虾蟹混养池塘中微生物群落结构及抗性基因.pdf

第3 2卷第2期2 0 2 3年6月江苏海洋大学学报(自然科学版)J o u r n a l o f J i a n g s u O c e a n U n i v e r s i t y(N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n)V o l.3 2 N o.2J u n.2 0 2 3 D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.2 0 9 6-8 2 4 8.2 0 2 3.0 2.0 0 2虾蟹混养池塘中微生物群落结构及抗性基因*王晓凡a,b,c,蔡月凤a,b,c,张 宇a,b,李俊佳a,b,c,谭皓文a,b,c,申 欣a,b,c(江苏海洋大学 a.江苏省海洋生物资源与环境重点实验室;b.江苏省海洋生物技术重点实验室;c.江苏省海洋生物产业技术协同创新中心,江苏 连云港 2 2 2 0 0 5)摘 要:为比较不同种类三疣梭子蟹与脊尾白虾混养池塘中环境微生物的种类、丰度及群落结构差异,综合水质监测、宏基因组测序等方法对不同类型养殖池塘的理化参数、微生物多样性以及抗性基因进行比较分析。结果表明,在整个养殖周期中,环境微生物在门水平上均以变形菌门为主,其相对丰度最高。此外,微生物多样性和功能基因比较分析显示,不同种类三疣梭子蟹混养池塘中微生物种群相对丰度存在差异,且对应的优势功能基因也存在差异,总体上以参与新陈代谢功能为主。环境抗性基因时空比较分析结果显示,养殖水环境中抗性基因在养殖早期阶段主要为磷酸乙醇胺转移酶MC R,中后期为型-内酰胺酶,在养殖全周期底泥环境中,内氟喹诺酮类和四环素为相对丰度最高的抗性基因。对虾蟹混养池塘环境微生物的多样性、结构组成等进行研究,可为三疣梭子蟹优质种苗的选择、人工养殖管理技术等提供理论依据,推动水产养殖可持续性发展。研究养殖水体中A R G s的分布、丰度和变化对水质评价和污染控制具有重要意义。关键词:宏基因组学;微生物群落结构;抗生素抗性基因;虾蟹养殖池塘中图分类号:S 9 1 7.1 文献标志码:A 文章编号:2 0 9 6-8 2 4 8(2 0 2 3)0 2-0 0 0 7-1 2S t u d y o n M i c r o b i a l C o mm u n i t y S t r u c t u r e a n d R e s i s t a n c e G e n e s i n t h e P o l y c u l t u r e P o n d s o f S h r i m p-c r a bWANG X i a o f a na,b,c,C A I Y u e f e n ga,b,c,Z HANG Y ua,b,L I J u n j i aa,b,c,T AN H a o w e na,b,c,S HE N X i na,b,c(a.J i a n g s u K e y L a b o r a t o r y o f M a r i n e B i o r e s o u r c e s R e s o u r c e s a n d E n v i r o n m e n t;b.J i a n g s u K e y L a b o r a t o r y o f M a r i n e B i o t e c h n o l o g y;c.C o-i n n o v a t i o n C e n t e r o f J i a n g s u M a r i n e B i o-i n d u s t r y T e c h n o l o g y,J i a n g s u O c e a n U n i v e r s i t y,L i a n y u n g a n g 2 2 2 0 0 5,C h i n a)A b s t r a c t:I n o r d e r t o c o m p a r e t h e d i v e r s i t y,a b u n d a n c e a n d c o mm u n i t y s t r u c t u r e o f e n v i r o n m e n-t a l m i c r o o r g a n i s m s i n m i x e d p o n d s o f d i f f e r e n t s p e c i e s o f P o r t u n u s t r i t u b e r c u l a t u s a n d w h i t e s h r i m p s,w a t e r q u a l i t y m o n i t o r i n g a n d m e t a g e n o m i c s e q u e n c i n g w e r e u s e d t o c o m p a r e a n d a n a-l y z e t h e p