分子生物学常用技术.pptx

第二十一章第二十一章第二十一章第二十一章分子生物学常用技术分子生物学常用技术The Popular Technology in The Popular Technology in Molecular BiologyMolecular Biology9/7/20241第第2节节 PCR技术技术第第3节节 转基因技术与基因剔除技术转基因技术与基因剔除技术第第1节节 分子印迹与杂交技术分子印迹与杂交技术第第6节节 蛋白质与核酸相互作用研究技术蛋白质与核酸相互作用研究技术第第4节节 生物芯片技术生物芯片技术第第5节节 蛋白质相互作用研究技术蛋白质相互作用研究技术9/7/20242第一节第一节分子印迹与杂交技术分子印迹与杂交技术Molecular Blotting&Hybridization Technology9/7/20243 一、核酸分子印迹与杂交技术一、核酸分子印迹与杂交技术 指具有一定互补序列，不同来源的核苷酸单链，指具有一定互补序列，不同来源的核苷酸单链，指具有一定互补序列，不同来源的核苷酸单链，指具有一定互补序列，不同来源的核苷酸单链，在一定条件下按照碱基互补配对的原则形成双链的在一定条件下按照碱基互补配对的原则形成双链的在一定条件下按照碱基互补配对的原则形成双链的在一定条件下按照碱基互补配对的原则形成双链的过程。过程。过程。过程。核酸分子杂交核酸分子杂交(nucleic acid hybridization)(nucleic acid hybridization)印迹印迹(blottingblotting)指利用各种物理方法，使电泳凝胶中的生物大指利用各种物理方法，使电泳凝胶中的生物大指利用各种物理方法，使电泳凝胶中的生物大指利用各种物理方法，使电泳凝胶中的生物大分子转移到硝基纤维膜等分子转移到硝基纤维膜等分子转移到硝基纤维膜等分子转移到硝基纤维膜等特定的支持物上特定的支持物上特定的支持物上特定的支持物上，使之成，使之成，使之成，使之成为固相化分子的过程。为固相化分子的过程。为固相化分子的过程。为固相化分子的过程。9/7/20244学习要求学习要求学习要求学习要求 1 1 1 1(heteroduplex)9/7/20245探针探针(probe)probe)探针种类探针种类标记物标记物 指指指指可可可可用用用用来来来来检检检检测测测测某某某某一一一一特特特特定定定定核核核核苷苷苷苷酸酸酸酸序序序序列列列列或或或或基基基基因因因因序序序序列列列列的的的的,与被测序列互补与被测序列互补并并并并经过特殊标记经过特殊标记的的的的DNADNADNADNA或或或或RNARNARNARNA片段。片段。片段。片段。寡核苷酸寡核苷酸寡核苷酸寡核苷酸基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNAcDNAcDNAcDNAcDNA片段片段片段片段 RNARNARNARNA片段片段片段片段放射性同位素放射性同位素放射性同位素放射性同位素地高辛地高辛地高辛地高辛生物素生物素生物素生物素荧光染料荧光染料荧光染料荧光染料 r-32P ATPa-32P dATP9/7/20246HdATP*9/7/20247dUTPDig-dUTPBiotin-dUTP非放射性标记物非放射性标记物非放射性标记物非放射性标记物Dig-DNA探针杂交探针杂交化学发光信号检测原理化学发光信号检测原理 Luminol化学发光原理化学发光原理 Biotin-DNA探针杂交探针杂交化学发光信号检测原理化学发光信号检测原理 Luminol化学发光原理化学发光原理 BiotinAvidinAvidin （一）（一）SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交 SouthernSouthern印迹杂交（印迹杂交（Southern Southern blottingblotting）是指）是指DNADNA与与DNADNA分子之间的杂交。分子之间的杂交。基本过程基本过程:将琼脂糖凝胶电泳分离的待测将琼脂糖凝胶电泳分离的待测将琼脂糖凝胶电泳分离的待测将琼脂糖凝胶电泳分离的待测DNADNADNADNA片段变性，再片段变性，再片段变性，再片段变性，再将将将将凝凝凝凝胶中的胶中的胶中的胶中的DNADNADNADNA分子转移到分子转移到分子转移到分子转移到硝基纤维膜等硝基纤维膜等硝基纤维膜等硝基纤维膜等固相支持物固相支持物固相支持物固相支持物上，然后用标记的探针检测待测的上，然后用标记的探针检测待测的上，然后用标记的探针检测待测的上，然后用标记的探针检测待测的DNADNADNADNA。