表面前处理对镁合金的生物相容性的影响.doc

表面预处理对镁合金的生物相容性的影响
卡拉洛伦茨、约翰内斯克布伦纳、菲利普、莱拉加法尔、本法布里
表面科学和腐蚀研究所，材料科学与工程系，纽伦堡埃尔兰根大学，91058埃尔兰根大学，德国医学物理与技术中心，物理学系，纽伦堡埃尔兰根大学，埃尔兰根，德国
于2009年1月29日收到，修订于2009年3月13日，2009年4月17日接受，2009年5月3日可在线阅读。

摘 要
这项研究报告了，在培养实验中，位于细胞表面的钝化镁对人体HeLa细胞和小鼠成纤维细胞存活率的影响。表面抛光的商业纯镁在细胞培养液中表现出高反应性，导致PH值向碱性方向变化，因此，细胞粘附和生存强烈受阻。镁表面钝化可以加强细胞在1M 的NaOH中的存活率。在模拟体液中浸泡培养镁试样可以观察到最好的初始细胞粘附，这导致了一个仿生，非晶Ca∕Mg-P高表面粗糙度层的形成。然而，这表面层仅仅是钝化镁和密封表面。随后，与氢氧化钠钝化物相比，镁的解体将会导致PH值的增加比较明显，防止长期细胞的存活。这些结果表明，表面钝化氢氧化钠和M- SBF一起可以改变镁合金的表面活性，化学和粗糙度，为细胞在非生物相容性的镁合金上存活提供了条件。

关键词：镁、腐蚀、细胞培养、钝化
1.简介
镁及其合金在生物医学应用中越来越重要，特别是作为一种可生物降解心脏
或骨科植入物的材料。生物可吸收镁植入物可以用来解决一些与长期所使用的金属植入物相关的问题，如金属的植入导致永久性的物理∕机械性刺激，导致无法适应不断的增长和其它形状在人体内的变化。生物可吸收镁植入物也可以防止与长期释放金属离子和∕或颗粒通过腐蚀或磨损过程相关的问题。
为了可靠的预测镁植入物在人体内的行为，在人体内的腐蚀行为，以及与镁表面相互作用的生物需要特点。在典型环境下，已经广泛的研究了商业镁合金的腐蚀行为，合金可以有不同的用途，例如：镁及镁合金在NaCl2溶液中的电化学腐蚀行为的一般资料已在文献中提到。镁腐蚀时会有氢气析出，并导致周围环境碱化。出现这一现象的原因：一方面，这两个因素可能强烈的损害生物镁，例如，生物的相容性阻止细胞附着在种植体表面；另一方面，镁植入物解体时释放的镁离子不会导致毒性反应，这是因为在体内镁的浓度可以通过自我平衡机制来控制。
即使增加了对医药镁的兴趣，然而对细胞在镁合金表面行为的研究还是比较少，这些研究可以在文献中查到。据报道，成骨细胞和人体骨髓细胞在AZ91D镁合金腐蚀的表面上附着，增殖和存活。然而，相对于组织培养处理塑料表面，观察到细胞存活率降低，这是因为PH值增加（+0.39）或离子释放到培养基中。另一研究报告说，存在于细胞培养液中的商业纯镁样品，对小鼠骨髓细胞的增长没有抑制作用。最近的一篇文章报道说，细胞无法生存在未经处理的AZ91镁合金上超过一天，而给样品涂上一层氢化非晶硅涂层，则样品表现出良好的生物相容性。评价所使用的Mg-Ca合金，L型929细胞无明显的毒性作用；反而培养基中提取的合金更有益于细胞的存活。类似的研究得出，二元镁合金有利于纤维细胞和成骨细胞的长大。然而，在这项研究中显示，细胞的存活率依赖于不同的二元合金解体时所产生的腐蚀产物的类型。
总而言之，镁腐蚀对细胞行为的影响是矛盾的，因为有报道表明，细胞在镁的腐蚀表面既可以存活也可以死亡，这一结论是可以在文献中找到的。用于该实验中的合金的类型和细胞系有很大的不同，因此不可能得出对镁合金表面细胞行为的影响因素这一关键结论。
在目前的工作中，我们研究了人体HeLa细胞和小鼠成纤维细胞在存在纯镁的细胞培养液中的行为，该纯镁要么经过特殊的表面处理，要么没有，这是用来控制镁的反应性，化学成分和∕或表面粗糙度。结果表明，表面处理对细胞在镁表面上的粘附和存活很重要。
2.材料和方法
所有实验，都是把商业纯镁棒（直径为25.4㎜,99.9%的纯度）切割成2㎜厚的试样。并且用砂纸（600号）打磨，然后用乙醇∕甘油（3:1）混合物作润滑剂，用钻石膏（6um）将其表面抛光。随后，用纯酒精清洗试样3min，并在空气中干燥。
为了改变镁的耐蚀性、化学成分和表面形貌，要么将镁试样放在1M氢氧化钠中浸泡24h使其钝化，要么将其放在37℃的模拟体液（SBF）中浸泡5天。表一显示的是在此次实验中所用到的模拟体液的成分。在1M氢氧化钠中浸泡的试样，降低了它的表面活性，这是因为有薄的Mg(OH)2层形成。在模拟体液中浸泡的试样，导致它的表面有混合的Mg∕Ca-P层形成。
样品经过表面处理之后，用乙醇清洗，并在空气中干燥。用发射扫描电子显微镜（FE-扫描电镜）和能量色散X射线（能谱）来分析表征试样的形态和组成。用光测量水滴的接触角来判定试样表面的润湿性。用波长为780nm的激光来确定经过不同表面处理的试样的表面粗糙度。
表一 在此次研究中用到的模拟体液的成分所有浓度为mmol l-1

