生物化学-酵母提取.doc

综合实验 酵母RNA的提纯及其定性鉴定与定量测定
一、实验目的
1、学习RNA提取的几种常用方法并掌握浓盐法提取RNA的原理和方法。
3、掌握几种定性鉴定所得RNA的原理与方法。
4、掌握两种定量测定所得RNA的原理和方法。
5、学习电泳技术的基本原理及其分类以及相关的应用。
Ⅰ 提纯部分
n 浓盐法提取酵母RNA
n Ⅱ 定性鉴定部分
一、RNA基团鉴定
二、电泳分离鉴定
三、光谱鉴定
四、纯度鉴定
Ⅲ 定量测定部分
n 一、地衣酚法定量测定
n 二、紫外吸收法定量测定
生物大分子物质提取的基本原理与步骤
一、材料选择与处理
二、细胞破碎
三、细胞器分离
四、提取
五、纯化
六、浓缩、干燥
七、样品保存
八、定性鉴定
九、定量测定
10、物质的利用
核酸的分布
n DNA：细胞核（95%）
细胞器（5%）
RNA：细胞质（75%)
细胞核(10%)
细胞器(15%)
n RNA以rRNA的数量最多（80％-85%)

核酸提取的主要步骤

n 破碎细胞
n 去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子
n 去除其它不需要的核酸分子
n 沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质

核酸分离纯化原则
n 保证核酸一级结构的完整性
n 排除其它分子的污染
n 简化操作，缩短时间，以减少各种有害因素对核酸的破坏
n 减少化学因素对核酸的降解(pH4-10)
n 减少物理因素对核酸的降解(机械剪切力 、 高温)
n 防止核酸的生物降解(DNA酶 、 RNA酶)
实验原理
n 由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在苯酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。此法能较好地除去DNA和蛋白质，提取的RNA具有生物活性。
n 酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量为干菌体的2.67%-10.0%，而DNA含量较少，仅为0.03%-0.516%。为此提取RNA多以酵母为原料。工业上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单。