可用于基因组可用于基因组可用于基因组可用于基因组DNADNADNADNA的定性与定量分析，重组质粒的定性与定量分析，重组质粒的定性与定量分析，重组质粒的定性与定量分析，重组质粒和噬菌体的分析等。和噬菌体的分析等。和噬菌体的分析等。和噬菌体的分析等。9/7/202410Southern印迹杂交的基本步骤印迹杂交的基本步骤:待测待测DNADNA样品的限制性内切酶消化样品的限制性内切酶消化 酶切酶切DNADNA样品的电泳分离样品的电泳分离 凝胶中凝胶中DNADNA的变性和的变性和SouthernSouthern印迹印迹 探针的制备探针的制备 Southern Southern杂交杂交 杂交结果的检测杂交结果的检测 9/7/202411支持物支持物转转移移缓缓冲冲液液WhatmanWhatman滤纸滤纸凝胶凝胶WhatmanWhatman滤纸滤纸纸纸巾巾玻璃板玻璃板重物重物500gNCNC膜或尼龙膜膜或尼龙膜 （二）（二）NorthernNorthern印迹杂交印迹杂交 利利利利用用用用类类类类似似似似于于于于SouthernSouthernSouthernSouthern印印印印迹迹迹迹杂杂杂杂 交交交交 的的的的 技技技技 术术术术 来来来来 检检检检 测测测测 RNARNARNARNA称称称称 为为为为NorthernNorthernNorthernNorthern印印印印迹迹迹迹杂杂杂杂交交交交（Northern Northern Northern Northern blottingblottingblottingblotting）。）。）。）。原原原原理理理理和和和和过过过过程程程程与与与与SouthernSouthernSouthernSouthern印印印印迹迹迹迹基基基基本本本本相相相相同同同同，只只只只是是是是检检检检测测测测的的的的分分分分子子子子是是是是RNARNARNARNA，可可可可用用用用来来来来对对对对组组组组织织织织或或或或细细细细胞胞胞胞中中中中的的的的mRNAmRNAmRNAmRNA进行定性或定量分析。进行定性或定量分析。进行定性或定量分析。进行定性或定量分析。9/7/202413Northern Northern 与与Southern blottingSouthern blotting的异同点的异同点相同点：相同点：原理均为毛细作用原理均为毛细作用 用途：用途：检测组织或细胞中已知的特异检测组织或细胞中已知的特异检测组织或细胞中已知的特异检测组织或细胞中已知的特异mRNAmRNAmRNAmRNA的表达水平；的表达水平；的表达水平；的表达水平；比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。不同点：不同点：转移的是转移的是转移的是转移的是RNARNARNARNA转移前无需酶切转移前无需酶切转移前无需酶切转移前无需酶切转移效率较高转移效率较高转移效率较高转移效率较高变性方法变性方法变性方法变性方法:DNA(:DNA(:DNA(:DNA(碱变性）碱变性）碱变性）碱变性）RNARNARNARNA（甲醛、乙二醛等）（甲醛、乙二醛等）（甲醛、乙二醛等）（甲醛、乙二醛等）9/7/202414HRP/APHRP/AP标记抗标记抗标记抗标记抗体与体与体与体与DigDig结合结合结合结合漂洗和封闭漂洗和封闭漂洗和封闭漂洗和封闭YHRPHRPHRPHRPHRPHRP底物与抗体底物与抗体底物与抗体底物与抗体-HRPHRP/AP/AP反应反应反应反应,显色或发光显色或发光显色或发光显色或发光底物底物底物底物 电泳电泳,转膜，转膜，紫外交联固定紫外交联固定D DD D North-South North-South 杂交原理和操作流程杂交原理和操作流程杂交原理和操作流程杂交原理和操作流程(地高辛标记地高辛标记地高辛标记地高辛标记)杂交：杂交：杂交：杂交：DigDig标记的探针与标记的探针与标记的探针与标记的探针与靶靶靶靶DNADNA结合结合结合结合9/7/202415 North-South North-South 杂交原理和操作流程杂交原理和操作流程杂交原理和操作流程杂交原理和操作流程(BiotinBiotinBiotinBiotin标记标记标记标记)杂杂杂杂交交交交：生生生生物物物物素素素素标标标标记记记记探探探探针针针针与与与与靶靶靶靶DNADNA结合结合结合结合底物在HRP催化下,反应发光电泳电泳电泳电泳,转膜，紫转膜，紫转膜，紫转膜，紫外交联固定外交联固定外交联固定外交联固定SASAHRPHRP底物底物B BB BHRP标记的链亲和素与探针上的生物素结合9/7/202416漂洗和封闭漂洗和封闭漂洗和封闭漂洗和封闭1.1.