培养基 A营养琼脂（NA）、 B麦康凯琼脂(Mac)、 C高盐甘露醇琼脂（MSA）、 D沙门氏志贺氏琼脂(SS)、E霉菌琼脂(MM)。 将上述5种培养基按要求配制，经高压灭菌冷却到5060，分别倒入消毒后的平皿（90mm中，经24小时37培养，无细菌生长作为备用。以上五种培养基各取一个为一组，根据被检种蛋数量准备若干组。1.1.2器械 记号笔1.2 采样 经消毒后入蛋库待孵的合格种蛋，可根据种蛋的数量、批次、存放部位随机抽取若干组，每组30枚，放入灭菌袋内，封口送检。1.3 接种培养基 必须在超净工作台内或无菌室进行，下同。1.3.1操作人员必须消毒手，更换工作服、鞋、帽，带口罩进入无菌室。1.3.2 接种培养基 每组培养皿中的每个平板用6枚种蛋在培养基表面滚动，使种蛋小头表面充分与培养基表面接触，然后在平皿上标记被检种蛋的编号，放入培养箱内37培养。或用棉拭子涂抹(检验方法同下的设备表面)。1.4. 结果判定1.4.1 菌落计数 培养24小时后取出营养琼脂、麦康凯琼脂、霉菌琼脂、高盐甘露醇琼脂培养基。A营养琼脂计所有菌落为总菌数；B麦康凯琼脂计红色菌落数为大肠杆菌数（可通过生化鉴定）；C霉菌琼脂再置于室温下24小时计霉菌数；D高盐甘露醇琼脂也置于室温下24小时计黄色、圆形、光滑、隆起的菌落为葡萄球菌数（可通过镜检）；E48小时后取出沙门氏志贺氏琼脂通过菌落形态（细小、透明菌落）、生化鉴定及血清试验是否有沙门氏菌。1.4.2评分判定标准：大肠杆菌 0； 沙门氏菌 0； 葡萄球菌 0； 绿脓杆菌 0.2、绒毛的细菌检验2.1准备2.1.1培养基 A营养琼脂（NA）、 B麦康凯琼脂(Mac)、 C高盐甘露醇琼脂（MSA）、 D霉菌琼脂(MM)。E沙门氏志贺氏琼脂(SS)、F四硫磺酸钠增菌液（TTB）2.1.2器械 镊子、天平、酒精灯、火柴、记号笔、三角瓶（50100ml）、平皿（90mm）、生理盐水、各规格的刻度吸管、取液泵等。2.2采样 出雏时，在出雏器的不同部位用消毒过的镊子取约1克绒毛装入经消毒过的牛皮纸袋中，注意不要混入其它杂物，封口、标记、送检。2.3实验室操作2.3.1每份绒毛样品称取0.30.5克绒毛（先放消毒过的三角瓶于电子天平上回零，用火焰消毒过的镊子夹取绒毛）放入三角瓶内，盖好，瓶壁上标上绒毛重量和编号。2.3.2每份样品加入100倍生理盐水（3050ml），加盖摇匀，浸泡5分钟，即制成1：100的绒毛液。2.3.3用5ml吸管在三角瓶内连续吹吸数次，然后取液体加入4个平皿（90mm）中，每个平皿1ml。2.3.4 倾倒培养基：将事先配制、消毒好的NA、Mac、MSA、MM4种培养基冷却道4852时（培养基可放在5556的水浴锅中待用），分别倾注于4个加入绒毛液的平皿中，每个平皿1518ml，并摇匀。2.3.5 待平皿冷却凝固后，倒置于37恒温箱中培养。2.3.6 增菌：取绒毛液1520ml加入1520ml双倍的四硫磺酸钠于三角瓶中（绒毛液和四硫磺酸钠液1：1的比例），置37恒温箱内培养24小时后，再用接种环转接在SS培养基上，37培养2448小时。2.4 结果判定2.4.1 菌落计数 培养24小时后取出营养琼脂、麦康凯琼脂、霉菌琼脂、高盐甘露醇琼脂培养基。A营养琼脂计所有菌落为总菌数；B麦康凯琼脂计红色菌落数为大肠杆菌数（可通过生化鉴定）；C霉菌琼脂再置于室温下24小时计霉菌数；D高盐甘露醇琼脂也置于室温下24小时计黄色、圆形、光滑、隆起的菌落为葡萄球菌数（可通过镜检）；E沙门氏志贺氏琼脂培养2448小时后取出，通过其菌落形态（细小、透明菌落）、生化鉴定及血清试验是否有沙门氏菌。 每一种平皿上的菌落数乘以100 ，即为每克绒毛的含菌量。2.4.2 判定标准判定标准：（本项中的数值均为常用对数值）致病菌判定：细菌总数：1=最佳；2=优秀；3=好；4=一般；5=较差；6=差。