碱性脂肪酶.docx

3 实验部分
3.1 样品的采集
采集学校周围餐馆附近的土壤；按三角形分布形状采取三处土样（一，二，三），将采集的样品置于采样袋中带回实验室备用。
3. 2 仪器与试剂
3.2.1 主要仪器
ZHWY-1102 型恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；
水浴恒温振荡器（上海亚荣生化仪器厂）；
SW-CJ-1Cμ型双人单面洁化工作台（苏州净化）；
AR2140 型分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；
离心机（无锡瑞江）；
XFLS-50MA高压灭菌锅（浙江新丰医疗器械）；
303-0型台式培养箱（北京永光明医疗仪器）；
JY98-3D超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

3.2.2 主要试剂及配制
橄榄油（olive oil CR）为上海毕高化学试剂公司产品；
聚乙烯醇（PVA、CR）、溴甲酚紫（pH5.2(黄)～6.8（紫））为国药集团化学试剂有限公司产品；
95%乙醇（AR）、蔗糖（AR）、氯化钾（AR）、硫酸镁（AR）、硫酸铵（AR）为天津科密欧化学试剂有限公司；
蛋白胨（BR）为北京奥博星生物技术公司产品；甘氨酸（AR）为中国惠兴生化试剂有限公司产品。

（1）2%聚乙烯醇（PVA）溶液：称取20 g聚乙烯醇（PVA）加入去离子水800 mL，在沸水浴中加热不断搅拌，直至全部溶解，冷却后用0.2 mol/L NaOH调pH值为8.2，再定容至1000 mL。
（2）聚乙烯醇（PVA）橄榄油乳化液：取2%聚乙烯醇溶液150 mL，加50 mL橄 榄油，用高速组织捣碎机搅拌6 min，即成乳白色聚乙烯醇橄榄油乳化液，保存于低温下备用。
（3）溴甲酚紫溶液（100 mg/100 mL）：准确称取0.01 g溴甲酚紫加8 mL蒸馏水搅拌溶解，转入10 mL容量瓶中，定容至10 mL，备用。
（4）0.05 mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液：称取1.88 g甘氨酸，加入480 ml水，用6 mol/L NaOH调pH 8.0，定容至500 mL，备用，需新鲜配制。
（5）0.05 mol/L NaOH标准溶液：称取NaOH4.0 g，用蒸馏水溶解定容至1000 mL,用邻苯二甲酸氢钾标定,使用时再用蒸馏水稀释1倍，即为0.05 mol/L的NaOH溶液 。
（6）1%酚酞指示剂：称取1.0 g酚酞，溶于100 mL95%乙醇溶剂中。

3.3 培养基
（1）富集培养基（g/L）：蛋白胨4.0，酵母粉0.5，硫酸镁0.1，橄榄油乳化液4 mL/L，pH值 8.0～10.0。
（2）平板分离培养基（g/L）：硫酸铵1.0，磷酸氢二钾1.0，氯化钾0.5，硫酸镁0.5，琼脂15，橄榄油乳化液75 mL，溴甲酚紫10 mL ，pH值 8.0～10.0。
（3）马铃薯琼脂营养培养基（PDA）
200 g土豆洗净去皮切小块，加水1000 mL煮沸半个小时,趁热纱布过滤后加水至IL，加葡萄糖20 g，再加入20 g琼脂，pH自然。
（4）复筛培养基（g/L）：蛋白胨 4.0，酵母粉0.5，蔗糖0.5，硫酸铵0.1，硫酸镁 0.1，磷酸二氢钾0.1，橄榄油乳化液4 mL，pH值8.0～10.0。

3.4 实验步骤
3.4.1 产脂肪酶微生物的筛选
（1）富集培养：称5 g土样于灭菌的100 mL三角瓶中，每瓶中装45 mL生理盐水，搅拌均匀，静置半个小时吸取样品悬液5 mL于装有50mL富集培养基的250 mL三角瓶中，28℃摇床培养48 h。
（2）初筛：吸取富集培养液1 mL于9 mL无菌生理盐水中，使其呈101的稀释液，同法继续稀释至10-5，取10-3、10-4、10-5三个稀释度菌悬液200 µL涂布到平板分离培养基上(pH8～10)。28 ℃培养72 h以获得产脂肪酶的菌株。观察培养基上是否有透明圈，根据产生透明圈的早晚和透明圈直径与菌落直径比值的大小，选取比值较大的菌株于PDA斜面培养基4℃保存，以备进一步复筛。
（3）复筛：初筛分离后的菌株挑取适量(1～2环)转接到装有50 mL复筛培养基的250 mL三角瓶中，28℃条件下摇床培养48 h，取2 mL培养液，10000 r/min离心20 min，取上清液测定酶活。
3.4.2 酶活测定方法
（1）脂肪酶活力的定义在40 ℃，pH值8.0条件下，每1 min催化底物（橄榄油）产1 μmoL脂肪酸所需的酶量定义为1个活力单位（U）。
（2）脂肪酶活测定的方法 采用碱滴定法测定酶活，50 mL的三角瓶中加入4 mL pH 8.0的甘氨酸-NaOH缓冲液，5 mL聚乙烯醇橄榄油乳化液，将其放置40 ℃水浴预热5 min，然后精确加入1 mL酶液，保温10 min，立即加入15 mL乙醇终止反应，加入酚酞指示剂2滴，用0.05 mol/L NaOH滴定至红色为终点。

计算公式如下：

V1—测试酶溶液滴定消耗的NaOH体积；
V2—对照滴定消耗的NaOH体积；
0.05—标准NaOH摩尔数（mol/L）；
t—为反应时间，min；
n—稀释倍数。