h y s i c a l a n d c h e m i c a l p a r a m e t e r s,m i c r o b i a l d i v e r s i t y a n d r e s i s t a n c e g e n e s i n d i f f e r e n t t y p e s o f a q u a c u l t u r e p o n d s.T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t p r o t e o b a c t e r i a w e r e d o m i n a n t i n t h e p h y l a l e v e l w h i c h p r o v e d t h e h i g h e s t r e l a t i v e a b u n d a n c e a r o u n d t h e w h o l e c u l t u r e c y c l e.I n a d d i t i o n,t h e c o m p a r a t i v e a n a l y s i s o f m i c r o b i a l d i v e r s i t y a n d f u n c t i o n a l g e n e s d e m o n s t r a t e d t h a t b o t h t h e r e l a-t i v e a b u n d a n c e o f m i c r o b i a l p o p u l a t i o n s a n d t h e c o r r e s p o n d i n g d o m i n a n t f u n c t i o n a l g e n e s s h o w e d d i f f e r e n c e i n v a r i e t y t y p e s o f P o r t u n u s t r i t u b e r c u l a t u s p o n d s,i n g e n e r a l,i t w a s m a i n l y i n v o l v e d*收稿日期:2 0 2 2-1 1-0 8;修订日期:2 0 2 3-0 2-1 6基金项目:国家重点研发计划资助项目(2 0 2 0 Y F D 0 9 0 0 2 0 3);江苏省农业科技自主创新资金资助项目(C X(2 2)2 0 3 2)作者简介:王晓凡(1 9 9 8),女,江苏连云港人,硕士研究生,研究方向为水产养殖,(E-m a i l)1 8 4 2 3 0 6 0 3 8q q.c o m。通信作者:蔡月凤(1 9 8 9),女,江苏沛县人,讲师,博士,研究方向为海水养殖,(E-m a i l)y u e f e n g c a i j o u.e d u.c n;申欣(1 9 8 1),男,山东成武人,教授,博士,研究方向为海水养殖,(E-m a i l)s h e n t h i n 1 6 3.c o m。i n m e t a b o l i c f u n c t i o n.T h e r e s u l t s o f s p a t i o-t e m p o r a l c o m p a r i s o n o f e n v i r o n m e n t a l r e s i s t a n c e g e n e s i n d i c a t e d t h a t t h e r e s i s t a n c e g e n e s w e r e m a i n l y p h o s p h o e t h a n o l a m i n e t r a n s f e r a s e(MC R)a t t h e e a r l y s t a g e a n d-l a c t a m a s e a t t h e m i d d l e a n d l a t e s t a g e s.E n d o f l u o r o q u i n o l o n e s a n d t e t r a c y-c l i n e w e r e t h e m o s t a b u n d a n t r e s i s t a n c e g e n e s i n t h e w h o l e c u l t u r e c y c l e.T h i s s t u d y a i m e d t o p r o v i d e a t h e o r e t i c a l b a s i s f o r t h e s e l e c t i o n o f h i g h-q u a l i t y b r e e d i n g a n d t h e m a n a g e m e n t o f a r t i f