四个产品集菌器更换验证结果.doc

头孢拉定、头孢唑林、头孢呋辛、头孢曲松无菌检验用集菌
器变更验证试验结果

无菌检验用集菌器目前为密理博一次性使用联集菌器（CNHASV3105型、TZHASV210型）。该集菌器两联的报价为100元，三联的报价为150元。而同种类型的国产高得泰林集菌器报价在30元左右。为了响应公司节能降耗的号召，拟将密理博集菌器更换为高得泰林集菌器。试验结果如下。
1. 预实验、
为了能使验证试验得到预期的结果，我们进行了一系列的预实验，如最小抑菌浓度（MIC）测定、头孢酶的降解能力分析、药品在高得泰林集菌器中的残留量测定等。
1.1 MIC测定
取10支试管，编号依次为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；将样品用硫乙醇酸盐流体培养基稀释成10μg /ml。然后在10支试管中用硫乙醇酸盐流体培养基做梯度稀释，同时加入小于100CFU的金黄色葡萄球菌液。稀释后每支试管中的总体积为4ml。将试管置于32.5℃逐日观察，3天后记录各管浑浊情况。如表1所示。
浓度及样品
表1 MIC 测定
编号

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
样品浓度（μg/ml）
1.00
0.80
0.60
0.50
0.40
0.30
0.20
0.15
0.10
0.05
头孢拉定
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
孢唑林钠
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
头孢呋辛钠
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
头孢曲松钠
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
注：“-”表示澄清；“+”表示浑浊。
由表1可知头孢拉定的MIC在0.80～1.00μg/ml之间；头孢唑林的MIC在0.20～0.30μg/ml之间；头孢呋辛的MIC在0.15～0.20μg/ml之间；头孢曲松的MIC在0.50～0.60μg/ml之。
1.2 头孢酶的降解能力分析
取5支试管，编号依次为1、2、3、4、5.将样品用硫乙醇酸盐流体培养基稀释成10μg /ml。然后在5支试管中用硫乙醇酸盐流体培养基做梯度稀释，同时加入小于100CFU的金黄色葡萄球菌液和1万U的头孢菌素酶。稀释后每支试管中的总体积为6ml。将试管置于32.5℃逐日观察，3天后记录各管浑浊情况。如表2所示。
浓度及样品
表2 头孢酶降解分析
编号

1
2
3
4
5
6
7
8
样品浓度（μg/ml）
4.00
3.50
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
头孢拉定
-
-
-
+
+
+
+
+
孢唑林钠
-
+
+
+
+
+
+
+
头孢呋辛钠
-
-
-
-
-
+
+
+
头孢曲松钠
-
-
-
-
+
+
+
+
注：“-”表示澄清；“+”表示浑浊。
由表2可知在3天的时间内每1万U的头孢酶能降解10μg的头孢拉定，20μg的头孢唑林钠，8μg的头孢呋辛钠，9μg的头孢曲松钠。
1.3 高得泰林集菌器残留量分析
将30g样品溶于500ml蛋白胨溶液中，均匀地加入三个集菌器中，待彻底过滤后向每个集菌器中加入100ml的冲洗液，盖上集菌器的胶帽，拿起集菌器用手上下，左右摇动集菌器，使液体在集菌器内打旋（不要怕弄湿集菌器上方的膜），每个集菌器冲洗10秒钟。然后排掉冲洗液，按照上面的方法每个集菌器冲洗3遍。然后向每个集菌器中加入100的硫乙醇酸盐流体培养基。将3个集菌器依次变为A、B、C。将B、C置于4℃下，暂时储存，将A置于室温下过夜。
第二天取A适量于8支试管中（试管编号为1、2、3、4、5、6、7、8），依次做梯度稀释，同时加入小于100的金黄色葡萄球菌。稀释液为硫乙醇酸盐流体培养基，每支试管中的液体总体积为4ml。置32.5℃培养，逐日观察，3天后记录结果。如表3所示。
编号
表3 残留量分析
加量及样品