曝光：曝光：用滤纸吸去杂交膜上多余底物，作好标记，用滤纸吸去杂交膜上多余底物，作好标记，保鲜膜包裹，放在暗夹里，放上保鲜膜包裹，放在暗夹里，放上X X光片，曝光光片，曝光1-51-5 分钟；分钟；2.2.显影：显影：取出取出X X光片，按使用说明书显影和定影。光片，按使用说明书显影和定影。后继的化学发光检测后继的化学发光检测 Luminol化学发光原理化学发光原理 9/7/202417 （三）其他核酸杂交方法（三）其他核酸杂交方法1.1.斑点印迹杂交斑点印迹杂交 2.2.原位杂交（原位杂交（in situ hybridizationin situ hybridization）将变性的将变性的DNADNA或或RNARNA直接点样于直接点样于NCNC膜或尼龙膜上，膜或尼龙膜上，故称为斑点印迹。简便、快速，可以在同一张膜上故称为斑点印迹。简便、快速，可以在同一张膜上进行多个样品的检测。进行多个样品的检测。是是指指直直接接用用组组织织切切片片或或细细胞胞涂涂片片进进行行杂杂交交的的方方法法，可可用用于于检检测测组组织织切切片片或或细细胞胞内内某某些些特特异异性性核核苷苷酸或核酸片段。酸或核酸片段。9/7/202418 二、蛋白质印迹技术二、蛋白质印迹技术(Western blotting)(Western blotting)根根根根据据据据蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子之之之之间间间间存存存存在在在在相相相相互互互互作作作作用用用用的的的的特特特特点点点点，将将将将蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质电电电电泳泳泳泳分分分分离离离离，然然然然后后后后将将将将其其其其转转转转移移移移和和和和固固固固定定定定于于于于固固固固体体体体支支支支持持持持物物物物（NCNCNCNC膜膜膜膜或或或或其其其其它它它它膜膜膜膜）上上上上，再再再再用用用用相相相相应应应应的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子（最最最最常常常常用用用用的的的的是是是是抗抗抗抗体体体体）对对对对其其其其进进进进行行行行检检检检测测测测。因因因因此此此此，被被被被称称称称为为为为免免免免疫疫疫疫印印印印迹迹迹迹（immunoblottingimmunoblottingimmunoblottingimmunoblotting）技术。）技术。）技术。）技术。用用Western blotting检测样品中存在特异蛋白质检测样品中存在特异蛋白质 用于细胞中特异蛋白质的定量分析用于细胞中特异蛋白质的定量分析 用于蛋白质分子的相互作用研究用于蛋白质分子的相互作用研究9/7/2024199/7/202420HRP/APHRP/AP标记抗标记抗标记抗标记抗体与蛋白结合体与蛋白结合体与蛋白结合体与蛋白结合漂洗和封闭漂洗和封闭漂洗和封闭漂洗和封闭YHRPHRPHRPHRPHRPHRP底物与抗体底物与抗体底物与抗体底物与抗体-HRPHRP/AP/AP反应反应反应反应,显色或发光显色或发光显色或发光显色或发光底物底物底物底物电泳分离电泳分离电泳分离电泳分离,转膜转膜转膜转膜,固定蛋白于膜上固定蛋白于膜上固定蛋白于膜上固定蛋白于膜上1.Western Blotting直接法操作流程直接法操作流程:9/7/202421优点：优点：优点：优点：1.1.1.1.快速（一种抗体）快速（一种抗体）快速（一种抗体）快速（一种抗体）2.2.2.2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带没有二抗交叉反应引起的非特异性条带没有二抗交叉反应引起的非特异性条带没有二抗交叉反应引起的非特异性条带缺点：缺点：缺点：缺点：1.1.1.1.免疫反应性较低免疫反应性较低免疫反应性较低免疫反应性较低 2.2.2.2.无信号二级放大无信号二级放大无信号二级放大无信号二级放大 3.3.3.3.