i-c i a l c u l t u r e o f P o r t u n u s t r i t u b e r c u l a t u s,w h i c h c o u l d p r o m o t e s u s t a i n a b l e d e v e l o p m e n t o f a q u a-c u l t u r e.I t w a s c r u c i a l t o s t u d y t h e d i s t r i b u t i o n,a b u n d a n c e a n d v a r i a t i o n o f A R G s i n a q u a c u l t u r e w a t e r f o r w a t e r q u a l i t y e v a l u a t i o n a n d p o l l u t i o n c o n t r o l.K e y w o r d s:m e t a g e n o m i c s;m i c r o b i a l c o mm u n i t y s t r u c t u r e;a n t i b i o t i c r e s i s t a n c e g e n e;s h r i m p a n d c r a b c u l t u r e p o n d0 引言随着我国水产养殖业的快速发展,海水养殖总量也 在 逐 年 递 增。2 0 2 1年 海 水 养 殖 总 产 量 达2 2 1 1.1 4万t,其中甲壳类养殖产量比2 0 2 0年增加6.7 3%,总产量为6 4 3.9 1万t,而梭子蟹产量1 0.5 3万t1。因具有肉质鲜美、营养价值高等优点,梭子蟹已经成为我国重要的海水养殖经济种类。三疣梭子 蟹(P o r t u n u s t r i t u b e r c u l a t u s)隶 属 于 甲 壳 纲(C r u s t a c e a)、十足 目(D e c a p o d a)、梭子蟹 科(P o r-t o n i d a e)、梭子蟹属(P o r t u n u s),从日本、朝鲜半岛到我国东南沿海均有分布2。池塘养殖是三疣梭子蟹养殖的主要方式,传统的高密度单种类养殖已无法满足生产实际需求,现如今已被多元生态混合养殖模式所替代3,即利用生态位互补原理,使养殖环境内生物体达到最有益的生长状况4。在探索出生态健康的养殖模式后,人们又把目光转移到新种类的开发中。从耐弧菌的“科甬1号”5,到生长特性良好的“黄选1号”6,高品质高产量的梭子蟹新种类也成为了人们日益关注的焦点。因此,对现有普通三疣梭子蟹养殖种类进行更新换代,对于提高养殖产量、规格和产品档次,提高养殖的经济效益,具有重要而深远的意义7。养殖环境对生物体的生长具有一定的影响,水体环境中生存着大量的已知或未知的菌群,这些微生物菌群在水质调控、生态系统稳定及疾病的发生与控制等方面都发挥着重要的作用8。针对不同的养殖水体加入特定的微生物,即可达到水质调控的目的。徐芯渝9按1111的比例添加乳酸菌(l a c t o b a c i l l u s)、玉米乳酸菌(L.z e a e)、不动杆 菌(A c i n e t o b a c t e r)和枯草芽孢杆菌(B a c i l l u s s u b t i l i s)制成微生物复合菌剂M 5,有效降低了澳洲淡水龙虾(C h e r a x q u a d r i c a r i n a t u s)养殖环境中的氨氮和化学需氧量(c h e m i c a l o x y g e n d e m a n d,C O D)。黄雪敏 等1 0研 究 发 现,健 康 和 发 病 的 凡 纳 滨 对 虾(L i t o p e n a e u s v a n n a m e i)糠虾期育苗水体微生物多样性和优势菌群丰度存在显著差异,养殖水体环境中微生物多样性高有利于水体环境稳定和虾幼体的健康,反之则有可能造成幼体发病。同样,杜世聪等1 1在研究中发现,凡纳滨对虾发病前,其体内肠道微生物结构趋向于养殖水体的微生物结构,其中绿弯菌门(C h l o r o f l e x i)、-变形菌纲和解糖微小寄生菌门平均相对丰度均显著高于健康水体,较健康塘表现出较低的S h a n n o n指数;随着疾病的爆发,体内微生物群落结构与水体环境中的微生物群落结构具有更高的相似性。有许多研究表明,甲壳动物肠道微生物群落结构是随着养殖水体的群落结构的变化而变化的1 2,很大程度上受到养殖环境的影响。金若晨等1 3在对凡纳滨对虾样本的微生物进行分类汇总时发现,样品中有3 5个门、7 0个纲、1 5 2个目、2 7 4个科以及4 2 0个属,在水样、底泥和虾肠道中均能检测到,幼体阶段凡纳滨对虾从水体中直接摄取食物,养殖环境中微生物群落结构直接影响生物体内部微生物结构。