由于在2ml的基本细胞培养液中培养时镁溶解，从而导致培养液（温度为37℃，含5%的CO2和95%的湿度）的PH值发生变化，用该培养液是为了确保在环境条件相同的细胞培养实验中使用。该细胞培养液中含有作为酸碱指示剂的酚红，用RGB CCD相机（佳能）监测到该培养液由红色转变为蓝色，PH值由7.4变为9.0。校准曲线是在PH值为7.4~9.0的范围内确定的。存在镁样品的培养液的PH值是通过计算由红色到蓝色的色度强度比例得出的。
细胞培养实验的镁样品在波长为260nm的紫外光照射下消毒。经过不同处理的镁标本放在含5%CO2的空气气氛，温度为37℃，相对湿度为95%的恒温箱中24小时后培养人体HeLa细胞。最低限度的基本培养液是加入10%的胎牛血清（MEM+FBS），该培养液作为细胞培养液使用。大约有100万个细胞放于该培养液中。三个培养基针对不同的条件使用。在选定的条件下，绿色荧光蛋白-肌动蛋白使小鼠成纤维细胞稳定转变，通过附加的实验来研究细胞附着和蔓延的时间序列。这两种细胞系均是标准细胞系，并在全世界的许多实验室已经使用；在变化的环境下，它们表现出强劲的生长状态，当它们从平面基板上生长时会有致密单层形成，该平面基板适合细胞的附着和传播领域的量化。
培养液在恒温箱内24h后，将细胞放在3%多聚甲醛∕0.3%海卫-X100的溶液中，将其视为肌动蛋白染色的细胞骨架，或用Hoechst 33342可视化细胞核内。用荧光显微镜将染色细胞放大6000倍进行观察。
用扫描电镜观察固定在室温下含2.5%戊二醛环境下15min的细胞。在PBS溶液中冲洗试样，并在分级系列的乙醇（33%，66%，95%，98%，100%）中脱水，脱水时间（33%的乙醇中5min，66%的乙醇中5 min，100%的乙醇中15 min），然后烘干。
3.结果和讨论
3.1前处理后的表征
用扫描电镜和激光轮廓来观察样品的表面形貌。图一显示了浸泡在NaOH和M-SBF溶液中的试样的扫描电镜顶视图。在1M NaOH溶液中钝化，试样原表面的磨痕仍然清晰可见，这表明形成的钝化膜非常薄-在碱性溶液中形成的钝化膜厚度为纳米级。在M-SBF溶液中浸泡5天会形成一个更厚更粗糙的表面层-这一层的厚度为几十微米。经过不同的表面处理之后，用激光轮廓来测定其表面粗糙度，如图2所示。在M-SBF溶液（图2给出了Ra值）中浸泡的试样，其平均粗糙度Ra值增大很多。在M-SBF溶液中浸泡的试样，其表面形貌导致了强烈的表面亲水性行为，用水滴接触角来衡量（表二）。