抗体标记费时昂贵抗体标记费时昂贵抗体标记费时昂贵抗体标记费时昂贵,使用不方便使用不方便使用不方便使用不方便9/7/202422HRPHRP/APAP标记二标记二标记二标记二抗与一抗蛋白抗与一抗蛋白抗与一抗蛋白抗与一抗蛋白复合物结合复合物结合复合物结合复合物结合漂洗和封闭漂洗和封闭漂洗和封闭漂洗和封闭YYHRPHRPHRPHRPHRPHRP底物与二抗底物与二抗底物与二抗底物与二抗-HRP/HRP/APAP反应反应反应反应,显色或发光显色或发光显色或发光显色或发光底物底物底物底物电泳分离电泳分离电泳分离电泳分离,转膜转膜转膜转膜,固定蛋白于膜上固定蛋白于膜上固定蛋白于膜上固定蛋白于膜上一抗与蛋白一抗与蛋白一抗与蛋白一抗与蛋白结合结合结合结合 (小鼠单小鼠单小鼠单小鼠单抗或兔多抗抗或兔多抗抗或兔多抗抗或兔多抗)2.Western Blotting间接法操作流程间接法操作流程:9/7/202423缺点：缺点：缺点：缺点：1.1.1.1.较慢速（较慢速（较慢速（较慢速（2 2 2 2种抗体）种抗体）种抗体）种抗体）2.2.2.2.有二抗交叉反应引起的非特异性条带有二抗交叉反应引起的非特异性条带有二抗交叉反应引起的非特异性条带有二抗交叉反应引起的非特异性条带优点：优点：优点：优点：1.1.1.1.免疫反应性较高免疫反应性较高免疫反应性较高免疫反应性较高 2.2.2.2.有信号二级放大，灵敏度高有信号二级放大，灵敏度高有信号二级放大，灵敏度高有信号二级放大，灵敏度高 3.3.3.3.可选用的标记二抗体商品多可选用的标记二抗体商品多可选用的标记二抗体商品多可选用的标记二抗体商品多,使用方便使用方便使用方便使用方便9/7/202424 三种印迹技术的比较三种印迹技术的比较 Southern blotting Northern blotting Western blotting样品样品限制性内限制性内切酶消化切酶消化电泳电泳变性变性转移膜转移膜紫外交联紫外交联仪等固定仪等固定杂交标记物杂交标记物DNARNA蛋白质蛋白质需要需要 不需要不需要 不需要不需要 琼脂糖凝琼脂糖凝胶电泳胶电泳琼脂糖凝琼脂糖凝胶电泳胶电泳SDS-PAGE电泳电泳碱变性碱变性甲醛或戊甲醛或戊二醛变性二醛变性高温变性高温变性NC膜或膜或尼龙膜尼龙膜NC膜或膜或尼龙膜尼龙膜NC膜或膜或PVDF膜膜需要需要 需要需要 不需要不需要标记探针标记探针 标记探针标记探针 (标记标记)抗体抗体9/7/202425第二节第二节PCR 技术的原理与应用技术的原理与应用Polymerase Chain Reaction9/7/2024265 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、一、PCRPCR技术的基本原理技术的基本原理9/7/202427Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的的含量可以扩大含量可以扩大100万倍以上。万倍以上。9/7/202428模板模板DNA特异性引物特异性引物耐热耐热DNA聚合酶聚合酶 (Taq DNA聚合酶聚合酶)dNTPsMg2+n PCR体系基本组成成分体系基本组成成分9/7/202429 一、一、PCRPCR技术的基本原理技术的基本原理 二、二、PCRPCR技术的主要特点技术的主要特点1.1.特异性强特异性强 2.2.灵敏度高灵敏度高 3.3.简便快速简便快速 4.4.对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低 9/7/2024319/7/202432 （三）基因突变分析（三）基因突变分析 PCR PCR与其他技术的结合可以大大提高与其他技术的结合可以大大提高 基因突变检测的敏感性。基因突变检测的敏感性。（四）（四）DNADNA和和RNARNA的微量分析的微量分析 （五）（五）DNADNA序列测定序列测定学习要求学习要求学习要求学习要求 2 2 2 2 （二）基因的体外定点突变（二）基因的体外定点突变-PCR定点诱变 三、三、PCRPCR技术的主要用途技术的主要用途 （一）目的基因的扩增与克隆（一）目的基因的扩增与克隆电泳电泳负极负极正极正极 测序反应测序反应 GATC（五）（五）末端合成终止法测定末端合成终止法测定DNADNA序列的原理序列的原理*2，3双脱氧核苷酸双脱氧核苷酸*用用4种不同荧光标记种不同荧光标记 DNADNA样品、引物样品、引物 DNA DNA聚合酶、聚合酶、dNTPdNTPddGddAddTddC5 3 CCGATTCTTGCACCTGAGGCTAAAAACGTGGACTGGCTAAAddAAddAGGCTAAAAAddCGGCTAAAAACddGGGCTAAAAACGddTGGCTAAAAACGTddGGGCTAAAAACGTGddGGGCTAAAAACGTGGddAGGCTAAAAACGTGGAddCGGCTAAAAACGTGGACddTGGCTAAADNA自动测序结果自动测序结果9/7/202437 弥弥补补了了PCRPCR技技术术和和原原位位杂杂交交技技术术的的不不足足，是是将将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。