罗鹏等1 4对凡纳滨对虾咸淡水养殖系统内各种环境微生物群落组成进行了比较研究,通过微生物菌群多样性分析(p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n-d e n a t u r i n g g r a d i e n t g e l e l e c t r o p h o-r e s i s,P C R-D G G E)及聚类分析,也进一步证实了虾肠道中微生物是由水体中演替而来,养殖生物体疾病的发生以及致病菌的存在都与养殖环境中致病菌的存在密不可分。微生物以群落的形式存在于养殖环境中,影响整个生态系统1 5,对养殖环境变化十分敏感,微生物群落结构也是评判水质环境的重要8江苏海洋大学学报(自然科学版)2 0 2 3年6月指标 1 6。养殖环境中菌群的结构和组成,受不同的环境、不同的养殖条件以及养殖生物生长状况等各方面的影响或有不同1 7,所以菌群结构在正常情况下也长期处于一个动态平衡的状态中1 8。抗生素作为一种防治病害的药剂常在动物细菌性疾病的治疗中被广泛应用,在畜牧业和水产养殖业中,常在饲料中添加抗生素来促进养殖生物的生长和防治病害1 9。虽然抗生素具有一定的杀菌、促生长等作用,但长期的不规范使用不仅会降低药效,增加投入成本,还可能诱发一系列携带抗生素的抗性基因的耐药性菌株出现,从而恶性循环对养殖生物体造成新的危害2 0。大多数养殖生物体对抗生素的吸收有限,约半数以上的抗生素会随着生物体的新陈代谢排出体外,到达养殖环境中;环境中的细菌也会因抗生素残留产生一定的耐药性,从而形成抗生素抗性菌(a n t i b i o t i c r e s i s t a n c e b a c t e r i a,A R B)和抗 生 素 抗 性 基 因(a n t i b i o t i c r e s i s t a n c e g e n e s,A R G s)2 1。A R G s的出现直接影响水产品养殖环境中的微生物群落结构,同样微生物群落结构会影响A R G s的产生和丰度2 2,二者相互作用、相互影响。目前,畜牧业和水产养殖业养殖环境中水体、土壤、动物肠道等均有A R G s检出的报道2 3。本研究基于I l l u m i n a平台的二代测序技术,为三疣梭子蟹种类选择及养殖总产量的提升提供理论依据与支持,同时研究养殖环境中抗性基因有利于对养殖环境进行人工干预、调控,为该生态养殖模式的发展与推广提供更加科学的理论依据。分析A R G s的丰度分布及变化情况,探明A R G s与水产动物及人类致病菌之间的关系,建立抗生素抗性基因的安全评价与预警体系,对我国生态安全和经济发展都具有重要的意义。1 材料与方法1.1 养殖基地和样品采集本实验在江苏省南通市启东水产养殖基地进行。选取三疣梭子蟹与脊尾白虾混合养殖模式,以当地普通三疣梭子蟹与新引进的“科甬1号”三疣梭子蟹作为实验比较组,将两个种类混养池塘分别命名为普通混养塘和科甬混养塘。采样时间设置在放养蟹苗的当年5月、9月及1 1月份,即三疣梭子蟹养殖周期的前、中、后期。分别利用有机玻璃采水器和抓斗式采泥器在池塘对角线两侧离岸1.5 m及池塘中心位置采集水体样品和底泥样品,将样品分别置于1 L无菌样品瓶和无菌样品袋中。水体样品经0.2 2 m无菌滤膜过滤,将滤膜收集在5 0 m L无菌管中,和底泥样品一起放于-8 0 冰箱保存备用。在科甬混养塘养殖前、中、后期采集的水体样品分别标记为KW 1,KW 2和KW 3,底泥样品分别记为K S 1,K S 2和K S 3;在普通混养塘养殖前、中、后期采集的水体样品分别记为CW 1,CW 2和CW 3,底泥样品分别记为C S 1,C S 2和C S 3。1.2 虾蟹混养池塘水质指标监测在养殖的早、中期对采集水样水质指标进行监测,包括温度、盐度、p H、C O D、无机氮D I N和无机磷D I P。现场测定温度、盐度、p H和C O D,使用流动水质分析仪测量D I N与D I P。样品采集和分析处理 方 法 参 照 海 洋 监 测 规 范(G B/T 1 7 3 7 82 0 0 7)进行。1.3 虾蟹混养池塘环境M e t a文库构建本实验采用C T A B法抽提养殖环境样品中的总D NA。取1 g上述D NA样品,使用N E B N e x t U l t r a D NA L i b r a r y P r e p K i t(N E B,U S A)试剂盒进行文库构建,随后用C o v a r i s超声波破碎仪随机打断检测合格的D NA样品成长度约为3 5 0 b p的片段,经末端修复、加p o l y A尾、加测序接头、纯化、P C R扩增等步骤,完成整个文库的制备。完成文库构建后,先使用Q u b i t 2.0进行初步的定量,稀 释 文 库 至2 n g/L,随 后 使 用 A g i l e n t 2 1 0 0对文 库 的 插 入 片 段 长 度 进 行 检 测,并 使 用q P C R方法对文 库的有效D NA浓度进 行 准 确 定量。文库 检 测 合 格 后,分 别 进 行I l l u m i n a P E 1 5 0测序。