n 稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。
n 浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。
RNA提取方法方法与分类
n 稀碱法( 0.2% NaOH )
n 浓盐法( 10% NaCl )
n 苯酚法
n 氯仿-异戊醇法
n 去污剂法
n 盐酸胍法
三、试剂和器材
1、试剂
（1）干酵母粉
（2） RNA标准溶液（100微克/毫升）
（8） 5%硝酸银溶液
（9）钼酸铵试剂2克钼酸铵溶解在100毫升10% 硫酸中。
（10）地衣酚试剂：100毫升浓盐酸加入100毫克三氯化铁，摇匀，贮存备用，使用前加入100毫克地衣酚。
n （11） NaCl
n （12） 95%乙醇
n （13） 6 mol/l HCl
n （14）高氯酸
n （15）氯化锂
n （16）硼酸缓冲液（pH-3.5）
n （17）磷酸缓冲液（pH-7.5）
2、器材
（1）电子天平 （2）电热套 （3）三角烧瓶 （4）烧杯 （5）高速冷冻离心机 （6）滴管
（7）抽滤瓶 （8）离心管 （9）恒温水浴箱
（10）吸量管 （11）紫外分光光度计
（12）表面皿 （13）量筒 (14）容量瓶 （15）擦镜纸 （16）比色皿 （17）玻棒 （18）定量滤纸 （19）试管
（20）布氏漏斗 （21）真空泵 （22）电泳仪
n （23）紫外检测仪（24）可见光分光光度计
n （25）托盘天平 （26）电泳槽 (27)0.5-5.0精密pH试纸
四、实验方法
RNA的提取的操作
3、 RNA提取方法(浓盐法)
①取 13g活性干酵母,置250 ml烧杯中，加入120 ml蒸 馏水，混匀；
②倒入8 g NaCl，电热套加热45分钟(玻棒要不断触底搅拌) ；
③稍微冷，3500 rpm离心8 min，将上清倒入50 ml烧杯 中。
④ 将烧杯冰浴10 min
⑤用HCl小心调节pH，至2.0～2.5；
⑥将烧杯冰浴10 min；
⑦将烧杯中物质（含沉淀）移入10 ml离心管中， 3500 rpm离心8 min，弃上清，
⑧将沉淀转移到1.5ml小离心管中，95%乙醇1.5 ml洗涤,5000 rpm离心4 min,倒弃清液。
⑨保存好粗RNA产品。
思考题
RNA含量测定之一：地衣酚法
RNA的地衣酚法定量测定原理
RNA含量测定之一：地衣酚法测定。
反应原理：当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3，5-二羟基甲苯（地衣酚 orcinol）反应，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鲜绿色复合物。反应产物在670 nm处有最大吸收。RNA浓度在20-250μg/ml范围内，光密度与RNA浓度成正比。
n （1）标准曲线的制作
取6支试管，7按下表编号及加入试剂，加毕混匀，置沸水浴中加热45 min，取出冷却，于670nm波长处测定光密度值。
（3）RNA含量的计算
n 根据测得的O.D值，从标准曲线上查出相对应的RNA含量，按下式计算出制品中RNA的百分含量：
n RNA%=
RNA鉴定之一：组成基团的鉴定
n 实验步骤:
n 取适量0.05 g提取的RNA，加10%硫酸液3 ml，放在沸水浴中加热5分钟，制成RNA水解，做以下鉴定
n （1）嘌呤碱基的检查
取水解液0.5ml，加氨水0.5ml及5%硝酸银溶液0.3ml，观察是否产生絮状嘌呤银化合物（有时絮状物出现较慢，可放置十几分钟）。
（2）磷酸的检查
取水解液0.5 ml，加2滴浓硝酸酸化，再加入0.5 ml钼酸铵试剂，放在沸水浴中加热10分钟，冷却静置后观察是否有黄色磷钼酸铵沉淀产生。
（3）核糖的检查
取水解液0.5 ml，加地衣酚试剂0.5 ml，放在沸水浴中加热5分钟，观察溶液颜色变化。
操作方法
用分析天平准确称取待测的样品RNA0.150g，加入少量的蒸馏水调成糊状，再加入少量的水稀释。用5%---6%的氨水调至pH值为7.0，定容到10 ml(RNA的鉴定三和四皆用该溶液,不过要稀释200 倍)。
取两支离心管，向第一支管中加入2 ml样品溶液和2 ml蒸馏水。第二支管中加入2 ml样品溶液和2 ml沉淀剂。混匀。
在冰浴中放置30分钟，然后离心10分钟，3000转/分钟。
从各管中取出0.25 ml上清液，用蒸馏水定容到25 ml。
于260nm处测定其光吸收值（OD1、OD2）
将样品放于紫外分光光度计上测定260nm,
计算核酸浓度。
OD1—OD2
RNA% = 0.022 ×100
样品浓度
式中：OD260为260nm波长处光密度读数；L 为比色杯的厚度；0.022为每毫升溶液内含
1微克RNA的光密度。
RNA的鉴定三：提取的RNA吸收光谱测定
核酸在240~290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，最大吸收值在260 nm附近。不同的核酸有不同的吸收特征。所以可以用紫外分光光度计加以定性和定量。
操作: 取RNA的定量分析之二所配溶液0.5 ml,稀释200倍,取3 ml测定不同波长(230、240、250 260、270、280、290、300、310 nm)下的OD值,以不同波长为横坐标, OD值为纵坐标绘制RNA吸收光谱曲线。
RNA的鉴定四：提取的RNA纯度的判断
纯DNA的 OD260/OD280 应大于1.8，而纯 RNA的 OD260/OD280应达到2.0。如果样品中含又杂蛋白、苯酚，则OD260/OD280的比值会明显降低。所以我们通过测定OD260/OD280的比值来检测RNA的纯度。
操作: 取RNA的定量分析之二所配溶液0.5 ml,稀释200倍,取3 ml于比色皿中分别在260nm、280nm处测定其光吸收值（OD1、OD2）
根据测得的OD值判断提取的RNA的纯度。
RNA的鉴定之二：
醋酸纤维素薄膜电泳分离鉴定
1、RNA的碱水解：
称取0.15克RNA，溶于4 mL 0.3 mol/L氢氧化钾溶液中，使RNA的浓度达到20-30 mg/ml。沸水浴30 min 或者在37℃水解18个小时。将水解液转移到椎形瓶中。冰浴中用高氯酸溶液将水解液滴定到pH3.5。2000r/min 离心10 min，上清液即是样品液。
２、准备与点样
(1)将薄膜切成2.0 cm×8 cm的小片。在薄膜无光泽面(正面)的一端约3.0 cm处用硬铅笔划一点样线。
(2)将薄膜无光泽面向下，置pH 3.5, 0.02 mol/L的柠檬酸缓冲液中浸湿。
3．电泳
将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时，无光泽面(即点样面)向下，点样端置于负极，槽架上以双层滤纸作桥垫，滤纸的一端与支架的前沿对齐，另一端浸入电极槽的缓冲液中。用缓冲液将滤纸全部浸润并驱除气泡。膜条与滤纸需贴紧，待平衡5 min后通电，电压为160~500V，电流为0.4 mA/cm，通电25-35 分钟左右关闭电源。
4．记录结果
通电完毕后用镊子将薄膜取出，于紫外灯下观察，用铅笔将吸收紫外光的暗斑圈出。
（3）点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散。但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始点参差不起，影响分离效果。
（4）点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。
（5）电泳时应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.4mA/cm。电流强度高，则热效应高；电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。
（6）操作过程为防止指纹污染，应戴手套。