（二）原位（二）原位PCRPCR技术技术 (in situ PCR)(in situ PCR)（三）实时（三）实时PCRPCR技术技术 (real-time PCR)(real-time PCR)通通过过动动态态监监测测反反应应过过程程中中的的产产物物量量，消消除除了了产产物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量物堆积对定量分析的干扰，亦被称为定量PCRPCR。9/7/202439（一）反转录（一）反转录PCRPCR技术技术(RT-PCR)(RT-PCR)四、几种重要的四、几种重要的PCRPCR衍生技术衍生技术 是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的知序列的RNARNA进行定性及半定量分析的最有效方法进行定性及半定量分析的最有效方法实时荧光定量实时荧光定量PCR PCRPCR扩扩 增增 时时，TaqTaq酶酶的的5-5-33外外切切酶酶活活性性将将探探针针酶酶切切降降解解，使使报报报报告告告告荧荧荧荧光光光光基基基基团团团团和和淬淬淬淬灭灭灭灭荧荧荧荧光光光光基基基基团团团团分分离离，从从而而使使荧荧光光监监测测系系统统可可接接收到荧光信号；收到荧光信号；每每扩扩增增一一条条DNADNA链链就就有有一一个个荧荧光光分分子子形形成成，实实现现了了荧荧光光信信号号的的累累积积与与PCRPCR产物形成完全同步。产物形成完全同步。9/7/202440第三节第三节转基因技术与基因剔除技术转基因技术与基因剔除技术Transgenic Technology&GeneKnockout Technology9/7/202441 是是指指将将外外源源基基因因整整合合到到动动物物或或植植物物细细胞胞的的基基因因组组中中，并并使使外外源源基基因因在在动动物物细细胞胞或或植植物物细细胞胞中中稳稳定定地遗传和表达的技术。地遗传和表达的技术。基因的导入方式主要：基因的导入方式主要：显微注射法显微注射法(最常用最常用)胚胎干细胞法胚胎干细胞法 逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法 9/7/202442 一、转基因技术一、转基因技术转基因小鼠转基因小鼠正常小鼠正常小鼠1982年哈佛年哈佛R.D.Palmiter“制造制造”的的“超级小鼠超级小鼠”基本原理基本原理 是是采采用用显显微微注注射射等等方方法法，将将目目的的基基因因导导入入受受精精卵卵或或着着床床前前的的胚胚胎胎干干细细胞胞核核内内，并并经经同同同同源源源源重重重重组组组组整整合合到到的的基基因因组组DNADNA中中，然然后后将将细细胞胞置置入入受受体体动动物物子宫子宫，使之发育成个体。，使之发育成个体。转基因转基因转基因转基因(transgene)(transgene)(transgene)(transgene)：被导入的目的基因被导入的目的基因转基因动物转基因动物转基因动物转基因动物(transgenic(transgenic(transgenic(transgenic animal)animal)animal)animal)：目的基因的受体动物目的基因的受体动物u乳腺生物反应器的诞生乳腺生物反应器的诞生 据推测，据推测，据推测，据推测，2010201020102010年世界上采用动物乳腺生物反应器年世界上采用动物乳腺生物反应器年世界上采用动物乳腺生物反应器年世界上采用动物乳腺生物反应器生产的年产超过了生产的年产超过了生产的年产超过了生产的年产超过了500500500500亿美元。亿美元。亿美元。亿美元。1987年年Gordon等等将将组组组组织织织织型型型型纤纤纤纤溶溶溶溶酶酶酶酶原原原原激激激激活活活活剂剂剂剂(tPAtPAtPAtPA)与与小小鼠鼠乳乳乳乳清清清清蛋蛋蛋蛋白白白白基基基基因因因因的的的的启启启启动动动动子子子子构构成成重重组组基基因因，培培育育出出了了37只只只只在在在在乳乳乳乳汁汁汁汁中中中中能能能能表表表表达达达达tPA tPA tPA tPA 的的的的转转转转基因小鼠基因小鼠基因小鼠基因小鼠。