1.4 虾蟹混养池塘环境M e t a文库分析及抗性基因预测将测序原始数据进行质控及宿主过滤,获得有效数据后进行M e t a g e n o m e组装;采用M e t a G e n e-M a r k软件对组装后的s c a f t i g s进行基因预测;去冗余后获得g e n e c a t a l o g u e,综合文库测得的C l e a n D a t a,预测获得每个g e n e c a t a l o g u e在各样品中的相对丰度信息;将g e n e c a t a l o g u e比对至M i c r o N R数据库,获得每个g e n e c a t a l o g u e的物种注释信息,并结合基因丰度表,预测不同分类层级的物种丰度和物种注释信息;对g e n e c a t a l o g u e分别进行代谢通路(K y o t o E n c y c l o p e d i a o f G e n e s a n d G e n o m e s,K E G G数据库)、同源基因簇(E v o l u t i o n a r y G e n e a l-o g y o f G e n e s:N o n-s u p e r v i s e d O r t h o l o g o u s 9 第2期王晓凡等:虾蟹混养池塘中微生物群落结构及抗性基因G r o u p s,e g g NOG数据库)和碳水化合物酶(C a r b o-h y d r a t e-A c t i v e e n Z Ym e s D a t a b a s e,C A Z y数 据 库)的功能聚类分析;基于物种丰度表和功能丰度表,进 行 丰 度 聚 类 分 析、P C A和NMD S降 维 分 析、A n o s i m分析、样品聚类分析;分别对各个时期文库进行M e t a s t a t和L E f S e多元统计分析以及代谢通路比较分析,挖掘各个时期文库之间的物种组成和功能组成差异;利用g e n e c a t a l o g u e与抗生素抗性基因数据库C A R D(t h e C o m p r e h e n s i v e A n t i b i o t i c R e s i s t a n c e D a t a b a s e)进行注释,预测其抗性基因丰度分 布 情 况 以 及 抗 性 基 因 的 物 种 归 属 和 抗 性机制。2 结果与分析2.1 虾蟹混养池塘水质指标监测与评价在5月至1 1月期间,对江苏省南通市启东水产养殖基地两个不同种类三疣梭子蟹混养池塘水质进行监测发现:科甬混养塘中养殖周期内水温范围为(1 9.30.0 5 7)(3 1.60.3 0 5),盐度范围为(1 9.00.1 1 5)(2 6.10.1 3 3),p H范围为(7.3 30.0 1)(7.8 50.0 4 3),化学需氧量C O D范围为(7.3 10.0 0 3)(1 1.3 10.0 0 6)m g/L;普通混养塘中水温变化范围(1 7.9 70.0 8 8)(3 0.7 3 30.1 7 6),盐度变化范围1 9.00.0 1 1,p H的变化范围为(7.0 50.0 1 3)(7.4 10.0 0 7),化学需氧量C O D的变化范围为(7.7 70.0 1 5)(1 4.1 20.0 8 3)m g/L。混养池溏水环境中无机氮和无机磷质量浓度变化如图1所示。养殖期间(5月2日至1 0月2 8日之间),科甬混养塘水环境中无机氮质量浓度为(4.8 5 70.4 6 0)(2 0.1 4 90.7 6 8)m g/m L,无机磷质量浓度为(0.0 4 20.0 0 3)(1.4 0 10.0 7 9)m g/m L。普通混 养塘无机氮 质 量 浓 度 为(7 8.2 81.6 9)(5 4 1.1 5 21 3.8 7 8)m g/m L,无机磷质量浓度为(0.3 6 40.0 2 1)(2 9.3 9 50.7 6 7)m g/m L。普通混养塘中,在9月中旬即养殖高温期阶段,无机氮质量浓度显著升高且在1 0月末超出5 0 0 m g/m L标准(P0.0 5),但同期科甬混养塘中D I N显著下降(P0.0 5),并在1 0月末升高与59月无显著差异;9月中旬的普通混养塘中,无机磷质量浓度也表现出显著的升高趋势(P0.0 5),在科甬混养塘中,D I P呈现出先下降后升高再下降的趋势,养殖后期D I P与养殖初期无显著性差异。在虾蟹混养模式下,整个养殖过程中,除高温期的普通混养塘中无机氮质量浓度超过海水养殖标准,其余时间无机磷、无机氮的质量浓度均在标准之内。