图一 镁样品表面的SEM照片
（a）在1M NaOH溶液中浸泡24h，（b）在37℃的M-SBF溶液中浸泡5天

通过能谱分析（见表3）来确定表面层的化学组成。在NaOH溶液中钝化的试样，只能检测出Mg和O。试样在NaOH溶液中会形成很薄的表面层（纳米级），通过能谱所确定其组成并不是对应的MgO∕Mg(OH)2钝化层，因为信号主要来源于镁基体。对于在M-SBF溶液中浸泡的样品，其信号来源于Ca、P和C，以及Mg和O峰。先前所做的浸泡实验，即将含稀土的镁合金浸泡在M-SBF溶液中，该溶液与本次研究所用的溶液有相同的条件（浸泡5天，37℃SBF溶液）。此外，含稀土的镁合金会形成与此次实验相似的表面层，在目前的研究中，不能通过X射线衍射（XRD）来检测镁样品的磷灰石高峰，这表明浸泡在M-SBF溶液中的镁，其表面会有碳酸钙/镁-磷酸盐非晶表面层形成。
总而言之，在NaOH溶液中浸泡会导致有一层薄的（厚度为纳米尺度）MgO∕Mg(OH)2钝化层形成，然而在M-SBF溶液中浸泡的镁，会有较厚（数十微米级）非晶的，具有高表面粗糙度的碳酸钙∕Mg-P酸盐表面层形成。

表二 经过不同表面处理的镁，水滴在其表面的接触角

表三 用能谱分析镁表面形成的表层，该镁经过不同的表面处理：
在1M NaOH溶液中浸泡24h或在37℃的M-SBF溶液中浸泡5天

图2 镁表面的激光轮廓
（a）抛光，（b）在1M NaOH溶液中浸泡24h，（c）在37℃的M-SBF溶液中浸泡5天
3.2测定细胞培养液的PH值
与镁试样接触2h的细胞培养液的PH值，均会在参考值7.68的基础上增加。PH值增加最大的是浸泡在M-SBF溶液（PH 8.96）中的样品，次之是抛光的样品（PH 8.01），最低的是NaOH钝化样品（PH 7.88）。该PH值就是溶液的平均值；在实验中，不需要搅动溶液，在镁样品表面附近的PH值显著提高。样品浸泡在M-SBF溶液中，使其PH值增加，这表明在浸泡的过程中镁上有表面层形成，而该层并没有对镁形成高度保护，这与该层的孔隙率有关。对镁合金在M-SBF溶液中的腐蚀行为的时间依赖性做了调查。对经过不同表面处理的镁在细胞培养液中的电化学行为进行比较，可以得出，镁在细胞培养液中的初期溶出率降低，在M-SBF溶液中约降低了1∕5，在1M NaOH溶液中降低1∕20。溶出度（电化学行为）具有强烈的时间依赖性，在碱性溶液中有钝化膜形成，从而可以有限的阻止含有氯离子的中性细胞培养液对镁的腐蚀。
3.3细胞培养实验
对于每一个实验，在镁基体中的细胞数和玻璃板上的细胞数已确定。图3显示的是在三个独立的实验中细胞的平均密度。该参考样品（玻璃培养皿中不含镁样品）表面显示出了最高的细胞密度。大范围的演变因素包括氢气，PH值的增加是由于镁在细胞培养液中溶解，以及原来或腐蚀后的镁表面的化学和物理性质都可能导致减少细胞在镁基体上的粘附和增长。经剖析这些因素是可能的，但需要大量的实验来，从而超越现在的研究范围。下面的数据只涉及表面处理后的镁对细胞密度和细胞扩散的影响，但并不试图在细胞环境改变的情况下分别检测细胞的粘附，生长和生存（作为一种身体的功能）。
经过不同处理的镁放在细胞培养液中24h后，细胞的密度发生变化。未经过前处理的（抛光样品）镁，发现在其表面没有或有很少的细胞数量。将样品引入到细胞培养液，可以观察到有气体产生。毫无疑问，未经过处理的镁样品具有高反应性，从而阻止细胞在其表面的附着和生存，虽然还不清楚这是不是氢气生成和PH值增加的主导因素。
与抛光表面相比，这两种表面改性的样品表面具有更多的细胞数量，而且浸泡在M-SBF溶液中比浸泡在NaOH溶液中更有利于样品钝化和细胞的粘附。产生细胞行为差异的原因可能是不同的表面化学（浸泡在M-SBF溶液中的样品，其表面存在Ca和P，见表3），也可能是大大增加了表面粗糙度（见图2）。
通过观察荧光显微成像（图3b-e），我们进一步研究细胞扩散和肌动蛋白细胞骨架的形成。对于未经过预处理的抛光试样，只有单一的细胞可以看见，而且细胞几乎不扩散。然而对于在NaOH溶液中钝化过的样品，可以观察到有肌动蛋白细胞骨架形成和良好的细胞扩散，覆盖大部分表面。可以用更高分辨率的扫描电子显微镜观察NaOH钝化表面的良好的细胞扩散和丝状伪足的形成，如图3f所示。对于其它类型的表面，无丝状伪足的形成（数据未显示）。

