分子生物学技术总结.doc

分子生物学技术总结姓名：梁潇 班级：2班 学号：1080800066一、核酸/蛋白分离技术1DNA分离：破碎细胞抽提蛋白质DNA沉淀乙醇洗除盐琼脂糖凝胶电泳检测用细胞裂解液裂解细胞膜，收集细胞核，加入SDS破裂核膜，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA是上解离下来，经苯酚、氯仿抽提去除蛋白质，无水乙醇沉淀DNA，75%乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥后，溶解于TE缓冲液中即得到相对分子量高的DNA。2RNA分离：抑制RNase抽提去蛋白质DNase消化DNA甲醛变性琼脂糖凝胶电泳通过带电的溶质分子与离子交换层析介质中可交换离子进行交换而达到分离纯化的方法，也可以认为是蛋白质分子中带电的氨基酸与带相反电荷的介质的骨架相互作用而达到分离纯化的方法。离子交换层析法主要依赖电荷间的相互作用，利用带电分子中电荷的微小差异而进行分离，具有较高的分离容量。几乎所有的生物大分子都是极性的，都可使其带电，所以离子交换层析法已广泛用于生物大分子的分离、中等纯化及精制的各个步骤中。3蛋白分离：离子交换层析（1）层析法利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结合，性无关组分随流动相流出。改变流动相组分，可将结合的亲和物洗脱下来。亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体，DNA与互补DNA或RNA，酶与底物、激素与受体、维生素与特异结合蛋白、糖蛋白与植物凝集素等。亲和层析（2）电泳分离：聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。应用：分离蛋白质和寡糖核苷酸二、基因克隆技术1PCR：在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促和反应，PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应分为三步：1）变性（9295） 2）退火 3）延伸PCR各步骤的目的（1）预变性：破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。 使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。（2）变性-退火-延伸循环：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备； 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。（3）PCR仪扩增循环后72度延伸10分钟：用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因：延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。（当然是在反应体系一定的条件下）根据延伸速率推得，扩增1kb以内的DNA片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使PCR反应完全以提高扩增产量 继续72度延伸了10分钟除了可以使PCR反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通Taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。基因组PCR（无内含子基因）逆转录PCR由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖RNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。 PCR RT-PCR（含有内含子的基因）通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA 5 和3 端 RACE/Gene Walking（从部分基因获得全长基因）SMARTTM 3-RACE：利用mRNA的3 末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。然后用一个基因特异引物GSP1（gene specific primer，GSP）作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3 末端的DNA片段扩增出来。SMARTTM 5-RACE：先利用mRNA的3末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5 末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oligo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头（见下图）。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（universal primer，UPM）作为上游引物，用一个基因特异引物2（GSP 2 genespecific primer，GSP）作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5末端的cDNA片段扩增出来。最终，从2个有相互重叠序列的3/ 5-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3和5端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。