大肠杆菌2； 沙门氏菌0； 葡萄球菌1； 霉菌03、终止胚细菌检验3.1 准备3.1.1登记 接到样品后，首先进行清点，并记录场名、栋别、批次、数量、出雏柜号及日期。3.1.2 培养基准备直接接种用培养基（种）:A营养琼脂（NA）、 B麦康凯琼脂(Mac)、C高盐甘露醇琼脂（MSA）、增菌用的培养基 D沙门氏志贺氏琼脂(SS)、E四硫磺酸钠增菌液（TTB）3.1.3编号 将NA、Mac、MSA琼脂平板各取一块为一组，根据终止胚数量配成若干组，将每块平板底面用记号笔从中心均匀化5等份，从第一组开始，依次标号，第一组15号，第二组610号，依次类推，每组三块平板上的号码相对应，每枚终止胚标一个号。3.1.4器械（皿） 剪刀、镊子、铂耳环、酒精灯、酒精棉、记号笔、蛋盘（托）、污物盆。3.2 操作3.2.1胚蛋小头向上（便于取卵黄）置于蛋盘（托）上。3.2.2用镊子取酒精棉球（95）点燃后，在每个胚小头上边擦边烧进行消毒。3.2.3用火焰消毒后的镊子和剪刀敲开小头蛋壳，夹出卵黄并剪开，每换一个胚蛋，剪刀和镊子要用火焰消毒一次。3.2.4用铂耳环蘸取卵黄，分别在三种培养基（NA、MSA、Mac）相对应的号码位置上划线接种，接种完毕后置于37恒温箱中培养24小时观察结果。3.2.5沙门氏菌增菌培养：将不同栋别或批次的终止胚归为一组，每组取卵黄约10克放入盛有TTB（50ml）的三角瓶中增菌，在37培养箱中培养24小时后转接在SS培养基上，在将SS放入37培养箱中培养2448小时后，鉴定沙门氏菌。3.3判定3.3.1结果观察 在营养琼脂（NA）与麦康凯琼脂（Mac）两种培养基经3724小时候生长的菌落，通过菌落形态、颜色、生化反应鉴定大肠杆菌、绿脓杆菌或其它细菌（杂菌）。 高盐甘露醇琼脂（MSA）通过3724小时培养，在常温下再放24小时后观察菌落形态、染色镜检鉴定葡萄球菌。 SS培养基上生长的菌落通过其形态、生化及血清反应，鉴定沙门氏菌。 计算出致病菌的胚胎与被检总数的比例，填写报告。3.4.2判定标准标准：大肠杆菌 0； 沙门氏菌 0； 葡萄球菌 0； 绿脓杆菌 0.4、一日龄雏鸡的细菌检验4.1准备4.1.1登记 接到样品后，首先进行清点，并记录场名、栋别、批次、数量、出雏柜号及日期。4.1.2培养基准备直接接种用培养基（种）:A营养琼脂（NA）、 B麦康凯琼脂(Mac)、C高盐甘露醇琼脂（MSA）、增菌用的培养基：D 沙门氏志贺氏琼脂(SS)、E四硫磺酸钠增菌液（TTB）4.1.3编号 将NA、Mac、MSA琼脂平板各取一块为一组，根据雏鸡数量配成若干组，将每块平板底面用记号笔从中心均匀化5等份，从第一组开始，依次标号，第一组15号，第二组610号，依次类推，每组三块平板上的号码相对应，每只雏鸡标一个号。4.1.4器械（皿） 剪刀、镊子、铂耳环、酒精灯、酒精棉、记号笔、消毒液 、消毒盆，方瓷盘，污物桶。4.2 操作4.2.1 首先心脏采血，作母源抗体监测。4.2.2 将雏鸡放入盛有消毒液的盆中浸湿，以防止绒毛飞落和消毒。4.2.3 左手抓着雏鸡鸡头及颈部，右手抓雏鸡双翅向胸部对折，腹部朝下撕开小鸡，翻开卵黄囊平放在瓷盘上，用酒精棉球分别烧烙肝表面、卵黄囊，并剪开。4.2.4 用铂耳环分别勾取卵黄囊或肝组织在同编号的Mac、MSA、NA琼脂板上划线接种，接种完毕后置于37恒温箱中培养24小时观察结果。4.2.5 沙门氏菌增菌培养：将不同栋别或批次的雏鸡归为一组，每组取卵黄约10克放入盛有TTB（50ml）的三角瓶中增菌，在37培养箱中培养24小时后转接在SS培养基上，在将SS放入37培养箱中培养2448小时后，鉴定沙门氏菌。