图3 HeLa细胞在不同预处理的镁表面的细胞行为
（a）细胞培养24h后的细胞密度，（b-e）染色细胞的荧光成像，（f）浸泡在M-SBF溶液中的镁，其表面附着的细胞的SEM图像
对于浸泡在M-SBF溶液中的样品，可以看到大量的细胞核，但是细胞几乎不扩散，而且也没有肌动蛋白细胞骨架形成。这一调查结果表明，人体体液浸泡过的样品表面，有利于初始细胞粘附，但细胞培养24h后，几乎不再扩散，而且在实验24h后，出现细胞死亡的现象，这可能导致PH值的变化，该变化发生在存在经人体体液浸泡过的样品的细胞培养介质中，该介质如上面所述。
为了研究细胞粘附时间与其在M-SBF溶液中浸泡过的表面处扩散的关系，初步试验为将小鼠的GSP-12C成纤维细胞稳定的转化为用绿色荧光蛋白标记的肌动蛋白。在细胞培养的不同时间内，用显微镜来研究相同的样品。图4显示了经过不同的培养时间后，细胞的显微镜图像，以及在培养时间内，细胞扩散的面积。在培养6h后，细胞的铺展面积增加，细胞形态为丝状伪足，这表明样品在M-SBF溶液中有表面层形成，从而促进细胞的粘附。然而，经过6h的培养，细胞扩散面积减少，而且细胞的形态表明细胞的活力下降。24h后，大部分细胞已脱离表面，与扩散面积相接触的细胞几乎为没有。这些结果表明，表面化学和∕或在M-SBF溶液中形成的表面层的粗糙度都会导致细胞具有良好的粘附性，表面层提供了有限的保护，而且碱化后的细胞培养液防止长期生存。作为一个结论，为了确保细胞在表面有好的粘附性和长期存活性，必须对表面化学和粗糙度进行优化，并且在同一时间内，镁表面的反应必须减慢。则可能的途径是对镁的表面进行组合钝化∕矿化处理。

图4 镁样品表面的小鼠成纤维细胞，该镁样品进过预处理，即在37℃的M-SBF溶液中浸泡5天。在不同的培养时间内，细胞的显微镜图像和细胞扩散的面积。
至于镁及镁合金在人体内的生物医学应用应该被考虑，但是，PH值的变化在很大程度上会预防集体运输的过程和大量缓冲体液不断地交换。在生理条件下为了评估镁腐蚀对细胞行为的影响，我们建议，在体外细胞培养实验中，应该使得细胞能够运动而且培养液能够不断交换。另一方面，镁植入物附近的PH值可能比体外实验培养液要高，因为有限的流体可以通过植入物周围的细胞外基质进行交换。
然而，结果清楚的表明，镁通过优化表面前处理，镁表面和生物环境的相互作用可能适合所需要的性能。今后的研究将会是，系统研究不同的细胞类型在镁表面的粘附和存活的零界表面参数。此外，将会对纯镁和不同镁合金的性能进行比较，合金化可以降低腐蚀速率，但也会改变表面化学。
4.结论
未经过预先处理的镁，其表面最初反应性高，而且HeLa细胞也不可能在其表面粘附和生存。镁在1M NaOH溶液中，其表面会形成钝化，从而提高了细胞的存活率。在M-SBF溶液中浸泡会导致形成含Ca和P的一个粗糙的表面层，促进细胞在其表面附着。然而，该层具有差的保护性能，从而防止细胞长期存活。
作为细胞培养实验通常提出相对的低液量∕表面面积比，而且环境没有交换，镁腐蚀的有害影响，例如：PH值增加，在与体内情况进行比较时，对其进行了过分谨慎的评估。然而，在其表面有H2生成，而且镁快速溶解，从而导致活跃的表面直接阻碍细胞表面的形成，此过程在该环境中是独立的。因此，控制镁表面的最初反应，体内细胞反应仍然是进一步研究的重要问题。
致谢：
作者感谢德国研究基金会（DFG）的资金资助。对于研究聚合物材料的主席对激光轮廓的广泛支持。Claudia Mierke和Christine Albert对细胞培养实验的帮助，Anna Klemm, Felix Schmidt-Stein and Sebastian Bauer对表面上细胞成像的支持。
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