2 文库筛选（1）基因组文库：某种生物全部基因组DNA序列的随机片段重组DNA克隆的群体。该文库以DNA片段的形式贮存着某种生物全部基因组的信息，可以用来选取任何一段感兴趣的序列进行复制和研究。材料来自生物体基因组是RNA(如RNA病毒)所构建的核酸片段克隆群体，也是该生物的基因组文库。 基因上下游：基因上游：存在P-box和TATA-box一个是识别启动子的位点，一个是激活启动子的位点基因下游： 核酸分子杂交筛选：是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。杂交双方分别称为探针与待测核酸。杂交分子：杂交后形成的异源双链分子。核酸分子杂交技术：是指用标记的已知DNA或RNA片段检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。核酸探针( probe )：带有可检测标记的已知序列的互补DNA或RNA片段。通常用核素或非核素示踪标记。原理：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及复性过程中各分子间键的形成和断裂等。应用：定性或定量检测DNA或RNA序列片段的有力工具。（1）cDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。纯正基因 分子杂交/免疫筛选三、基因功能分析技术（一）基因结构： 1转录起始点：（1）TATA框（TATA box）：其一致顺序为TATAATAAT。它约在基因转录起始点上游约-30-50bp处，基本上由A-T碱基对组成，是决定基因转录始的选择，为RNA聚合酶的结合处之一，RNA聚合酶与TATA框牢固结合之后才能开始转录。（2）CAAT框（CAAT box）：其一致顺序为GGGTCAATCT，是真核生物基因常有的调节区，位于转录起始点上游约-80-100bp处，可能也是RNA聚合酶的一个结合处，控制着转录起始的频率。2引物延伸：变性退火延伸3启动子：启动子是一段位于结构基因5端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。启动子的结构影响了它与RNA聚合酶的亲和力，从而影响了基因表达的水平4瞬时表达：瞬时转染后的初期，质粒或DNA片段是游离在细胞中的，能够进行表达，成为瞬时转染表达。随后，游离在细胞中的质粒或DNA片段有两种归化，一种是被降解，还有一种是插入染色体中而能够持续地稳定地表达。人类结构基因4个区域：编码区，包括外显子与内含子；前导区，位于编码区上游，相当于RNA5末端非编码区（非翻译区）；尾部区，位于RNA3编码区下游，相当于末端非编码区（非翻译区）；调控区，包括启动子和增强子等。基因编码区的两侧也称为侧翼顺序外显子和内含子大多数真核生物的基因为不连续基因（interruptesd或discontinuous gene）。所谓不连续基因就是基因的编码顺序在DNA分子上是不连续的，被非编码顺序所隔开。编码的顺序称为外显子（exon），是一个基因表达为多肽链的部分；非编码顺序所称为内含子（intron）,又称插入顺序（intervening sequence,IVS）。内含子只转录，在前mRNA(pre-mNRA)时被剪切掉。如果一个基因有几个内含子，一般总是把基因的外显子分隔成n+1部分。内含子的核苷酸数量可比外显子多许多倍。 外显子外显子内含子接头每个外显子和内含子接头区都有一段高度保守的一致顺序（consensus seqence）,即内含了5末端大多数是GT开始，3末端大多是AG结束，称为GT-AG法则，是普遍存在于真核基因中RNA剪接的识别信号。 侧翼顺序侧翼顺序在第一个外显子和最末一个外显子的外侧是一段不被翻译的非编码区，称为侧翼顺序（flanking sequence）。侧翼顺序含有基因调控顺序，对该基因的活性有重要影响。 转录过程启动子 启动子（promoter）包括下列几种不同顺序，能促进转录过程： （1）TATA框（TATA box）（2）CAAT框（CAAT box） （3）GC框（GC box）：有两个拷贝，位于CAAT框的两侧，由GGCGGG组成，是一个转录调节区，有激活转录的功能。 此外，RNA聚合酶负责转录tRNA的DNA和5SrDNA，其启动子位于转录的DNA顺序中，称为下游启动子。 5增强子在真核基因转录起始点的上游或下游，一般都有增强子（enhancer）,它不能启动一个基因的转录，但有增强转录的作用。此外，增强子顺序可与特异性细胞因子结合而促进转录的进行。研究表明，增强子通常有组织特异性，这是因为不同细胞核有不同的特异因子与增强子结合，从而对基因表达有组织、器官、时间不同的调节作用。 6终止子在一个基因的末端往往有一段特定顺序，它具有转录终止的功能，这段终止信号的顺序称为终止子（termianator）。终止子的共同顺序特征是在转录终止点之前有一段回文顺序，约7-20核苷酸对。回文顺序的两个重复部分分由几个不重复碱基对的不重复节段隔开，回文顺序的对称轴一般距转录终止点16-24bp。 在回文顺序的下游有6-8个A-T对，因此，这段终止子转录后形成的RNA具有发夹结构，并具有与A互补的一串U，因为A-U之间氢健结合较弱，因而RNA/DNA杂交部分易于拆开，这样对转录物从DNA模板上释放出来是有利的，也可使RNA聚合酶从DNA上解离下来，实现转录的终止。（二）基因拷贝数拷贝数就是指某目的基因（可以是质粒）在某一生物群体或个体中存在的个数. 单拷贝就是该基因在基因组中只有一个,多则指有多个。 Southern blot检验：常用的 DNA 定量的分子生物学方法。原理：Southern杂交是利用标记的探针（probe）与膜上靶DNA片段进行杂交的技术，检测靶DNA片段中是否存在与探针同源的序列。