4.3判定4.3.1结果观察 在营养琼脂（NA）与麦康凯琼脂（Mac）两种培养基经3724小时候生长的菌落，通过菌落形态、颜色、生化反应鉴定大肠杆菌、绿脓杆菌或其它细菌（杂菌）。 高盐甘露醇琼脂（MSA）通过3724小时培养，在常温下再放24小时后观察菌落形态、染色镜检鉴定葡萄球菌。 SS培养基上生长的菌落通过其形态、生化及血清反应，鉴定沙门氏菌。 计算出有致病菌的雏鸡与被检总数的比例，填写报告。4.4.2判定标准标准：大肠杆菌 0； 沙门氏菌 0； 葡萄球菌 0； 绿脓杆菌 0.5、空气中细菌的检验5.1准备5.1.1培养基 A营养琼脂（NA）、 B麦康凯琼脂(Mac)、 C高盐甘露醇琼脂（MSA）、 D沙门氏志贺氏琼脂(SS)、E霉菌琼脂(MM)。 以上5种培养基各一块为一组，根据采样计划准备若干组，用消毒好的牛皮纸包好，放入采样桶中。5.1.2器械 记号笔等。5.2 采样5.2.1 五种培养基各一个为一组，根据孵化室、出雏室房间面积采35个点，每个孵化柜采一个点。5.2.2 将每组培养基平皿打开，在空气中暴露15分钟，盖好平皿盖子，打包、填单、送检。5.2.3将采样好的平皿放入37恒温箱中培养。5.3 结果判定5.3.1 菌落计数 培养24小时后取出营养琼脂、麦康凯琼脂、霉菌琼脂、高盐甘露醇琼脂培养基。A营养琼脂计所有菌落为总菌数；B麦康凯琼脂计红色菌落数为大肠杆菌数（可通过生化鉴定）；C霉菌琼脂再置于室温下24小时计霉菌数；D高盐甘露醇琼脂也置于室温下24小时计黄色、圆形、光滑、隆起的菌落为葡萄球菌数（可通过镜检）；E沙门氏志贺氏琼脂培养2448小时后取出，通过其菌落形态（细小、透明菌落）、生化鉴定及血清试验是否有沙门氏菌。 每一种平皿上的菌落数乘以100 ，即为每克绒毛的含菌量。5.3.2 判定标准 判定标准：总菌数30；大肠杆菌5；霉菌数2；葡萄球菌26、设备表面（棉拭子）检验6.1准备6.1.1棉拭子的准备 将卫生棉签装入玻璃试管中，用硅附塞塞紧，高压蒸汽灭菌备用。6.1.2采样器（用塑料板制成55厘米空心面积），酒精灯。6.1.3 培养基A营养琼脂（NA）、 B麦康凯琼脂(Mac)、 C高盐甘露醇琼脂（MSA）、D霉菌琼脂(MM)。E沙门氏志贺氏琼脂(SS)、F四硫磺酸钠增菌液（TTB）6.1.4 器械 水浴锅、刻度吸管（2、5ml）、平皿、灭菌盐水、试管架、液泵、记号笔、塑料桶等。6.2 采样采样部位 孵化器、出雏器、蛋车、鉴别台、鸡苗箱、蛋盘、暖风机等各部位；出雏大厅、冲洗间、孵化室、出雏室、蛋车、等各室地面；墙壁、种蛋表面等。采样数量 各种设备和各室地面、墙壁随机取23个点。采样方法 首先消毒采样者手和采样器，在酒精灯火焰边打开装有棉拭子的试管，倾斜，倒出棉拭子，蘸取适量灭菌生理盐水，在25平方厘米（55厘米）的采样器面积内涂擦（或相当于25平方厘米的设备面积），涂擦完毕后，不松手，迅速将棉拭子放入试管内，用酒精火焰烧断棉签把，或在试管边襞断棉签把，烧烙试管口，加上塞子封严。作好标记，送检。6.3 检验6.3.1 登记、编号，依次排在试管架上。6.3.2稀释 在超净工作台或无菌室内将试管塞全部拔掉，每管内加入4ml灭菌生理盐水，浸泡510分钟。6.3.3标号 在4个平皿上标上棉拭子相对应的编号。6.3.4 加样 用5ml吸管在浸有棉拭子的试管中反复吸打数次使之均匀，然后吸取2ml稀释液，分别加入对应编号的四个平皿内，每个平皿0.5ml。6.3.5分组 加样完毕，将全部平皿分成四组放置，使每组编号完全一样。6.3.6倾注培养基 将事先配制、消毒好的NA、Mac、MSA、MM4种培养基冷却道4852时（培养基可放在5556的水浴锅中待用），分别倾注于4组平皿中，每个平皿1518ml，并摇匀。6.3.7 待平皿冷却凝固后，倒置于37恒温箱中培养。