动物动物多肽药物多肽药物用途用途绵羊绵羊a1抗胰蛋白酶蛋白抗胰蛋白酶蛋白治疗气肿治疗气肿绵羊绵羊CFTR治疗治疗 囊肿性纤维化囊肿性纤维化绵羊绵羊组织型纤溶酶原活化因子组织型纤溶酶原活化因子治疗血栓治疗血栓绵羊绵羊凝血凝血VIII因子、因子、IX因子因子治疗血友病治疗血友病绵羊绵羊纤维蛋白原纤维蛋白原伤口愈合伤口愈合猪猪组织型纤溶酶原活化因子组织型纤溶酶原活化因子治疗血栓治疗血栓猪猪凝血凝血VIII因子、因子、IX因子因子治疗血友病治疗血友病山羊山羊人蛋白质人蛋白质 C治疗血栓治疗血栓山羊山羊抗血栓因子抗血栓因子 3治疗血栓治疗血栓山羊山羊谷氨酸脱羧酶谷氨酸脱羧酶治疗治疗I型糖尿病型糖尿病山羊山羊Pro542治疗爱滋治疗爱滋 病病牛牛a-乳清白蛋白乳清白蛋白抗炎症抗炎症牛牛凝血凝血VIII因子因子治疗血友病治疗血友病牛牛纤维蛋白原纤维蛋白原伤口愈合伤口愈合牛牛胶原蛋白胶原蛋白 I,II组织修复组织修复,治疗风湿性关节炎治疗风湿性关节炎牛牛乳铁蛋白乳铁蛋白治疗肠道感染治疗肠道感染,感染性关节炎感染性关节炎牛牛人血清白蛋白人血清白蛋白维护血液体积维护血液体积鸡鸡,牛牛,山羊山羊单克隆抗体单克隆抗体用于疫苗生产用于疫苗生产 是是用用显显微微操操作作、电电融融合合等等方方法法，将将供供体体动动物物体体体体细细细细胞胞胞胞的的的的胞胞胞胞核核核核，全全部部导导入入另另一一动动物物个个体体的的去去去去核核核核卵卵卵卵细细细细胞胞胞胞中中中中，然然后后将将其其置置入入受受体体动动物物子子宫宫，使使之之发发育育成成为为动动物个体的技术员。物个体的技术员。9/7/202446 二、核转移技术二、核转移技术-即即体细胞克隆技术体细胞克隆技术 核核转转移移技技术术产产生生的的个个体体所所携携带带的的遗遗传传物物质质，与与细细胞胞核核供供体体的的遗遗传传物物质质完完全全一一样样，是是是是一一一一种种种种无无无无性性性性繁繁繁繁殖殖殖殖过程过程过程过程，即，即克隆克隆(clone)。1997年年2月月27日日Nature杂志报道：科学家杂志报道：科学家维尔维尔穆特穆特(WilmutWilmut)和和坎贝尔坎贝尔(Campbell)Campbell)，利用，利用克隆克隆技术，培育出一只小母技术，培育出一只小母羊羊“多利多利”。克隆克隆技术技术被被科学科学评为评为1997年世界十大科年世界十大科技进步之首。技进步之首。“多利多利”诞生标志着诞生标志着生物技术新时代的来临生物技术新时代的来临1.1.用于动物克隆用于动物克隆转移的核末经修饰转移的核末经修饰核转移技术的基本原理核转移技术的基本原理1.将供者细胞核注将供者细胞核注入到去核卵细胞内入到去核卵细胞内2.用电转移法将供者细胞核注射到去核卵细胞内u1997年年6月月维维尔尔穆穆特特(WilmutWilmut)报报道道：用用基基因因改改造造过过的的胎胎儿儿成成纤纤维维细细胞胞为为核核供供体体，获获得得了了表表达达人人凝凝血血因因子子IX的转基因克隆绵羊的转基因克隆绵羊“波莉波莉”。克隆出携带有人凝血因子克隆出携带有人凝血因子X基因的绵羊早期胚胎基因的绵羊早期胚胎 成纤维细胞。成纤维细胞。以该细胞系为核供体移植到去核卵母细胞中，经过以该细胞系为核供体移植到去核卵母细胞中，经过 处理后将卵母细胞植入假孕绵羊体内发育。处理后将卵母细胞植入假孕绵羊体内发育。获得获得3只能高水平表达人凝血因子只能高水平表达人凝血因子X（125g/ml）的绵羊。的绵羊。2.2.用于转基因动物生物反应器的制备用于转基因动物生物反应器的制备 转移经过修饰的核转移经过修饰的核又称又称又称又称基因打靶基因打靶基因打靶基因打靶 (gene targeting)(gene targeting)(gene targeting)(gene targeting)原理：原理：通通过过DNADNA定定定定点点点点同同同同源源源源重重重重组组组组，使使动动物物胚胚胎胎干干细细胞胞(ES(ES细细胞胞)的的某某特特定定内内源源基基因因被被破破坏坏而而造造成成其其功功能丧失。能丧失。9/7/202450 三、基因剔除技术三、基因剔除技术(gene knock-out)(gene knock-out)是采用分子生物学的方法，是采用分子生物学的方法，是采用分子生物学的方法，是采用分子生物学的方法，定向敲除定向敲除定向敲除定向敲除动物体细动物体细动物体细动物体细胞内的某个基因的技术。