将待测的 DNA 样品固定在固相载体（硝酸纤维膜或尼龙膜）上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相 DNA 的位置上显示出杂交信号，通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针(序列已知)进行特异性的靶序列检测。应用：目的基因检测，定性 基因拷贝数，定量过程：基因重组与转化重组质粒提取与鉴定质粒大量制备探针制备 Southern Blot细胞培养 基因组DNA制备 DNA浓度测定 酶切（三）转录模式1Northern blot：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。2（半）定量RTPCR：半定量RT-PCR一般是在没有条件做实时PCR 的情况下使用，用于测定体内目的基因的表达增加减少与否，即通过目的基因跑出来的电泳带与管家基因（如-actin）的电泳带的相对含量比较，观测目的基因表达增减，另外还要做一个-actin的内参照对照。（四）生物功能分析1过表达分析：2基因抑制或敲除分析：某一突变基因的表型效应由于第二个突变基因的出现而恢复正常时，称后一突变基因为前者的抑制基因。回复突变使突变基因的脱氧核糖核酸（DNA）分子结构恢复正常；抑制基因则并不改变突变基因的DNA分子结构 ，而只是使突变型的表型恢复正常。抑制基因一般用符号Su代表。当抑制作用发生在同一基因中时，这种抑制作用称为基因内抑制，属于不同基因的抑制作用则称基因间抑制。（五）蛋白定位GFP融合表达亚细胞定位：亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位。例如在核内、胞质内或者细胞膜上存在。GFP是绿色荧光蛋白，在扫描共聚集显微镜的激光照射下回发出绿色荧光，从而可以精确地定位蛋白质的位置。GFP，实际是给你要研究的物质加上标记，在此相当于报告蛋白的作用。使用GFP必须构建融合蛋白载体，并在转染之后有效表达。这样，若在荧光显微镜下看到细胞内某一部位存在GFP信号，说明和GFP融合的蛋白也存在于该部位，这样就达到了确定某物质亚细胞定位的目的。应用DNA亚克隆技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，通过愈伤组织转化法、基因枪、显微注射、电激转化等方法转化合适的细胞，利用目的基因的基因表达调控机制，如启动子和信号序列来控制融合基因的表达，在荧光显微观察系统下监测融合蛋白在细胞内的存在状态。目的基因融合基因 转化 表达 荧光显微观察GFT五、DNA/蛋白互作技术 （一）DNA/蛋白互作技术1凝胶阻滞分析：该方法用来研究DNA与特异性蛋白的相互作用，通常是放射性标记的DNA片段与纯化蛋白，或提取物中的蛋白混合物相结合，然后在非变性凝胶中分析该产物。与游离DNA相比，蛋白-DNA复合物的迁移率将降低，因此，与游离DNA相对应，人们将观察到带中的“阻滞”。 原理：蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。应用：该方法可用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体来检测特定的蛋白质，并可进行未知蛋白的鉴定。 2酵母单杂交：根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理，克隆与靶元件特异结合的转录因子基因(cDNA)的有效方法。其理论基础是：许多真核生物的转录激活子由物理和功能上独立的DNA结合区(DNA-binding domain BD)和转录激活区(Activation domain AD)组成，因此可构建各种基因与AD的融合表达载体，在酵母中表达为融合蛋白时，根据报道基因的表达情况，便能筛选出与靶元件有特异结合区域的蛋白。理论上，在单杂交检测中，任何靶元件都可被用于筛选一种与之有特异结合区域的蛋白。（二）蛋白/蛋白互作技术1GST pull-down：其基本原理是将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。 GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)2Western Blot：与Southern印迹杂交或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。3酵母双杂交：二个结构域不但可在其连接区适当部位打开， 仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白蛋白的相互作用。主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时， 测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达， 其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-ad没有。因此， 在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA结合结构域(如GAL4-bd， LexA-bd)； 另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad， VP16)。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中， 蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)， 从而可分析蛋白间的结合作用。 应用：酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。