a b 图1 不同种类三疣梭子蟹-脊尾白虾混养池溏养殖早、中期无机氮和无机磷质量浓度的变化F i g.1 C h a n g e s o f i n o r g a n i c n i t r o g e n a n d i n o r g a n i c p h o s p h o r u s c o n t e n t i n c o m p r e h e n s i v e c u l t u r e p o n d s d u r i n g e a r l y a n d m i d d l e s t a g e o f d i f f e r e n t k i n d s o f P o r t u n u s t r i t u-b e r c u l a t u s a n d E x o p a l a e m o n c a r i n i c a u d a2.2 虾蟹混养池塘养殖环境M e t a基因组的基因预测及丰度分析通过韦恩图分别对科甬混养塘和普通混养塘养殖全周期内水体和底泥环境中基因数目分布情况进行分析(如图2所示)。结果表明:科甬混养塘养殖全 周 期 过 程 中 水 体 环 境 和 底 泥 共 表 达 基 因 约1 4 6.1 3万个,其中水体环境中表达基因9 3.5 0万个,底泥环境中表达基因4 9.5 7万个。科甬混养塘水体环境中总表达基因数量比底泥环境中多。普通混养塘中,在养殖全周期中共表达基因约1 3 3.4 2万个,其中水体环境中表达基因8 1.6 9万个,底泥环境中表达基因4 2.8 3万个,在养殖各时期水体环境中表达量均大于底泥环境中表达量。01江苏海洋大学学报(自然科学版)2 0 2 3年6月a 科甬混养塘 b 普通混养塘图2 不同种类三疣梭子蟹-脊尾白虾混养池溏养殖全周期环境M e t a基因组基因数目韦恩图分析F i g.2 V e n n d i a g r a m a n a l y s i s o f t h e n u m b e r o f M e t a g e n o m e g e n e s i n t h e w h o l e c y c l e o f c o m p r e h e n s i v e c u l t u r e p o n d s e n v i r o n m e n t o f d i f f e r e n t k i n d s o f P o r t u n u s t r i t u b e r c u l a t u s a n d E x o p a l a e m o n c a r i n i c a u d a2.3 虾蟹混养池塘养殖环境M e t a基因组的物种注释分析2.3.1 物种相对丰度分析 在科甬混养塘和普通混养塘整个养殖环境及养殖周期中,微生物多样性在门水平上,变形菌门(P r o t e o b a c t e r i a)作为优势菌群,占比最高,平均约为3 6.6%,其次为拟杆菌门(B a c t e r o i d e t e s),平均占比约为7.8%(如图3所示)。其余优势菌为:绿弯菌门(C h l o r o f l e x i)、浮霉菌门(P l a n c t o m y c e t e s)、放线菌门(A c t i n o b a c t e r i a)、蓝菌门(C y a n o b a c t e r i a)、疣微菌门(V e r r u c o m i c r o-b i a)、酸 杆 菌 门(A c i d o b a c t e r i a)、黏 胶 球 形 菌 门(L e n t i s p h a e r a e)、广古生菌门(I g n a v i b a c t e r i a e)。科甬混养塘和普通混养塘养殖环境中优势菌门水平组成基本相同,对于占比较多的优势菌群,在养殖全阶段中,养殖中期占比显著低于养殖初期和养殖后期,水体环境中占比显著低于底泥环境。图3 不同种类三疣梭子蟹-脊尾白虾混养池溏M e t a基因组基于门水平的相对丰度F i g.3 M e t a g e n o m e r e l a t i v e a b u n d a n c e a t p h y l a l e v e l i n c o m p r e h e n s i v e c u l t u r e p o n d s e n v i r o n m e n t o f d i f f e r e n t k i n d s o f P o r t u n u s t r i t u b e r c u l a t u s a n d E x o p a l a e m o n c a r i n i c a u d a2.3.2 组间差异物种的L E f S e分析 使用L E f S e对科甬混养塘、普通混养塘底泥样品3个养殖阶段进行组间比较分析,探查不同组底泥微生物群落在相对丰度上有显著差异的类群,结果如图4所示。