胞内的某个基因的技术。胞内的某个基因的技术。胞内的某个基因的技术。基本过程包括：基本过程包括：用同源基因片段用同源基因片段构建含有失活目的基因的载体构建含有失活目的基因的载体；显显微微注注射射法法将将含含有有失失活活目目的的基基因因的的载载体体导导入入ES细细胞胞，与与ES细细胞胞染染色色体体的的相相应应基基因因发发生生同同源源重重组组，替替代代(剔除剔除)掉掉ES细胞中原有的正常细胞中原有的正常/异常基因；异常基因；将将含含有有基基因因剔剔除除的的ES细细胞胞的的囊囊胚胚移移植植到到假假孕孕小小鼠鼠的的子子宫宫中中，使使之之发发育育成成一一种种既既含含基基因因剔剔除除细细胞胞又又含含正常细胞的正常细胞的嵌合体小鼠嵌合体小鼠嵌合体小鼠嵌合体小鼠；将将嵌嵌合合体体小小鼠鼠与与正正常常小小鼠鼠交交配配，最最终终筛筛选选出出基基因因剔除的剔除的纯合子小鼠纯合子小鼠纯合子小鼠纯合子小鼠。将将剔剔剔剔除除除除正正正正常常常常基基基基因因因因的的的的ESESESES细细细细胞胞胞胞注注入入动动物物的的囊囊胚胚中中，使使其其与与囊囊囊囊胚胚胚胚中中中中的的的的细细细细胞胞胞胞共共同同组组成成囊胚内的细胞团囊胚内的细胞团囊胚内的细胞团囊胚内的细胞团；四、基因转移和基因剔除在医学中的应用四、基因转移和基因剔除在医学中的应用 （一）建立疾病动物模型（一）建立疾病动物模型 （二）生物制药（二）生物制药 （三）治疗性克隆和生产可用于人体器官移植的（三）治疗性克隆和生产可用于人体器官移植的 动物器官动物器官9/7/202452 建建立立人人类类疾疾病病的的各各种种动动物物模模型型，研研究究基基因因在在动动物体内的表达调控规律及其产物与疾病的关系。物体内的表达调控规律及其产物与疾病的关系。转转基基因因动动植植物物作作为为医医用用或或食食用用蛋蛋白白的的生生物物反反应应器器，用用于于生生产产出出具具有有医医药药价价值值的的多多肽肽或或蛋蛋白白质质、抗抗体、疫苗等。体、疫苗等。学习要求学习要求学习要求学习要求 4 4 4 4第四节第四节生生 物物 芯芯 片片 技技 术术Biochip Technology9/7/202453生物芯片生物芯片:生物芯片包括生物芯片包括基因芯片基因芯片、蛋白质芯片蛋白质芯片、细胞芯细胞芯片片和和组织芯片组织芯片等。等。9/7/202454 是指采用微电子和微加工技术，将大量是指采用微电子和微加工技术，将大量已知序已知序列的核酸或蛋白质片段列的核酸或蛋白质片段等，有序地组合在约等，有序地组合在约1cm1cm2 2大大小的固相介质表面而构成的集成分析系统。小的固相介质表面而构成的集成分析系统。将其与将其与标记样品中的标记样品中的特异特异核酸或蛋白分子杂交、核酸或蛋白分子杂交、结合，通过对结合，通过对“标记标记”的的测定即可实现对核酸测定即可实现对核酸或或蛋蛋白质组分的快速、高效的分析处理。白质组分的快速、高效的分析处理。DNA DNA芯片芯片(DNA chip)(DNA chip)、DNADNA阵列阵列(DNA(DNA array)array)或或cDNAcDNA芯片芯片(cDNA chip)(cDNA chip)一、基因芯片一、基因芯片(gene chip)(gene chip)9/7/202455 指指以以原原位位合合成成或或显显微微打打印印的的方方式式，将将大大量量特特定定的的DNADNA片片段段或或cDNAcDNA片片段段作作为为探探针针，有有规规律律地紧密排列、固化在地紧密排列、固化在约约1cm1cm2 2的支持物上。的支持物上。使用时与使用时与标记的样品标记的样品杂交，通过对杂交信杂交，通过对杂交信号的检测分析从而得出样品的遗传信息。号的检测分析从而得出样品的遗传信息。9/7/202456玻片型玻片型这种芯片的点阵是通过原位合成技术这种芯片的点阵是通过原位合成技术制作的，制作的，10104040 万点阵万点阵/cm/cm2 2，必须借助于特殊的仪，必须借助于特殊的仪器对测定结果进行解读和分析。器对测定结果进行解读和分析。(Affimetrix公司公司)。22022202芯片点样仪芯片点样仪*Cy3*Cy3为红色为红色为红色为红色,标记处理组；标记处理组；标记处理组；标记处理组；Cy5Cy5为绿色为绿色为绿色为绿色,标记对照组。标记对照组。标记对照组。标记对照组。*红色表示上调；红色表示上调；黄色表示不变；黄色表示不变；绿色表示下调。绿色表示下调。是是将将蛋蛋白白分分子子作作为为探探针针，高高度度密密集集排排列列、固固定定在在固相支持物上的点阵。