6.3.8 增菌： 按场别或采样部位，将棉拭子1020支为单位分成若干组，分别把剩下的稀释液1520ml加入到盛有双倍的四硫磺酸钠（1520ml）的三角瓶中（稀释液和四硫磺酸钠液1：1的比例），置37恒温箱内培养24小时后，再用接种环转接在SS培养基上，37培养2448小时。6.4 结果判定6.4.1 菌落计数 培养24小时后取出营养琼脂、麦康凯琼脂、霉菌琼脂、高盐甘露醇琼脂培养基。A营养琼脂计所有菌落为总菌数；B麦康凯琼脂计红色菌落数为大肠杆菌数（可通过生化鉴定）；C霉菌琼脂再置于室温下24小时计霉菌数；D高盐甘露醇琼脂也置于室温下24小时计黄色、圆形、光滑、隆起的菌落为葡萄球菌数（可通过镜检）；E沙门氏志贺氏琼脂培养2448小时后取出，通过其菌落形态（细小、透明菌落）、生化鉴定及血清试验是否有沙门氏菌。 每一种平皿上的菌落数乘以8，即为每个棉拭子的含菌量。6.4.2 判定标准判定标准：总菌数32；大肠杆菌8；沙门氏菌0；葡萄球菌8 ；霉菌8。7、水样检验7.1准备7.1.1 采样瓶的准备 ：250ml玻璃采水瓶经过1602小时的干热灭菌，盖好塞子备用。7.1.2培养基 A营养琼脂（NA）、 B麦康凯琼脂(Mac)、 C高盐甘露醇琼脂（MSA）、 D霉菌琼脂(MM)。E沙门氏志贺氏琼脂(SS)、F四硫磺酸钠增菌液（TTB）7.1.3器械 ：试管、刻度吸管（5ml、10ml）、90mm平皿；水浴锅、灭菌生理盐水、试管架、液泵、记号笔、PH试纸、塑料桶等。7.2采样：采样者消毒手后用采水瓶采集水样。7.2.1 采样部位 孵化场中的各水龙头和每个孵化柜的水槽中的水样。7.2.2采样方法 先将水龙头拧开，放水510分钟，然后接取100200ml水，孵化柜直接从水槽中采集。7.3检验7.3.1登记、编号：收到样品后，首先进行清点，登记其场别、采样部位、数量、送检日期等；并编号，同时将对应的编号用记号笔标记在采水瓶上。7.3.2标号 拿6个灭菌平皿重叠一起，底朝上将水瓶上的编号依次写在平皿底上（如1标记1、1、1、11、12、13），标记完后，将平皿一起翻转，盖朝上。7.3.3稀释、加样 在试管架上放多支试管，每个水样用3支，将每支试管内加入9ml灭菌生理盐水。 将水样摇匀，在超净台或无菌室内打开瓶塞，用5ml吸管从水样瓶中吸4ml水样，从下到上，先依次放1ml在下面的同编号的3个平皿中（如1的1、1、1编号平皿），吸管中剩下的1ml水样放在盛有9ml盐水的试管内反复吸打使之均匀，取出2ml，1ml加在一个平皿中（如1#的11编号平皿），另1ml放入第二支试管内反复吸打数次，又取出2ml，1ml加在一个平皿中（如1的12编号平皿），另1ml放入第三支试管反复吸打数次，最后取1ml加在一个平皿中（如最上面1的13编号平皿），此3个稀释度分别为，101、102和103。7.3.4分组 加样完毕，将全部平皿分成四组放置，101、102和103平皿为一组，作倾注营养琼脂用；剩下3个平皿各为一组，分别倾注Mas、MSA、MM培养基用。7.3.5倾注培养基 将事先配制、消毒好的NA、Mac、MSA、MM4种培养基冷却道4852时（培养基可放在5556的水浴锅中待用），分别倾注于4组平皿中，每个平皿1518ml，并摇匀。7.3.6待平皿冷却凝固后，倒置于37恒温箱中培养。7.3.7增菌： 按场别或采样部位，将水样510瓶为单位分成若干组，取水样（原液）分别加入含双倍的四硫磺酸钠20ml的三角瓶中（水样和四硫磺酸钠液1：1的比例），置37恒温箱内培养24小时后，再用接种环转接在SS培养基上，37培养2448小时。7.3.8菌落计数培养24小时后取出营养琼脂、麦康凯琼脂、霉菌琼脂、高盐甘露醇琼脂培养基。