通过L E f S e分析,科甬混养塘底泥样本中共有1 3个显著差异类群,其中养殖前期(K S 1)有5个,均为放线菌门A c t i n o b a c t e r i a(a v e r a g e L D A S C O R E=4.3 4,P=0.0 2 7 3),其中还有A c t i n o b a c t e r i a_b a c-11 第2期王晓凡等:虾蟹混养池塘中微生物群落结构及抗性基因t e r i u m_R B G_1 6_6 7_1 5菌(L D A S C O R E=4.2 7,P=0.0 3 9 0)和A c t i n o b a c t e r i a_b a c t e r i u m_R B G_1 6_6 8_2 1菌(L D A S C O R E=4.5 9,P=0.0 3 9 0);养殖中期(K S 2)有5个类群,分别是4类未定义的黏胶球 形 菌L e n t i s p h a e r a e(a v e r a g e L D A S C O R E=4.6 5,P=0.0 2 7 3),其中含有L e n t i s p h a e r a e_b a c t e-r i u m_R I F O X YA 1 2_F U L L_4 8_1 1菌(L D A S C O R E=4.0 1,P=0.0 2 7 3);养殖后期(K S 3)有3个类群,分别是放线菌目A c t i n o m y c e t a l e s(L D A S C O R E=4.0 6,P=0.0 2 7 3)、放 线 菌 科A c t i n o m y c e t a l e s(L D A S C O R E=4.0 7,P=0.0 3 9 0)和A c t i n o m y c e-t a l e s_b a c t e r i u m_TME D 1 1 5(L D A S C O R E=4.0 5,P=0.0 3 9 0)。在普通混养塘底泥样本中,共有4 1个显著差异的类群,其中养殖前期(C S 1)有2 2个,涵盖有W o e s e i a菌属(L D A S C O R E=5.6 1,P=0.0 2 7 3)、W o e s e i a o c e a n i菌(L D A S C O R E=5.6 1,P=0.0 2 7 3)、W o e s e i a c e a e菌科(L D A S C O R E=5.6 0,P=0.0 2 7 3)、丙 型 变 形 菌 纲G a mm a p r o-t e o b a c t e r i a(L D A S C O R E=5.2 0,P=0.0 2 7 3)和B o s e o n g i c o l a a e s t u a r i i菌(L D A S C O R E=4.7 4,P=0.0 3 9 0)等。在养殖中期(C S 2)有3个,分别为:R o b i g i n i t a l e a s p.O 4 5 8菌(L D A S C O R E=4.5 9,P=0.0 2 7 3)、P l a n k t o t h r i c o i d e s s p.S R 0 0 1(L D A S C O R E=4.3 9,P=0.0 2 7 3)、拟浮丝藻属P l a n k t o-t h r i c o i d e s(L D A S C O R E=4.3 7,P=0.0 2 7 3);在养殖后期(C S 3)有1 6个,涵盖绿湾藻纲C h l o r o f l e x i、放线菌目A c t i n o m y c e t a l e s、浮霉菌科P l a n c t o m y c e-t a c e a e、变形菌纲D e l t a p r o t e o b a c t e r i a、脱硫杆菌目D e s u l f o b a c t e r a l e s、特吕珀菌科T r u e p e r a c e a e和黏胶球 形 菌 目L e n t i s p h a e r a e,其 中 较 大 差 异 的 有P l a n c t o m y c e t a c e a e_b a c t e r i u m菌(L D A S C O R E=5.0 7,P=0.0 2 7 3)。a 科甬混养塘底泥样本L D A值分布图b 科甬混养塘底泥样本进化分支图图4 科甬混养塘底泥样本L D A值分布图和进化分支图F i g.4 L D A v a l u e d i s t r i b u t i o n a n d e v o l u t i o n a r y b r a n c h d i a g r a m o f s e d i m e n t s a m p l e s f r o m K e y o n g p o l y c u l t u r e p o r d s21江苏海洋大学学报(自然科学版)2 0 2 3年6月2.4 虾蟹混养池塘养殖环境M e t a基因组的功能分析2.4.1 基于功能丰度的样品聚类分析 如图5所示,在养殖全过程中,水体环境与底泥环境中功能丰度差异明显。水体环境样本中发现,养殖初期、中期、后期科甬混养塘与普通混养塘功能丰度相似性较高。底泥环境中发现,科甬混养塘与普通混养塘功能丰度因养殖种类不同,科甬混养塘养殖后期中的K S 3 3样本另为一个分支(不排除人为操作失误原因)。在普通塘底泥环境中,养殖后期中的C S 3 2样本与养殖初期中的样本聚在一起,养殖后期的C S 3 3样品与科甬混养