固相支持物上的点阵。加加入入待待测测蛋蛋白白样样品品反反应应时时，可可捕捕获获样样品品中中的的靶靶蛋蛋白白，再再经经检检测测系系统统对对靶靶蛋蛋白白进进行行定定性性和和定定量量分分析析的的一一种技术。种技术。二、蛋白质芯片二、蛋白质芯片 (protein chip)(protein chip)9/7/202459 基本原理：基本原理：蛋白质与蛋白质分子之间在空间构象蛋白质与蛋白质分子之间在空间构象上能特异性的相互识别和相互结合。上能特异性的相互识别和相互结合。最常用的探针：抗体最常用的探针：抗体 检测方法：标记检测法、直接检测法检测方法：标记检测法、直接检测法又称蛋白质阵列又称蛋白质阵列又称蛋白质阵列又称蛋白质阵列 (protein array)(protein array)(protein array)(protein array)学习要求学习要求学习要求学习要求 5 5 5 5第五节第五节蛋白质相互作用研究技术蛋白质相互作用研究技术 Protein-Protein Interaction Technology9/7/202460 该系统的建立是基于对该系统的建立是基于对酵母转录因子酵母转录因子GAL4GAL4分子的研究。分子的研究。GAL4（一）基本原理（一）基本原理DNA结构域结构域(BD)(DNA binding domain)N端端转录激活域转录激活域(AD)(activation domain)C端端 一、酵母双杂交系统一、酵母双杂交系统 （yeast two-hybrid systemyeast two-hybrid system）9/7/202461nBDBD能识别位于能识别位于Gal4Gal4效应基因的上游激活序列效应基因的上游激活序列(UAS)(UAS)；GAL4的的DNA-BD和和DNA-AD结构域：结构域：9/7/202462nADAD可与其他成分结合而启动可与其他成分结合而启动UASUAS下游的基因转录。下游的基因转录。nBDBD和和ADAD两两结构域结构域单独存在时无转录激活功能；单独存在时无转录激活功能；n只有两者连接而形成的空间结构才具有转录激活功能。只有两者连接而形成的空间结构才具有转录激活功能。BDBDADAD转录因子转录因子转录因子转录因子激活激活序列序列(UAS)Gal4效应基因效应基因9/7/202463 将将BDBD基基因因与与已已知知蛋蛋白白基基因因X X融融合合后后，插插入入表表达达载载体中构建体中构建BD-XBD-X重组载体重组载体；将将ADAD基基因因与与未未知知蛋蛋白白群群基基因因Y Y(或或未未知知蛋蛋白白群群cDNAcDNA文库文库)融合后，融合后，插入表达载体插入表达载体构建构建AD-YAD-Y重组载体群重组载体群。宿宿宿宿主主主主菌菌菌菌:剔剔剔剔除除除除了了了了转转转转录录录录因因因因子子子子GAL4GAL4GAL4GAL4；在在在在其其其其GAL4GAL4GAL4GAL4基基基基因因因因启启启启动动动动激激激激活活活活序序序序列列列列的的的的下下下下游游游游插插插插入入入入特特特特定定定定的的的的报报报报告告告告基基基基因因因因，如如-半半乳乳糖苷酶编码基因，糖苷酶编码基因，表达产物为表达产物为表达产物为表达产物为 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶。BDBDADAD转录因子转录因子转录因子转录因子激活激活序列序列(UAS)Gal4效应基因效应基因BDBDX XADADY YY=Y1,Y2,Y3,.,Yn-半乳糖苷酶半乳糖苷酶YmYmX X-半乳糖苷酶半乳糖苷酶Ym+iYm+iX X （二）酵母双杂交系统的应用（二）酵母双杂交系统的应用1.1.分析已知蛋白质之间的相互作用分析已知蛋白质之间的相互作用2.2.筛选和发现新的相关蛋白质筛选和发现新的相关蛋白质 3 3.筛选药物的作用位点及药物对蛋白质之筛选药物的作用位点及药物对蛋白质之 间相互作用的影响间相互作用的影响 4 4.绘制蛋白相互作用系统图谱绘制蛋白相互作用系统图谱9/7/202465 二、噬菌体展示技术二、噬菌体展示技术 是是将将外外源源蛋蛋白白或或多多肽肽，与与噬噬菌菌体体表表面面蛋蛋白融合表达，并呈现在噬菌体表面的技术。白融合表达，并呈现在噬菌体表面的技术。通通过过与与特特定定的的标标记记抗抗体体(或或受受体体、配配基基等等)结结合合，可可把把展展示示有有特特定定蛋蛋白白的的噬噬菌菌体体，从从表表达达有有各各种种外外源源性蛋白的噬菌体肽库中性蛋白的噬