A营养琼脂计总菌数；（见水质检验细菌总数的计算方法）B麦康凯琼脂计红色菌落数为大肠杆菌数（可通过生化鉴定）；C霉菌琼脂再置于室温下24小时计霉菌数；D高盐甘露醇琼脂也置于室温下24小时计黄色、圆形、光滑、隆起的菌落为葡萄球菌数（可通过镜检）E沙门氏志贺氏琼脂培养2448小时后取出，通过其菌落形态（细小、透明菌落）、生化鉴定及血清试验是否有沙门氏菌。 Mac、MSA、MM每个平皿上的菌落数即为每毫升水中的含菌量。7.3.9 判定标准判定标准：细菌总数102；大肠杆菌数0；霉菌数0；沙门氏菌数0.附：水质检验细菌总数计数方法1、平板菌落数的选择：在求同稀释度的平均菌落数时，若其中一个平板有较大片状菌落生长时不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可计算半个平板后乘以2以代表全平板菌落数。2、稀释度的选择： A应选择平均菌落数在30300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之（见表例1）； B若有两个稀释度，其生长菌落均在30300之间，则应视二者之比值来决定，若其比值小于2，应报告其平均数；若大于2则报告其中较小的数字（见表例2和例3）；C若所有平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表例4）；D若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表例5）；E若所有稀释度平均菌落数均不在30300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300地平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表例6）；F若所有稀释度菌落数均不可计数，则以最高稀释倍数无法计数报告之（见表例7）。3、菌落数的报告：菌落数在100以内时，按实有数报告，大于100时，按四舍五入的方法，保留2位有效数字乘以10得指数报告之。三、鸡舍的细菌检测鸡舍的清洁卫生，直接影响着鸡群的健康生长及生产性能的发挥。所以鸡舍的消毒效果检查也是十分重要的。鸡舍的环境卫生监测，主要是对新鸡舍投入使用前和旧鸡舍鸡只出栏后通过消毒封闭再次使用前的消毒效果检验。检验有水样、消毒液、空气、表面棉拭子、垫料、饲料等；鸡舍养鸡过程中抽检水样和消毒液。1、空气检验：（检验方法同孵化厅）2、表面检验：墙壁（1米以下）、地面、可视设备表面等（检验方法同孵化厅）3、水样：水源、水箱、水池、鸡舍内水线（前、中、后三点）。水箱水池要求取水面10厘米以下的水（检验方法同孵化厅）。4、饲料：取样同垫料、绒毛（检验方法同水样）。5、垫料：分新垫料（消毒后鸡舍新铺垫料）旧垫料（正在使用中的垫料）。5.1准备：5.1.1采样袋 经高压消毒的牛皮纸袋。5.1.2培养基A营养琼脂（NA）、 B麦康凯琼脂(Mac)、 C高盐甘露醇琼脂（MSA）、D霉菌琼脂(MM)。E沙门氏志贺氏琼脂(SS)、F四硫磺酸钠增菌液（TTB）5.1.3器械镊子、天平、酒精灯、火柴、记号笔、三角瓶（50100ml）、水浴锅、试管架、平皿（90mm）、生理盐水、各规格的刻度吸管、取液泵等。5.2 采样采样部位及数量：每栋鸡舍采地面和蛋窝垫料，随机采样，每栋510份，每份35克。采样方法：先清洗消毒双手，用消毒的镊子夹取不同深度的垫料入采样袋中，每采一点后，再用消毒镊子采下一点，采后立即封严，并注明标记。5.3 检验5.3.1登记、编号：收到样品后，首先进行清点，登记其场别、采样部位、数量、送检日期等；并编号，同时将对应的编号用记号笔标记在采样袋上。 5.3.2称样 将垫料用镊子夹入灭菌的三角瓶中（可将三角瓶放在电子天平上回零），称量，新垫料称1g/份，旧垫料称0.5g/份，并将编号标于三角瓶上。