1
2
3
4
5
6
7
8
A中培养基加量(ml)
4.00
3.50
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
头孢拉定
-
-
+
+
+
+
+
+
孢唑林钠
-
-
+
+
+
+
+
+
头孢呋辛钠
（10g/筒）
-
-
+
+
+
+
+
+
头孢呋辛钠
（30g/筒）
-
-
-
-
-
-
+
+
头孢曲松钠
-
-
+
+
+
+
+
+
注：“-”表示澄清；“+”表示浑浊。
由表3可知头孢拉定的残留量小于30μg，头孢唑林的残留量小于7μg，每桶过滤10g头孢呋辛钠的滤筒残留量小于5μg；每桶过滤30g头孢呋辛钠的滤筒残留量小于60μg；头孢曲松钠的残留量小于17μg。
2. 验证试验
向做残留量试验中制备的滤筒B、C中各加入10WU的头孢酶和小于100CFU的金黄色葡萄球菌，然后于32.5℃培养，逐日观察，5后记录结果。如下表4所示。
培养天数
表4 验证试验
样品

1
2
3
4
5
头孢拉定
B
-
+
+
+
+
C
-
+
+
+
+
孢唑林钠
B
-
+
+
+
+
C
-
+
+
+
+
头孢呋辛钠
（10g/筒）
B
-
-
+
+
+
C
-
+
+
+
+
头孢呋辛钠
（30g/筒）
B
-
-
-
+
+
C
-
-
-
+
+
头孢曲松钠
B
-
+
+
+
+
C

+
+
+
+
注：“-”表示澄清；“+”表示浑浊。
培养天数
由表4可知，大部分集菌器在第二天能变浑浊。在第三天除过滤30g头孢呋辛钠的集菌器外均能变浑浊。滤30g头孢呋辛钠的集菌器在第4天变浑浊。
3. 分析及结论
综合头孢拉定、头孢唑啉钠、头孢呋辛钠、头吧曲松钠的MIC值，头孢酶对这4个品种的降解能力以及在高得泰林集菌器中的残留量，验证试验应该能够顺利通过。这4个产品的验证试验结果也基本证明了这一点。唯独过滤30g头孢呋辛钠的集菌器在第4天才变浑浊。该集菌器中头孢呋辛钠的残留量约为60μg，而跟据预实验10万U的头孢菌素在3天时间内能降解80μg。这种矛盾可能是由于金黄色葡萄球菌的活性差异造成的。如能将加酶量翻倍或增加一次冲洗，过滤30g头孢呋辛钠的集菌器在3天内也应该能变浑浊。
为了弄清残留量与冲洗次数之间的数学关系，需要测量初次过滤残留在集菌器内的液体体积。我们称量了过滤前后集菌器重量的变化，得出初次过滤残留液体约为1.5ml。在以后冲洗的目的是对这1.5ml残留液的稀释，以及对吸附在集菌器中的样品洗脱。冲洗液中样品的浓度很低，因此我们可以忽略冲洗液中样品的再吸附。这种情况下样品的洗脱符合一级反应动力学方程。因此有如下方程。
（1）
R—样品残留量
C0—样品溶于500ml冲洗液后的浓度
CA—吸附于集菌器内的样品量
VR—残留液体体积
VB—每次冲洗的液体体积
n—冲洗次数
λ—洗脱系数
当冲洗次数大于2时方程式中的第一项可以忽略，因此残留浓度可表示为如下方程。
, n>2（2）
在该方程中CA与样品及样品初始浓度有关；λ与集菌器和样品有关。跟据集菌器中冲洗两边和三遍的残留量分析CA约为4000μg，λ约为1.8。跟据方程2的估计过滤量为10大部分产品在完成3次冲洗后残留量都在18μg以下，这跟我们的验证结果是一致的。